Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alpha-Viren sind von Mücken übertragene RNA-Viren, die anfällige Mückenzellen mit minimaler Zytopathologie persistent infizieren. Dieses Protokoll zeigt die Nützlichkeit von infektiösen Alpha-Virus-transduzierenden Systemen, die fluoreszierende Reporter exprimieren, zum Nachweis von Vektorinfektionen und Virusübertragungen. Füttern Sie zuerst weibliche Mücken mit einer Blutmahlzeit, die das gewünschte Alpha-Virus enthält, bestimmen Sie dann die Wirksamkeit der Mückeninfektion und wählen Sie nur Mücken aus, die das Markergen exprimieren.

Ernten Sie als Nächstes Speichel von den infizierten Mücken und demonstrieren Sie die Übertragbarkeit, indem Sie kultivierte Mückenzellen mit gesammeltem Speichel infizieren. Ergebnisse durch Epi-Fluoreszenzmikroskopie. Visualisieren Sie einen Bericht über Proteine wie GFP und verfolgen Sie so die Vektorinfektion und Virusübertragung durch Achtziger- oder QE-Arten von Mücken.

Alpha-Virus-Expressionssysteme (ATSs) können zur schnellen Beurteilung der Genexpression und der Vektormücken sowohl für Arbovirus-Studien als auch vor schwierigeren Mückenmanipulationen wie der Mückentransgenese verwendet werden. Diese Verfahren werden von Dr. Irma Sanchez Vargas, Dr. Eric Mosel und Aaron Phillips aus dem Labor von Dr. Ken Olson demonstriert. Um ein TS-Virus in Bhk 21-Zellen zu produzieren, verwenden Sie ein symbis rekombinantes Virus, das den GFP-Reporter nach einer In-vitro-Transkription exprimiert, und elektroraten Sie das genomische Alpha-Virus, das System-RNA in bhk 21-Zellen transduziert.

Retten und vermehren Sie dann das Virus vor der Infektion. Prim-Mücken für eine effiziente Blutfütterung aus einem künstlichen Futterautomaten durch Nahrungsentzug. Entfernen Sie Zucker 24 Stunden und Wasser 12 Stunden vor der Fütterung.

Gemischt mit kommerziell gewonnenem defibrilliertem oder citriertem tierischem Blut mit der aufbereiteten Zellkultur wird eine TS-Virus-Suspension zur effizienten Mitteldarminfektion der Mücken gewonnen. Formulieren Sie 10 bis sieben plaquebildende Einheiten pro Milliliter Virustiter für die Blutmahlzeit, um die Mücken zum Anschwellen anzuregen. Geben Sie ein TP bis zu einer Endkonzentration von 0,02 molaren hinzu.

Legen Sie ein Porenzeichen Darmmembran über die Öffnung des wasserummantelten Glasfutterautomaten. Richten Sie anschließend die Futterautomaten mit zirkulierendem 37 Grad Celsius heißem Wasser ein. Pipettieren Sie dann das Mehl in die Kammer und platzieren Sie die Futterautomaten sicher auf dem Karton.

Nachdem Sie die Mücken 10 bis 30 Minuten lang gefüttert haben, sortieren Sie die kälteanästhesieartigen Mücken nach den blutvollgestopften Proben, um die Replikation und Verbreitung eines TS-Virus in den ausgewählten Mücken zu ermöglichen. Inkubieren Sie sie acht bis 10 Tage lang bei 28 Grad Celsius und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit. Um die Mücken ruhig zu stellen.

Stellen Sie den Papierhaltekarton etwa 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf. Bringen Sie nun fünf bis 10 Mücken auf einen Kühltisch, der für die Verwendung an einem Fluoreszenzmikroskop geeignet ist. Untersuchen und sortieren Sie die Mücken nach Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz.

Geben Sie ausgewählte Mücken zur gewünschten Verwendung in den Papierkarton zurück. Bestimmen Sie an dieser Stelle die Infektionseffizienz anhand der Fluoreszenzintensität als Proxy. Zum Schluss präparieren Sie Gewebe wie den Mitteldarm, die SIV-Drüsen und die Fettkörper und überwachen Sie die Fluoreszenz.

Diese Organe und Gewebe können auf Wunsch auch zu früheren Zeitpunkten präpariert werden. Entziehen Sie den Mücken 24 Stunden vor der Fütterung die Zuckerquelle. Bereiten Sie ein 50-Mikroliter-Kapillarröhrchen vor, das mit drei bis fünf Mikrolitern Cargill erhitzt, gezogen und geschnitten wurde.

Immersionsöl vom Typ B, um sicherzustellen, dass die Mücken nicht entkommen. Entferne ihre Beine und Flügel. Führe nun die Rüssel in das Rohr ein.

Überwachen Sie sorgfältig die Speicheltröpfchen, die aus dem Rüssel in das Tauchöl austreten. Geben Sie bei Bedarf einen Tropfen 1%iges Pilocarpin auf den Brustkorb der Mücke, um den Speichelfluss nach 60 bis 90 Minuten zu erhöhen, entfernen Sie die Mücken und lagern Sie sie für eine zukünftige Virusisolierung. Um nun die Lösung aus dem Kapillarröhrchen zu gewinnen, stoßen Sie das Speichelölgemisch in ein Röhrchen mit 500 Mikrolitern sterilem 20%iger F-B-S-P-B-S aus.

Filtrieren Sie das Inokulum durch einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter und verwenden Sie dieses Inokulum dann, um kultivierte Zellen in Mückenzellen zu infizieren. Die Wirksamkeit einer Infektion mit fünf prime-DS MRE 16 GFP-Viren wird durch Expression von GFP bewertet. Im Laufe der Zeit wurden diese Zellen mit dem Virus bei einer Infektionsvielfalt von 0,01 infiziert.

Ein Epi-Fluoreszenzmikroskop ermöglicht die Ganzkörperansicht von GFP in der infizierten Mücke sowie in den verschiedenen Körperteilen hier 10 Tage nach der Infektion. Die organselektive Expression von GFP ist ein Hinweis auf eine disseminierte Infektion. Der Mitteldarm hat in der Regel früh nach der Einnahme einer virushaltigen Blutmahlzeit, die sich im hinteren Mitteldarm ausbreitet, früh nach der Infektion ausgeprägte Infektionsherde.

Diese Ereignisse werden von den Reportern von GFP und DS RED signalisiert. Der Transmissionsassay zeigt, dass fünf Prime DS MRE 16 GFP-Viren während der extrinsischen Inkubationszeit stabil GFP exprimieren. In der Mücke wird hier bereits acht Tage nach der Infektion GFP und Mückenspeichel nachgewiesen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein A-TS-Virus oral mit einer Mücke infiziert, wie man eine Virusinfektion bei einer Mücke visuell beurteilt und wie man die Virusübertragung von der Mücke beurteilt.