JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:40 Min. • August 29th, 2025
Beginnen Sie mit dem Ischiasnerv, der von einer Maus isoliert wurde.
Die Neuronen innerhalb des Nervs wurden transfiziert, um fluoreszierende zytoplasmatische Proteine zu exprimieren.
Der Nerv wurde gequetscht, um eine Verletzung herbeizuführen, die mit einer Naht markiert wurde.
Die verletzten Axonsegmente an der Stelle degenerieren und rekrutierte Makrophagen beseitigen die Trümmer.
Schwann-Zellen vermehren sich, um Leitbahnen zu bilden und neurotrophe Faktoren zu sezernieren, die das Nachwachsen von Axonen fördern. Die Axone erstrecken sich entlang dieser Bahnen und regenerieren den Nerv.
Fixieren Sie den Nerv, um die Zellstrukturen zu erhalten, und entfernen Sie dann alle anhaftenden nicht-neuronalen Gewebe.
Mit einem Puffer waschen, um Reste von Fixiermitteln zu entfernen.
Positionieren Sie den Nerv auf einem Objektträger, tragen Sie ein Eindeckmedium auf und platzieren Sie ein Deckglas.
Glätten Sie den Nerv, um die Axone für die Bildgebung in derselben Brennebene zu positionieren.
Verfolgen Sie mit einem Epifluoreszenzmikroskop die Axone von der Quetschstelle bis zu ihren distalen Enden, um
die Regenerationslänge zu messen.
Trennen Sie die DRGs zusammen mit den Nervenwurzeln und dem Ischiasnerv, vorsichtig mit einer Mikroschere und einer Mikrozange unter dem Dissektionsmikroskop
.Übertragen Sie dann den Ischiasnerv direkt in 4% PFA über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die fluoreszenzmarkierten sensorischen Axone unter dem Dissektionsmikroskop abzubilden und zu messen, entfernen Sie das anhaftende Gewebe und die Membran am fixierten Ischiasnerv vorsichtig mit einer Mikroschere und einer Mikrozange. Waschen Sie dann den Nerv dreimal mit PBS.
Legen Sie als nächstes den Ischiasnerv auf eine Folie und halten Sie sie gerade. Geben Sie 80 Mikroliter Anti-Fading-Lösung um den Nerv herum und legen Sie dann ein Deckglas darauf. Glätten Sie das gesamte montierte Gewebe mit Druck.
Legen Sie anschließend das abgeflachte Gewebe unter das inverse Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Zubehör für die Mosaikaufnahme und Bildverarbeitung ausgestattet ist. Bei der Messung der Länge der regenerierten Axone sind alle identifizierbaren fluoreszenzmarkierten Axone im Ischiasnerv von der Quetschstelle bis zu den distalen Axonenden zu verfolgen.