Eine Referenz Broth Mikrodilutionsverfahren für Dalbavancin In-vitro- Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien, die wachsen aerob

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die minimale Hemmkonzentration für Dalalbancin zu bestimmen. Dazu wird die Brühe-Mikroverdünnungsmethode mit Schwerpunkt auf den wichtigsten Schritten verwendet, die für Dalbavancin einzigartig sind. Die Stamm- und Zwischenverdünnung von Dalbavancin erfolgt in DMSO und die endgültige Verdünnung in Kation auf angepasster Müller-Hinton-Bouillon, die mit Polysorbat ergänzt wird.

Die Verdünnung wird in eine 96-Well-Platte abgegeben und mit einer standardisierten Bakteriensuspension beimpft. Die Platte wird dann 16 bis 24 Stunden lang inkubiert und untersucht, um die Mindestmenge an Dalbavancin zu bestimmen, die zur Hemmung des Bakterienwachstums erforderlich ist. Die Einhaltung dieser standardisierten Methode gewährleistet konsistente Ergebnisse sowohl mit klinischen Isolaten als auch mit Qualitätskontrollisolaten Dalbavancin ist ein halbsynthetisches antimikrobielles Lipoglykopeptid, das im Mai 2014 von der FDA für die Behandlung von akuten bakteriellen Haut- und Hautstrukturinfektionen, die durch grampositive Organismen verursacht werden, zugelassen wurde.

Dieses Verfahren beschreibt die standardisierte Brühe, Mikroverdünnungsempfindlichkeitsmethode für Dassin, die die Verwendung von DMSO zur Herstellung von Stammlösungen in Polysorbat 80 umfasst, um die Adhärenz des Mittels an plastischen Kunststoffen zu verringern. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist hilfreich. Da die Schritte zur Herstellung der Stamm- und MHK-Plattenlösung im Vergleich zu den meisten antimikrobiellen Mitteln nicht typisch sind. Diese Schritte sind einzigartig für Lipo-Glykopeptid-Wirkstoffe und müssen unbedingt befolgt werden, um reproduzierbare und genaue MHK-Ergebnisse zu erzielen.

Gina Fisher, eine Forscherin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Bitte beachten Sie, dass bei der Durchführung des folgenden Verfahrens geeignete Sicherheitsvorkehrungen gemäß Biosicherheitsstufe zwei getroffen werden sollten. Beginnen Sie mit dem Abwiegen der entsprechenden Menge Dalbavancin, um eine Stammlösung von 800 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.

Geben Sie die entsprechende Menge NEAT DMSO in ein steriles Glas- oder Kunststoffröhrchen, geben Sie das Pulver in das Röhrchen und wirbeln Sie es vortexen. Nächster. Unter Verwendung der DALBAVANCIN-Stammlösung von 800 Mikrogramm pro Milliliter werden 100 x MHK-Plattenkonzentrationen hergestellt, wie in den Spalten eins bis vier gezeigt. Diese werden als Zwischenkonzentrationen bezeichnet.

Das vorbereitete Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der MIC-Panels ab. Zum Schluss verdünnen Sie die Zwischenkonzentrationen um eins bis 100 in unangepasster Kationen-Mueller-Rückten-Brühe, auch bekannt als C-A-M-H-B, ergänzt mit 0,004 %P 80. Die resultierende Arbeitskonzentration von DALBAVANCIN und P 80 ist doppelt so hoch wie die Endkonzentration.

Da die Zugabe von Inokulum zu einer Ein- bis Zwei-Verdünnung unter Verwendung einer Mehrkanalpipette mit sterilen Spitzen führt, geben Sie 50 Mikroliter jeder Verdünnung von Dalbavancin in die entsprechenden Vertiefungen des sterilen 96-Well-Mikroverdünnungspanels. Das MIC-Plattenformat ermöglicht die Prüfung von acht Inokularen pro Platte. Wenn die Paneele nicht sofort verwendet werden, versiegeln Sie sie mit Plastikfolie, legen Sie sie dann in Plastiktüten und lagern Sie sie in einem nicht auftauenden Gefrierschrank bei mindestens minus 60 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

Bei dieser Demonstration wird eine frisch zubereitete Platte geimpft. Zur Vorbereitung des Inokulums wählen Sie mehrere gut isolierte Kolonien aus einer 18- bis 24-Stunden-Blutschnecke oder einer anderen nichtselektiven Schneckenplatte aus. Hier kommen Qualitätskontrollarien und EPHI-Hornhautstämme zum Einsatz.

Berühren Sie die Oberseite jeder Kolonie mit einem sterilen Tupfer und geben Sie einen Teil davon in ein Röhrchen, das ein bis fünf Milliliter C-A-M-H-B oder Kochsalzlösung enthält. Übertragen Sie weiter, bis die Trübung innerhalb von 15 bis 30 Minuten nach der Zubereitung einem McFarland-Standard von 0,5 entspricht, verdünnen Sie das Inokulum um eins auf 100 in C-A-M-H-B, um eine Endkonzentration von fünfmal 10 bis fünf KBE pro Milliliter zu erreichen. Der akzeptable Bereich liegt zwischen zwei und acht mal 10 bis fünf KBE pro Milliliter.

Übertragen Sie sofort mit einer Mehrkanalpipette mit sterilen Spitzen 50 Mikroliter des endgültigen Inokulums in jede geeignete Vertiefung der MIC-Plattenplatte. Vier Reihen werden mit jedem der beiden Isolate beimpft, so dass insgesamt vier Replikate pro Isolat vorliegen. Um als Nächstes eine Reinheitsprüfung durchzuführen, verwenden Sie eine Pipette, um ein bis 10 Mikroliter der Lösung in der positiven Wachstumskontrolle auf einen nicht-selektiven Agar zu übertragen, wie z. B. den Soja-Agar von Try Decay mit 5 % Schafsblut.

Verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um die Lösung auf der Oberfläche der Platte zu verteilen. Drehen Sie die Platte um 90 Grad und streichen Sie erneut, um sicherzustellen, dass das Inokulum gleichmäßig verteilt ist. Decken Sie den Teller ab und stellen Sie ihn beiseite.

Zur Vorbereitung einer Koloniezählung verwenden Sie eine Einkanalpipette, um 10 Mikroliter der Lösung in der Vertiefung der Wachstumskontrolle auf 10 Milliliter Kochsalzmischung zu übertragen, und geben Sie dann 100 Mikroliter in ein geeignetes nicht-selektives Agri-Medium, wie z. B. Toay-Soja-Agar mit 5 % Schafsblut unter Verwendung einer sterilen Schlaufe, und verteilen Sie die Lösung über die gesamte Agri-Oberfläche. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal in verschiedene Richtungen, um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu gewährleisten. Stapeln Sie anschließend bis zu vier MIC-Paneele in einem Kunststoffbehälter und stellen Sie sicher, dass die obere Platte mit einem Deckel dicht verschlossen ist.

Legen Sie dann ein feuchtes Papiertuch in den Plastikbehälter und verschließen Sie ihn innerhalb von 30 Minuten nach der Impfung sicher mit dem Deckel. Inkubieren Sie die MHK-Panels, die Koloniezählplatte und die Reinheitskontrollplatte in einem Umgebungsluftinkubator bei 35 plus oder minus zwei Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden. Am nächsten Tag wird die minimale Hemmkonzentration als die niedrigste Konzentration abgelesen, die das Bakterienwachstum in den Vertiefungen vollständig hemmt, wie sie mit bloßem Auge erkannt wird.

Bestimmen Sie die Anzahl der Völker auf dem Völkerzählplatten. Multiplizieren Sie die gezählte Zahl mit dem Verdünnungsfaktor. Zum Beispiel entspricht 50 Kolonien mal einem Verdünnungsfaktor von 10.000 fünf mal 10 bis zur fünften KBE pro Milliliter.

Ein akzeptabler Bereich liegt bei 20 bis 80 Kolonien, was zwei- bis achtmal 10 bis fünf koloniebildenden Einheiten pro ml entspricht. Die Konzentration des Inokulums ist eine wichtige Variable, um die Empfindlichkeitstests zu kontrollieren und genaue Ergebnisse zu erhalten. Überprüfen Sie abschließend die Reinheitsplatte.

Wenn alle Völker den als Inokulum verwendeten Völkern ähneln, kann es als rein angesehen werden. Wenn andere Kolonien vorhanden sind, besteht die Möglichkeit, dass sich eine Verunreinigung im MHK-Panel befindet, und der Test sollte wiederholt werden. Die Ergebnisse der MIC wurden mit denen verglichen, die mit der hier gezeigten Agri-Verdünnungsmethode erzielt wurden.

Die Agri-MIC-Ergebnisse für Dal Bevans sind in der Regel zwei- bis achtmal höher als die von Brühe. Mikroverdünnung, MHK-Ergebnisse. Dieser Gegensatz zu Vancomycin entsteht, die durch Brühe und Agri-Methoden hergestellt werden.

Daher wird die Agri-Verdünnung für die Prüfung von Dalbavancin-Dalbavancin-Brühe nicht empfohlen. Mikroverdünnungs-MHK, die Ergebnisse für die Qualitätskontrolle sollten innerhalb der erwarteten Bereiche liegen, wie hier gezeigt. Der SS-Qualitätskontrollorganismus, A TCC 2 9 2 1 3 mit einer sehr klaren modalen MHK von 0,06 Mikrogramm pro Milliliter, war ein guter Indikator für die Variation der Methode.

Liegen die erzielten Ergebnisse außerhalb der für die Qualitätskontrollorganismen erwarteten Bereiche oder tendieren sie zum unteren oder oberen Ende des Bereichs, ist eine weitere Validierung der Methode gerechtfertigt. Zusätzlich zur Validierung der Methode unter Verwendung von Qualitätskontrollorganismen, Dalbavancin, können MHK-Daten aus regionalen antimikrobiellen Überwachungsprogrammen eine Grundlage für MHK-Ergebnisse bilden, die in der klinischen Laborumgebung zu erwarten sind. Wie hier gezeigt, betrugen die Ergebnisse für Isolate, die in Europa und den USA in den Jahren 2011 bis 2013 gesammelt wurden, weniger als 0,25 Mikrogramm pro Milliliter für 99,9 % der SIUs und 100 % der Streptokokken. Basierend auf diesen Überwachungsdaten ist es offensichtlich, dass Dalbavancin-MHK-Ergebnisse für Staphylokokken und Streptokokken von mehr als 0,12 Mikrogramm pro Milliliter selten sind.

Wenn höhere Zahlen festgestellt werden, sollte der Test wiederholt und/oder zur Validierung an ein Referenzlabor geschickt werden. Die Vorbereitung der Stoffverdünnung in DMSO und die Zugabe von P 80 zur Bouillonverdünnung in einer Konzentration von 0,002 % in der abschließenden MHK-Vertiefung sind die entscheidenden Schritte, um genaue und reproduzierbare Dalbavancin-MHK-Ergebnisse zu erhalten. Wie immer, aber insbesondere in diesem Bereich der bakteriellen Resistenzentwicklung, sind genaue Ergebnisse der antimikrobiellen Empfindlichkeit entscheidend für die Wahl der geeigneten Therapie durch den Arzt.