Vorbereitung von Mausblasengewebe zur Visualisierung bakterieller Infektionen

Beginnen Sie mit einer eingeschläferten Maus mit freiliegender Blase, die vorab mit pathogenen Bakterien infiziert ist.

Die Bakterien dringen in das Urothel ein und bilden Kolonien. Nach der Reifung reißen diese Bakterien die Epithelzelle auf und infizieren die umliegenden Zellen.

Führe einen Katheter ein, der mit einer mit Fixativ gefüllten Spritze verbunden ist. Langsam das Fixativ einführen, um die Blase aufzublasen und ihre Architektur zu erhalten.

Klemmen Sie die Harnröhre ab, um das Fixativ zu erhalten und die Form der Blase zu erhalten.

Entfernen Sie den Katheter und schneiden Sie dann die Harnröhre durch. Umstellen Sie die Blase in ein frisches Fixationsmittel und inkubieren, um die Struktur zu erhalten.

Teile die Blase in zwei Halbblasenbecher, um das Urothel freizulegen, und spüle sie mit einem Puffer.

Beizen Sie mit einem metallbasierten Reagenz, um den Kontrast zu verbessern, und waschen Sie dann mit ultrareinem Wasser.

Die Abschnitte mit einem Ethanolgradienten dehydrieren, gefolgt von einer kritischen Punkttrocknung.

Schneiden Sie jede getrocknete Blasentasse in zwei Hälften.

Die Probe ist nun bereit für die nachgelagerte Verarbeitung, um die Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen zu visualisieren.

Nach einer Tuberkulin-Slipspitzenspritze mit Fixativ wird am Ende ein Katheter befestigt, wobei der Fasen entgegen den Spritzenmarkierungen zeigt.

Schneiden Sie den überschüssigen Schlauch 1 bis 2 Millimeter vom Nadelende ab und achten Sie darauf, die Nadelspitze nicht freizulegen. Schnippen Sie die Spritze, um Blasen zu entfernen, und drücken Sie den Pümpel, um Luft zu entleeren. Dann füllen Sie den Katheter mit einem Fixativ über einem Mikrozentrifugenrohr. Nach der Betäubung und dem Opfern der Maus, sobald die Beine gesichert sind, öffnen Sie den Beckenbereich mit einer Zange und einer chirurgischen Schere, um die Blase freizulegen. Schiebe vorsichtig das angrenzende Fett beiseite, aber lasse die Blase an Ort und Stelle.

Halte die Spritze mit der dominanten Hand und die Nadel nach unten gerichtet. Tauchen Sie die Katheterspitze in steriles Schmiermittel und positionieren Sie die Katheterspitze an der Harnröhrenöffnung, wobei Sie den Spritzenbehälter in einem 30- bis 45-Grad-Winkel über dem Mauskörper halten.

Üben Sie mit leichter Uhrzeigersinnsbewegung Druck nach unten aus und führen Sie den Katheter vorsichtig in die Harnröhre ein. Wenn die Katheterspitze eintritt, schwenkt man die Spritze zum Schwanz der Maus, während man den Katheter weiter in die Harnröhre schiebt, bis der Spritzenlauf parallel zur Arbeitsfläche ist. Der gesamte Katheternadelschaft sollte in die Maus eindringen und die Katheterspitze im Blasenlumen positionieren. Geben Sie langsam 50 bis 80 Mikroliter Fixativ ab, wodurch sich die Blase wie ein Ballon aufbläht.

Halte den Katheter an Ort und Stelle und hebe die Spritze leicht an, indem du die Spitze nach oben kippst. Mit der anderen Hand öffnen Sie einen Hämostat und schieben Sie einen Zinken unter die Katheternadel an der Schnittstelle der Harnröhre. Schließe den Hämostat teilweise, bis er gerade noch die Nadel berührt.

Schieben Sie die Katheternadel vorsichtig aus der Blase, während Sie gleichzeitig den Hämostat festklemmen und vollständig verriegeln, um den Verlust des Fixativs zu verhindern. Greifen Sie den Hämostat so, dass er parallel zur Arbeitsfläche ist und die Blase darauf ruht. Hebe vorsichtig an und schneide vorsichtig unter die Hämostat, um die Blase mit der noch befestigten Blase zu entfernen.

Führe die Blase ein und befestigte Hämostat in ein Falcon-Rohr mit erwärmtem Fixativ. Stellen Sie sicher, dass die Blase vollständig in der Flüssigkeit untergetaucht ist und nicht gegen die Wände des Schlauchs gedrückt wird.

Um die Blase mittels Rasterelektronenmikroskopie abzubilden, schneiden Sie sie mit einer sauberen, doppelseitigen Rasierklinge oder einem Skalpell sagittal in zwei Teile und machen Sie einen zweiten Schnitt, der tangential zum Hämostat ist, um die Blase zu lösen. Das führt zu zwei Halbblasen-Bechern. Falls noch Fettpolster außen an der Blase vorhanden sind, entfernen Sie sie vorsichtig.

Spülen Sie die Blase dreimal in der Natriumkakodylat-Pufferhälfte. Färben Sie das Gewebe mit 1 % Osmiumtetroxid in einem 0,15-molaren Kakodylsäurepuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Führen Sie diesen Schritt mit dem Färbegefäß in Folie durch, um eine dunkle Umgebung zu gewährleisten. Nach dem Verfärben spülen Sie die Blasenhälften dreimal in ultrareinem Wasser.

Wenn osmiertes Öl auf der Wasseroberfläche zu sehen ist, aspirieren oder wicken Sie es ab, um eine Verunreinigung während der Trocknungsphasen zu verhindern. Nach dem Trocknen des Gewebes werden die Blasenhälften mit einem sauberen, doppelseitigen Rasierer halbiert, sodass insgesamt vier Stücke entstehen.