Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Ligamentisierungsneigung von Proteinen, Transmembrandomänen oder T-MDs in einer natürlichen Membranumgebung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die interessierende Transmembrandomäne in E. coli als chimäres Protein mit Maltose-Bindungsprotein für die Lokalisation im Periplasma und Tox exprimiert wird. R als transkriptioneller Reporter führt die durch die Transmembrandomäne induzierte Ligamentisierung zu einer Dimerisierung von tox R und zur Aktivierung der LXi-Transkription. In einem zweiten Schritt werden die Zellen lysiert und mit ONPG behandelt, das durch Beta-Galacto zu den lichtabsorbierenden Spezies O Nitrophorat oder ONP hydrolysiert wird.

Die nächsten ONP-Niveaus werden quantifiziert, indem die Absorption von Licht bei 405 Nanometern gemessen wird. Um die Höhe der Transmembrandomäne zu bestimmen, zeigen die Ligamentisierungsergebnisse die Ligamentisierungsneigung der Transmembrandomänen auf der Grundlage eines toxen R-Reporterassays. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden biophysikalischen Methoden wie SDS-Seite oder Fluoreszenz besteht darin, dass das Verhalten der Transmembrandomäne in einer natürlichen Phospholipid-Doppelschicht durch Expression in E. coli untersucht wird und nicht in einem membranmimetischen System wie einem Detergens selbst.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Membranproteine zu beantworten, wie z.B. die Aufklärung wichtiger struktureller Merkmale, die an der Transmembran-Helix-Assoziation beteiligt sind. Vor dem Start dieses Protokolls werden Pocken sieben Plasmide, die das erforderliche chimäre Protein exprimieren, aus kommerziell synthetisierten Oligonukleotiden hergestellt, die das interessierende TDS darstellen, flankiert von NHE one und BMH one. Restriktionsstellen nach der Präparation von Plasmiden tauen fhk 12 kompetente Zellen auf Eis sanft auf. Nach dem Auftauen werden die Zellen in 15-Milliliter-Kulturröhrchen mit je 200 Nanogramm Plasma-DNA in ein separates Röhrchen überführt und die Zellen 30 Minuten lang auf Eis inkubiert.

Dann werden die Zellen 90 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius geschockt, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation auf Eis bei 800 Mikrolitern SOC-Medien und inkubieren die Proben bei 37 Grad Celsius unter einstündigem Schütteln nach der Inkubation werden fünf Milliliter chloramphenicolhaltige LB-Medien inokuliert und mit 50 Mikrolitern des Transformationsgemisches unter Verwendung von 15 Milliliter-Kulturröhrchen in dreifacher Ausfertigung für jede Probe behandelt. Zum Schluss werden die Proben bei 37 Grad Celsius unter 20-stündigem Schütteln inkubiert. Um die gesamte Ligamentisierung von TDS zu messen, wird die Beta-Galacto-Tase-Aktivität bestimmt.

Heizen Sie zunächst den Plattenleser auf 28 Grad Celsius vor. Verwenden Sie Z-Puffermaterial, um frische Z-Pufferlösungen herzustellen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Übertragen Sie Z-Puffer-Chloroform aus dem Rohr in das Reservoir und achten Sie darauf, dass nur die obere wässrige Schicht des Z-Puffer-Chloroform geleitet wird.

Legen Sie die 96-Well-Platte auf ein Blatt Papier mit einem gezeichneten Gitter, um ein genaues Pipettieren zu gewährleisten. Übertragen Sie 100 Mikroliter Z-Puffer-Chloroform in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, gefolgt von fünf Mikrolitern jeder Kultur im Quad. Duplizieren: Lassen Sie die Kultur in den vier Vertiefungen aus, die als Leerzeichen dienen sollen. Messen Sie den OD 5 95 der Platte, um die Zelldichte zu bestimmen.

Geben Sie 50 Mikroliter Z-Puffer SDS in alle Vertiefungen der Platte. Schütteln Sie dann die Platte im Plattenleser 10 Minuten lang, um die Zellen nach der Zelllyse bei 50 Mikrolitern ZPA für ONPG in alle Vertiefungen zu legen. Geben Sie die Platte wieder in den Tellerleser zurück und messen Sie OD 4 0 5 alle 30 Sekunden für 20 Minuten.

Bestimmen Sie das Niveau der Beta-Lacto-Sase-Aktivität durch eine Berechnung der Miller-Einheiten, die sich auf den Blindwert normalisieren. Western Blotting wird durchgeführt, um die äquivalente Proteinexpression zwischen den Konstrukten zu verifizieren. Kombinieren Sie zunächst 50 Mikroliter der dreifachen Kulturen und zentrifugieren Sie die Proben dann mit einer Mikrozentrifuge.

Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und Wiederbelebung. Suspendieren Sie das restliche Pellet in zwei x Probenladepuffer, laden Sie 7,5 Mikroliter jeder Probe auf ein Standard-8%-Gel und führen Sie eine Stunde und fünf Minuten nach dem Transfer eine Stunde und fünf Minuten lang eine Elektrophorese bei 125 Volt durch. Inkubieren Sie die Membran mit anti-M-V-P-H-R-P-P-konjugierten Antikörpern, um das chimäre Protein bei etwa 70 Kilodalton zu visualisieren, wobei einige Abbauprodukte manchmal bei etwa 48 Kilodalton beobachtet werden.

Endogener MVP wird auch bei 45 Kilodalton beobachtet. Um die korrekte Membraninsertion des chimären TMD-Konstrukts zu beurteilen, wird die Maltose-Bindungsprotein-defiziente PD-28-Zelllinie verwendet, wenn sie in minimalen Medien mit Maltose als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, und es können nur Zellen wachsen, die ein membranintegrales Expressionsprodukt mit einem Maltose-Bindungsprotein exprimieren, das korrekt im Periplasma lokalisiert ist. Transformieren Sie PD 28-Zellen wie für fhk 12-Zellen beschrieben und inokulieren Sie zwei Milliliter LB-Medium.

Züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 300 U/min über Nacht nach der Inkubation. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie sie mit Resus-Suspension in zwei Millilitern PBS und schonendem Pipettieren mit einer großen Spitze. Nach dem Pelletieren werden die Zellen erneut ein zweites Mal mit PBS gewaschen und anschließend eine abschließende Zentrifugation und Reanimationssuspension in einem Milliliter PBS durchgeführt.

Verwenden Sie 25 Mikroliter der resuspendierten Zellen, um fünf Milliliter minimales Medium zu beimpfen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie nach 15 Stunden. Übertragen Sie 200 Mikroliter jeder Probe in eine 96-Well-Platte und messen Sie den OD 5 9 5 mit dem Plattenlesegerät.

Wiederholen Sie diesen Vorgang alle zwei Stunden bis 25 Stunden. Die Ligamentisierungsneigung einzelner Transmembrandomänen aus dem latenten Membranprotein eins wurde mit dem tox R Transkriptionsreporter-Assay analysiert. Die Transmembrandomäne fünf zeigt eine starke Neigung zum Ligaanstieg, wie hohe Miller-Einheiten zeigen, was mit der gut etablierten dimerisierenden Sequenz der Positivkontrolle GPAA vergleichbar ist.

Eine schädliche Mutation in der Transmembrandomäne fünf D eins 50 A reduziert die Fähigkeit der Sequenz, alle Liga zu steigen LMP eins, TM eins steigt nicht signifikant alle Liga an und zeigt ein sehr niedriges Miller-Einheitssignal knapp über dem Signal für Blindzellen, bei denen es sich um nicht transformierte FHK 12-Zellen handelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie feststellen können, ob eine Transmembranhelix von Interesse in der Lage ist, in einer natürlichen Membranumgebung Komplexe höherer Ordnung zu bilden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, äußerst vorsichtig in die 96-Well-Platte zu pipettieren, um große Fehler zu vermeiden und sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeführt werden.