Name: Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Lernen Sie die Mosaikanalyse von Genfunktionen im postnatalen Mäusehirn mithilfe virusbasierter Cre-Rekombination. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Schaltkreise und der genetischen Regulation während der kritischen Entwicklungsphase.

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Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von RO1 NIH (NINDS) unterstützt.

1. Vorbereitung Viren zur Injektion <ol><li> rAAVs wurden von den empfohlenen kommerziellen Anbieter erworben, aber sie können auch in der eigenen Labor hergestellt werden (siehe Diskussion unten). Das Virus ist in der Regel bei einem Titer von ~ 1x10 12 Genom Kopien pro Milliliter (GC / ml) hergestellt und kann bei voller Titer verwendet werden, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren. Alternativ können sie verdünnt, um das gewünschte Maß an spärliche Beschriftung zu erzeugen. Die entsprechende Verdünnung muss vom Anwender bestimmt werden, aber eine 1:10-Verdünnung wird empfohlen, um zu starten. </li><li> Thaw Viren auf Eis unmittelbar vor dem Gebrauch. Übertragen Sie die gewünschten Vorverdünnung Volumen von Virus-Lösung in eine kleine (~ 250μl) PCR-Röhrchen. Verdünnen Sie die Virus-Lösung mit einem geeigneten Volumen sterilen DPBS in einer Gewebekultur Kapuze. Shop verdünnten Virus-Lösung auf Eis, bis es gebraucht wird. </li></ol> HINWEIS: Abwicklung aller Viren im Einklang mit einem Biosafety-Protokoll von Ihrer Einrichtung genehmigt durchgeführt werden 2. Spritze Be-und Gerätemontage <ol><li> Verbinden Sie den Laden Nadel auf das Glas Spritze und ziehen Sie den Virus-Lösung aus der PCR-Röhrchen durch leichtes Ziehen Sie den Kolben. Ziehen Sie den Kolben, bis eine sehr kleine Luftblase in der Spritze sehen kann, das zeigt, dass die gesamte Lösung in die Spritze ist und nicht in den Laden der Nadel. Alternativ kann auch eine kleine Menge des inerten Farbstoffs an der Lösung zugegeben werden, um sichtbar zu machen. HINWEIS: Eine kleine PCR-Röhrchen sollen die Be-Nadel wird in der Regel nicht lange genug, um den unteren Rand der meisten anderen Rohren zu erreichen verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie den Laden Nadel und legen Sie die Spritze auf die Spritze Block einer Spritzenpumpe, befestigen Sie sie mit der Spritze Halter. </li><li> Schieben Sie das eine Ende des Binde-Rohr in die Spritze, stecken Sie das andere Ende in den Nadelhalter. Legen Sie die Injektionsnadel in den Nadelhalter. Das Ende der Injektionsnadel sich direkt an das Ende der Binde-Rohr innerhalb des Nadelhalters. </li><li> Drücken Sie langsam den Kolben von Hand auf die Lösung durch die Binde-Rohr schieben. Drücken, bis ein kleiner Tropfen der Lösung sichtbar ist an der Spitze der Injektionsnadel. </li><li> Vorsichtig Position der Kolben neben dem Drücker-Block und sichern Sie ihn mit dem Schieber blockieren Halterung. </li><li> Setzen Sie die Injektion Parameter: Injektionsrate sollte etwa 8μl/min (~ 130nl / s) sein; Injektionsvolumen ist in der Regel 1-2UL; wählen Sie die entsprechende Spritze Durchmesser für die Spritze Größe, die Sie verwenden (siehe die Spritzenpumpe Handbuch für guidelines). </li><li> Stellen Sie die Kochplatte auf ~ 38 ° C und mit einem Papiertuch oder einem anderen dünnen Barriere für die Welpen während der Erholungsphase zu schützen. </li></ol> 3. Injektionsverfahren und pup Erholung <ol><li> Bereiten P0 oder P1 Maus Welpen zur Injektion, indem man sie kalt Anästhesie nach einem IACUC genehmigten Protokoll. Feuchten Sie ein paar Papiertücher mit Wasser und auf Eis stellen. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Jungtieren (4-5) auf dem Papiertuch (damit sie auch getrennt) und vorsichtig unter das Papier Handtücher über die Welpen, damit sie von feuchten Papiertuch abgedeckt sind. Gently Ort eine kleine Menge crushed ice auf der Oberseite des Papierhandtücher und inkubieren Sie die Welpen für ca. 5 Minuten. Die Welpen können auf Eis gehalten werden bis zu 15 Minuten und wieder fein danach. </li><li> Nach der Welpe ist ausreichend narkotisiert, stellen Sie es auf einem Montageblock (wir verwenden einen Styropor-Block, hält in der Regel 15ml Tuben) und positionieren Sie es für die besten Zugriff auf die Injektionsstelle. Für die Rinde ist es am einfachsten, das Tier platt auf dem Bauch lag, während für das Kleinhirn ist es hilfreich, den Welpen den Kopf über den Rand des Blocks der Lage, einen besseren Zugang zu den hinteren Teil des Schädels bieten. Der Welpe kann anstelle mit einem Band-Aid gesichert werden, falls gewünscht. </li><li> Halten Sie die Welpen den Kopf in ihn mit einer Hand, während die Nadel manuell durch den Schädel an der gewünschten Stelle mit der anderen Hand eingefügt. Es ist hilfreich, ziehen die Haut straff, um es von Bewegung während der Injektion zu verhindern. Für die Rinde ist es sinnvoll, die Injektionen in Bezug auf eine klar definierte anatomische Wahrzeichen, wie die Lambda-Naht des Schädels zu machen, wie dies auch in Zukunft Injektionen helfen werden. Das Kleinhirn kann durch den Schädel als ein dünner Streifen liegende Gewebe direkt kaudal des Colliculus gesehen werden. Die Tiefe, in der die Nadel eingeführt werden sollte variiert leicht zwischen den einzelnen Tieren und Stämme und kann durch vorher festgelegte Markierungen auf der Nadel gemessen werden, jedoch für Kortex und Kleinhirn finden wir, dass in einer Tiefe von ~ 0,5 - 1 mm von der Oberfläche in der Regel geeignet ist. Die Eintauchtiefe für andere Websites sollten experimentell durch den Endverbraucher bestimmt werden. HINWEIS: Die Nadel sollte leicht durchdringen den Schädel, wenn es nicht tut, NICHT zu hart, da dies das Tier verletzen kann. Positionieren Sie die Nadel und sanft wieder zu versuchen. </li><li> Spritzen Sie die Virus-Lösung. Die Injektion wird gestarteted durch Drücken der START-Taste an der Pumpe oder deprimierend ein Fußpedal, je nach dem Vorbild der Injektor verwendet. In Abwesenheit von einem Fußpedal ist es empfehlenswert, eine Kollegin mit Drücken der Taste zu helfen, unnötige Handbewegungen, dass die Injektion beeinflussen können minimiert werden. </li><li> Nach der gewählten Lautstärke injiziert wurde, halten Sie die Nadel im Ort für ein paar Sekunden und dann entfernen Sie vorsichtig die Nadel, indem Sie sie glatt. Achten Sie darauf, den Welpen den Kopf in Position zu halten, um überflüssige Bewegungen zu minimieren. Da die Injektion Ausrüstung gereinigt und zwischen den Experimenten mit Ethanol sterilisiert und die Wunde klein ist, ist die Verwendung von antiseptischen überflüssig. </li><li> Platzieren Sie den Welpen auf der überdachten Heizplatte mit der eingestellten Temperatur bei ~ 38 ° C zu erwärmen für Erholung, in der Regel 5-10 Minuten. Während dieser Zeit können Sie weiterhin Injektion anderen Welpen. </li><li> Nach all der Welpen erholt haben (sollten sie rosa und Bewegung) nehmen einen Teil der Wohnung Bettwäsche und sanft einmassieren die Welpen mit. Bringen Sie den Welpen der Mutter als eine Gruppe. </li></ol> HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die Welpen sind warm und ausgesetzt zu Hause Betten vor Rückgabe an die Mutter und sie als Gruppe zurückzukehren. Andernfalls kann die Mutter verletzen oder zu töten die Jungen führen. 4. Reinigung der Geräte <ol><li> Nach der Injektion abgeschlossen ist und die Welpen haben ihre Mutter zurückgegeben worden, reinigen Sie die Injektion Setup durch vollständig laden Sie die Spritze mit Aceton oder 70% Ethanol. Spülen Sie die Lösung durch die Injektion Setup mehrmals mit frischen Lösung jeder Zeit. Damit entfernen Sie alle verbleibenden Virus-Lösung und fällt aus. Das Aceton oder Ethanol wird dann verdampft. HINWEIS: Aceton ist für die Reinigung bevorzugt, aber wenn Ihr Setup nutzt jede Aceton-empfindlichen Bauteilen, wie Cyanacrylat-Klebstoffe, dann 70% Ethanol für diese Schritte. </li><li> Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit Bleichmittel und entsorgen Abfälle in einen geeigneten Behälter für biologischen. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Sacrifice die Tiere in der gewünschten Zeit mit einem IACUC genehmigt Euthanasie-Methode. Perfusionsfixierung wird empfohlen, in späteren Visualisierung der infizierten Nervenzellen, insbesondere bei erwachsenen Tieren zu helfen. </li><li> Standard-Immunfärbung Verfahren können verwendet werden, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken. Kurz gesagt, sind 100 pm schwimmenden Vibratom Abschnitte mit PBS +1% Triton X-100 permeabilisiert und blockiert in PBS +1% Triton X-100 +10% normalem Ziegenserum. Die Profile werden in Blocking-Lösung mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C, durch zusätzliche Wasch-und Blockierung gefolgt inkubiert. Abschnitte werden dann in Blocking-Lösung mit Sekundärantikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gründlich gewaschen, montiert auf Dias und eingedeckt mit anti-fade Montage Medien. Kryoschnitte kann auch verwendet werden, um markierten Neuronen sichtbar zu machen, aber die endogene Fluoreszenz verloren gehen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Eine erfolgreiche Injektionsverfahren wird robust Infektion von Neuronen im Bereich der Injektionsstelle ohne erkennbare Gewebeschädigung oder anderen negativen Auswirkungen auf das Tier zu erzeugen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, kann die Ausbreitung der Infektion in Cre-Reporter-Mäuse (ROSA26R) 12 mit rAAV8-Cre in verschiedenen anatomischen Stellen injiziert beobachtet werden. Injektionen in bestimmten Regionen, wie Rinde und Colliculus superior, erzeugen typischerweise lokale Infektionen mit minimaler Ausbreitung auf angrenzende Regionen (Abb. 1A-B). Die Nutzung des High-Titer-Virus-Lösung macht Infektion von benachbarten Gebieten, wie dem Hippocampus, desto wahrscheinlicher (Abb. 1A). Injection mit niedrigem Titer-Virus-Lösung führt zu spärlich Infektion, die in der Regel bleibt in der Nähe der Injektionsstelle, wie im Kleinhirn Injektion von rAAV8-Cre in der Mittellinie des ROSA26R Reporter-Mäuse (Abbildung 1C-D) gezeigt. Wir haben Rekombination in ROSA26R Reporter Mäusen innerhalb von 2 Tagen nach der Injektion von rAAV8-Cre, was darauf hindeutet, dass eine Infektion, Rekombination und Expression von Reporter-Gene lassen sich alle relativ schnell erfolgen. Darüber hinaus haben wir erfolgreich diese Technik verwendet, um die Auswirkungen von Gen-Deletion an einem nicht-ROSA Locus mit einem floxed bedingte Allel Studie werden die Ergebnisse, die an anderer Stelle veröffentlicht werden. Die Anzahl der Zellen infiziert sind, sollten mit dem Titer der injizierten viralen Lösung korrelieren. Zum Beispiel, Einspritzen einer Mischung aus hohen Titer Lösungen aus zwei rAAV8 Viren, die verschiedene fluoreszierende Proteine ​​in das Kleinhirn befällt viele Purkinjezellen, die unterschiedlich beschriftet sind (Abb. 2A). Umgekehrt kann Einspritzen einer geringen Titer-Virus-Lösung in spärlich Infektion bei der Visualisierung einzelner Zellen (Abb. 2B) Beihilfen führen. Fluoreszenzmarkierten Neuronen können direkt in frischen Schnittblumen, lebendes Gewebe (Abb. 2B) beobachtet werden können oder zu Immunfärbung auf die endogene Fluoreszenz-Signale für die spätere Bildaufnahme von wide-field oder Co zu verbessern unterzogen werdennfocal Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 2A, Abb.. 3A-C). Schließlich ist rAAV8 infizieren kann eine Vielzahl von Neuronen-Typen in der Hirnrinde mit starken Kennzeichnung von feinen Prozesse (Abb. 3A-C). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: LacZ Färbung im Gehirn von ROSA26R Reporter Mäusen, die mit rAAV8-Cre bei P0 injiziert wurden demonstriert Cre-Aktivität und die Lage der Infektion. <ol type="A"><li> Weitwinkel-sagittal Ansicht eines P14 Gehirn, die hohe Titer (1x10 12 GC / ml) Injektionen in Kortex und Colliculus superior. Der Einsatz von High-Titer-Virus macht es wahrscheinlicher, dass benachbarte Bereiche auch infiziert werden. </li><li> Sagittalschnitt P14 Kortex mit niedrigeren Titer (1x10 11 GC / ml) injiziert Virus zeigt eine lokale Infektion mit weniger verbreitet. </li><li> Ein wholemount Ansicht eines P28 Kleinhirn an der Mittellinie mit niedrigen Titer (1x10 9 GC / ml)-Virus-Lösung injiziert zeigt, dass die Infektion spärlich ist und bleibt typischerweise in der Nähe der Injektionsstelle. </li><li> Sagittal Ansicht der Mittellinie des Kleinhirns in C). Beachten Sie, dass in der Regel nur Purkinje Zellen durch rAAV8 infiziert sind. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Kleinhirn Kennzeichnung durch Injektion mit hohem und niedrigem Titer von rAAV8 Ausdruck fluoreszierende Proteine. <ol type="A"><li> Ein Sagittalschnitt der P21cerebellum mit einer Mischung aus beiden Viren Ausdruck EGFP (grün) und DsRed (rot) infiziert. Ein hoher Titer Mischung von Viren verwendet wurde, um eine große Anzahl von Purkinje-Zellen zu infizieren. </li><li> Eine Purkinje-Zelle in Live-P14 Kleinhirn von einem sehr niedrigen Titer Virusinfektion abgebildet sofort nach der Sektion. </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Kortikale Kennzeichnung von rAAV8-DsRed. Beispiele für die Vielfalt der kortikalen Neuronen-Typen in der koronalen Abschnitte eines P21 Kortex, um P0 rAAV8-DsRed infiziert war.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Neugeborenen-viralen Injektion hier vorgestellte Methode bietet einen einfachen und schnellen Weg, um in vivo Mosaiken für das Studium der postnatalen Entwicklung des Gehirns zu erzeugen. Die Methode nutzt floxed Allele, die derzeit verfügbar sind sowie diejenigen, die über den High-Throughput-Gene Targeting Projekt 6 vorgenommen werden. Verglichen mit dem Einsatz von transgenen Expression von Cre, bietet diese Methode einen schnellen Weg, um Genfunktionen in verschiedenen Zelltypen Test, wie Mäu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre,-GFP, DsRed-, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, kundenspezifischen Auftrag </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pump 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (Keine Fußpedal-Port) </td></tr><tr><td> Retinalen Pigmentepithels Injection Kit </td><td> World Precision Instruments </td><td> RPE-KIT </td><td> Enthält Binde-Schläuche, Kanülen (36G) und Nadelhalter </td></tr><tr><td> Nanofil Spritze, 100 &amp;mgr; </td><td> World Precision Instruments </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Beinhaltet wiederverwendbare loading Nadel </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP-Antikörper </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed antibody </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R Maus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analyse der genfunktion in postnatale mäusehirnen mithilfe von virus-basierten cre rekombination

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normale Funktion des Gehirns beruht nicht nur auf der Embryonalentwicklung, wenn wichtige Nervenbahnen etabliert sind, sondern auch auf die postnatale Entwicklung bei neuronalen Schaltkreisen gereift und verfeinert. Fehlregulation in diesem Stadium können zu neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie 1,2 führen. Viele Gene sind in der pränatalen Gehirn untersucht und festgestellt, von entscheidender Bedeutung für viele Entwicklungsprozesse 3-5. Allerdings ist ihre Funktion in der postnatalen Gehirn weitgehend unbekannt, teils weil ihre Deletion in Mäusen führt oft zu Letalität bei Neugeborenen Entwicklung, teils weil ihre Forderung in der frühen Entwicklung behindert die postnatale Analyse. Um diese Hindernisse zu überwinden, sind floxed Allele dieser Gene derzeit in Mäusen 6 erzeugt. Wenn mit transgenen Allele, die ausdrückliche Cre-Rekombinase in bestimmten Zelltypen, bedingte Löschung erreicht werden, um Genfunktionen in der postnatalen Gehirn studieren können kombiniert werden. Allerdings erfordert diese Methode zusätzliche Allele und zusätzliche Zeit (3-6 Monate), um die Mäuse mit den entsprechenden Genotypen zu erzeugen, wodurch die Expansion der genetischen Analyse, um im großen Maßstab im Gehirn der Maus. Hier zeigen wir einen komplementären Ansatz, dass viral-Ausdruck Cre verwendet, um diese floxed Allele schnell und systematisch zu untersuchen in der postnatalen Entwicklung des Gehirns. Durch Einspritzen von rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAVs) 7,8 Kodierung Cre in der neonatalen Gehirn, sind wir in der Lage, das Gen von Interesse in verschiedenen Regionen des Gehirns zu löschen. Durch die Steuerung der virale Titer und Koexpression ein fluoreszierendes Protein-Marker, können wir gleichzeitig zu erreichen Mosaik Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Kennzeichnung. Diese Methode umgeht die Forderung vieler Gene in der frühen Entwicklung, und erlaubt uns, ihre Zelle selbst eine autonome Funktion in vielen kritischen Prozesse in der postnatalen Entwicklung des Gehirns, einschließlich axonalen und dendritischen Wachstums-Studie, Verzweigungen und Fliesen, sowie Synapsenbildung und Raffinesse. Diese Methode wurde bereits erfolgreich in unserem eigenen Labor (unveröffentlichte Ergebnisse) und andere 8,9 verwendet, und kann auch auf andere Viren, wie Lentivirus 9, sowie die Expression von shRNA oder dominant aktive Proteine ​​10 verlängert werden. Darüber hinaus durch die Kombination dieser Technik mit der Elektrophysiologie sowie kürzlich entwickelten optischen Imaging-Tools 11, bietet diese Methode eine neue Strategie zu untersuchen, wie genetische Signalwege neuronalen Schaltkreis Entwicklung und Funktion in Mäusen und Ratten beeinflussen.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Methode, um Genfunktionen in postnatalen Gehirn-Test beschrieben. Rekombinante AAV Ausdruck Cre und / oder ein fluoreszierendes Protein werden in neonatalen Gehirn der Maus injiziert. Mosaic Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Markierung erreicht, die eine schnelle Analyse der Genfunktion in kritischen Prozesse auf neuronale Schaltkreis Entwicklung.

Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Die normale Gehirnfunktion beruht nicht nur auf der embryonalen Entwicklung, in der die wichtigsten neuronalen Bahnen etabliert werden, sondern auch auf der postnatalen Entwicklung, in der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion während der postnatalen Phase der Gehirnentwicklung zu beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeigneten Viren ausgewählt und vorbereitet, in die Spritze gefüllt und die Injektionsausrüstung vorbereitet werden. Anschließend werden die Viren in die Gehirne neugeborener Mäusewelpen injiziert, und der letzte Schritt besteht darin, die Tiere zu töten und die injizierten Bereiche abzubilden.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine differenzielle Markierung von Kontroll- und Knockout-Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise wie die Phase der postnatalen Entwicklung genetisch reguliert ist. Für die Injektion kann eine kommerziell erhältliche Lösung eines adeno-assoziierten Virus in voller Titer verwendet werden, typischerweise 10 zur 12. Genomkopien pro Milliliter, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren.Wenn eine geringe Dichte oder Markierung gewünscht ist, beginnen Sie mit einer Verdünnung von 1 zu 10. Nach dem Auftauen des Virus auf Eis überführen Sie sofort das

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Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Hier demonstrieren wir eine Technik zur weit verbreiteten neuronalen Transduktion durch intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das neonatale Mausgehirn.  Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, eine lebenslange Expression von viral transportierten Transgenen zu erreichen.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung...

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Es wird ein Protokoll zur Verfolgung und funktionellen genetischen Analyse von Kandidatengenen auf Einzelzellebene mithilfe von Mosaikanalysen mit Doppelmarkern (MADM) vorgestellt. Die CLonale MADM-Analyse bietet einen quantitativen Rahmen, um das proliferative Verhalten, die zelluläre Leistung und die Abstammungsbeziehung einzelner Vorfahren und ihrer Tochterzellen zu messen.

Lineage Tracing und Clonal Analysis bei der Entwicklung von Zerebralparese mit Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM)

Die Rolle der kürzlich entdeckten krankheitsassoziierten Gene bei der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen bleibt unklar. Eine modifizierte bilaterale in utero Elektroporation Technik ermöglicht den Gentransfer in großen Populationen von Neuronen und Untersuchung der ursächlichen Auswirkungen von Genexpressionsänderungen auf das Sozialverhalten.

Eine Pipeline mit bilateraler Utero-Elektroporation zur Vernehmung genetischer Einflüsse auf das Nagetierverhalten

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie die Mosaikanalyse von Genfunktionen im postnatalen Mäusehirn mithilfe virusbasierter Cre-Rekombination. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Schaltkreise und der genetischen Regulation während der kritischen Entwicklungsphase.

Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

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