Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genfunktion während der postnatalen Phase der Gehirnentwicklung zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die entsprechenden Viren ausgewählt und vorbereitet, in die Spritze geladen und das Injektionsgerät vorbereitet werden. Dann wird das Virus in die Gehirne neugeborener Mauswelpen injiziert, und der letzte Schritt besteht darin, die Tiere zu opfern und die injizierten Regionen abzubilden.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine differentielle Markierung von Kontroll- und Knockout-Zellen durch Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie die Zeit der postnatalen Entwicklung genetisch reguliert wird. Zur Injektion kann eine kommerziell erhältliche Adeno-assoziierte Viruslösung bei vollem Titer, typischerweise 10 bis 12 Genomkopien pro Milliliter, verwendet werden, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren.

Wenn eine dünne Färbung oder Markierung gewünscht wird, beginnen Sie mit einer Verdünnung von eins bis 10. Nachdem Sie das Virus auf Eis aufgetaut haben, übertragen Sie das Vorverdünnungsvolumen sofort in ein steriles 250-Mikroliter-PCR-Röhrchen. Bewahren Sie die Verdünnung auf Eis auf. Jetzt.

Bereiten Sie die Injektionspumpe vor, indem Sie eine geeignete Spritze auswählen und an eine Ladenadel anschließen. Ziehen Sie anschließend die Viruslösung vorsichtig auf, bis eine sehr kleine Luftblase in der Spritze zu sehen ist, und verwenden Sie möglicherweise einen inerten Ladefarbstoff, um diesen Schritt zu erleichtern. Befestigen Sie nun die Spritze mit einer Halterung an der Pumpe.

Befestigen Sie dann vorsichtig einen Verbindungsschlauch zwischen der Spritze und dem Nadelhalter. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsnadel in direktem Kontakt mit dem Verbindungsschlauch im Inneren des Nadelhalters steht. Bewege nun die Lösung langsam durch den Verbindungsschlauch, bis ein winziger Tropfen Lösung an der Spitze der Nadel sichtbar ist.

Befestigen Sie den Kolben vorsichtig neben dem Schubblock mit einer Halterung an der Pumpe. Stellen Sie die Injektionsrate auf acht Mikroliter pro Minute und das Injektionsvolumen auf ein bis zwei Mikroliter ein. Passen Sie dann die Einstellung für den Spritzendurchmesser der Pumpe an den Durchmesser der von Ihnen verwendeten Spritze an.

Um die Welpen während der Erholungsphase zu schützen, stellen Sie die Heizplatte auf 38 Grad Celsius ein und decken Sie sie mit einem Papiertuch ab. Bereiten Sie P zero oder P one Mauswelpen unter Verwendung eines von der IACUC zugelassenen Protokolls für die Injektion vor, indem Sie sie einer Kältenarkose unterziehen. Befeuchten Sie ein paar Papiertücher mit Wasser und legen Sie sie auf Eis.

Lege dann vier oder fünf Welpen gut getrennt auf das Papiertuch. Falten Sie die Papiertücher über die Welpen, geben Sie vorsichtig eine kleine Menge zerstoßenes Eis auf die Papiertücher und inkubieren Sie die Welpen etwa fünf Minuten lang. Die Welpen können bis zu 15 Minuten sicher auf Eis gehalten werden und erholen sich trotzdem gut.

Positionieren Sie nun einen betäubten Welpen auf einem Montageblock, um den besten Zugang zur Injektionsstelle zu erhalten. Die Hirnrinde zum Beispiel ist am einfachsten zugänglich, indem man das Tier flach auf den Bauch legt. Der Welpe kann mit einem Pflaster an Ort und Stelle fixiert werden, den Kopf des Welpen manuell stabilisieren und die Haut festziehen, damit er sich nicht bewegt.

Navigieren Sie dann durch anatomische Orientierungspunkte des Schädels wie die Lambda-Naht, wählen Sie mit der anderen Hand einen reproduzierbaren Injektionspunkt aus und führen Sie die Nadel vorsichtig durch den Schädel ein. Drücken Sie nicht fest, wenn die Nadel nicht leicht in den Schädel eindringt. Positionieren Sie stattdessen die Nadel neu und versuchen Sie es vorsichtig erneut.

Die Injektionstiefe variiert leicht zwischen den einzelnen Tieren und den Stämmen für die Hirnrinde, ein halber bis ein Millimeter Tiefe reicht in der Regel aus. Injizieren Sie nun die Viruslösung, indem Sie einen Kollegen die Pumpe aktivieren lassen, um Handbewegungen zu minimieren. Im Idealfall kann ein Fußpedal verwendet werden, um die Pumpe nach der Injektion zu starten.

Halten Sie die Nadel einige Sekunden lang an Ort und Stelle und halten Sie dann den Kopf des Welpen ruhig. Schieben Sie die Nadel heraus. Lassen Sie den Welpen nun fünf bis 10 Minuten auf der abgedeckten Herdplatte ruhen.

Setzen Sie während dieser Zeit die Injektion anderer Welpen fort. Wenn die Welpen alle ihre rosa Farbe wiedergefunden haben und sich alle bewegen, reiben Sie sie vorsichtig mit einem Teil ihrer heimischen Einstreu ein. Erst dann können sie zu ihrer Mutter zurückgebracht werden.

Andernfalls könnten sie wie unbekannte Welpen behandelt werden, die die Mutter höchstwahrscheinlich töten würde, nachdem die Welpen zu ihrer Mutter zurückgebracht wurden. Reinigen Sie die Injektionsanlage, indem Sie die Spritze vollständig mit Aceton oder 70 % Ethanol befüllen. Wenn acetonempfindliche Komponenten wie Sano, Acurate und Klebstoffe verwendet werden, spülen Sie die Lösung mehrmals mit frischer Lösung durch die Injektionsanlage.

Dadurch wird die restliche Viruslösung entfernt und die Ausfällungen der Lösungsmittel verdunsten. Desinfizieren Sie nach dem Ausspülen des Setups den Arbeitsbereich des Bleichemittels, um es für den nächsten Experimentator bereit zu halten. Mentor. Eine erfolgreiche Technik führt zu einer robusten neuronalen Infektion an der Injektionsstelle.

Injektionen in bestimmte Regionen wie den Kortex und den Colliculus superior führen in der Regel zu lokalen Infektionen mit minimaler Ausbreitung auf benachbarte Regionen. Die Verwendung einer Viruslösung mit hohem Titer macht eine Infektion benachbarter Bereiche wie des Hippocampus wahrscheinlicher, die Injektion mit einer Viruslösung mit niedrigem Titer ist wahrscheinlich. Führt zu einer spärlichen Infektion, die typischerweise in der Nähe der Injektionsstelle wie der Kleinhirninjektion an der Mittellinie führt, sollte die Anzahl der infizierten Zellen mit einem Titer der injizierten Viruslösung korrelieren.

Zum Beispiel infiziert die Injektion einer Mischung aus Hochtiterlösungen von zwei R AAV 8-Viren, die unterschiedliche fluoreszierende Proteine exprimieren, in das Kleinhirn viele Kinji-Zellen, die unterschiedlich markiert sind. Umgekehrt kann die Injektion einer Viruslösung mit niedrigem Titer zu einer spärlichen Infektion führen, um die Visualisierung einzelner Zellen zu erleichtern. Fluoreszenzmarkierte Neuronen können direkt in frisch geschnittenem lebendem Gewebe beobachtet oder einer Immunfärbung unterzogen werden.

Dadurch werden die endogenen Fluoreszenzsignale für die spätere Bildaufnahme durch Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie verstärkt. Schließlich ist RAAV eight in der Lage, eine Vielzahl von Neuronentypen im Kortex mit starker Markierung feiner Prozesse zu infizieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.