Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-
14. August 2011
Testen Protein-Protein-Interaktion ist für die Präparation von Protein-Funktionalität unverzichtbar. Hier stellen wir eine In-vitro- Protein-Protein-Bindungs-Assay auf eine Membran-immobilisierten Protein mit ein lösliches Protein-Sonde. Dieser Test liefert eine zuverlässige Methode, um die Interaktion zwischen einem unlöslichen Protein und ein Protein in Lösung zu testen.
Protein testen. Die Proteininteraktion ist für die Analyse der Proteinfunktionalität unerlässlich. In diesem Video wird ein in vitro Proteinprotein-Bindungsassay vorgestellt, um die Wechselwirkung zwischen einer Membran und einem immobilisierten Protein mit einem löslichen Protein zu testen.
Zunächst werden Fusionsproteine kloniert, exprimiert und extrahiert. Das markierte unlösliche Protein wird auf der Nitrozellulosemembran immobilisiert und so behandelt, dass es bis zu seiner nativen Bestätigung wieder gefaltet wird. Die Membran wird dann mit markierten löslichen Proteinen untersucht und Immunblotting durchgeführt, um die Proteine nachzuweisen.
Wenn die markierten Proteine interagieren, werden sie von dem auf der Membran immobilisierten Protein eingefangen, und das Signal des Immunblottings wird beobachtet. Somit bietet dieser Assay eine zuverlässige Methode, um die Wechselwirkung zwischen einem unlöslichen Protein und einem Protein in Lösung zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Gefäßen wie dem GST-Pulldown besteht darin, dass Sie die Bindung zwischen unlöslichem Protein und löslichem Protein in vitro zuverlässig beurteilen können.
Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, genetisch markierte Proteine für den Nachweis zu erzeugen. Beginnen Sie mit der Klonierung des Proteins, das auf der Membran immobilisiert wird. Beziehen Sie sich hier auf pro Im für immobilisiertes Protein in einen Expressionsvektor, der für ein großes Tag kodiert, wie z. B. GST, den leeren Expressionsvektor, der nur für den Tag kodiert, wird als Negativkontrolle für immobilisiertes Protein verwendet und wird als pro IM nc bezeichnet.
Klonieren Sie als Nächstes das Protein, das als lösliche Sonde verwendet wird, in einen Expressionsvektor, der für eine andere Markierung kodiert, z. B. Streptokokken zwei. Dies wird als Prosol für lösliches Protein als Negativkontrolle, Klon, ein Negativkontroll-lösliches Protein in denselben Expressionsvektor bezeichnet. Dies wird als Prosol NC für die Negativkontrolle löslicher Proteine bezeichnet.
Verwenden Sie als Nächstes ein Proteinexpressionssystem, wie z. B. ein Coli- oder Balovirus, um die markierten Proteine zu exprimieren. Das verwendete Expressionssystem sollte sorgfältig ausgewählt werden, basierend auf dem Bedarf an posttranslationalen Modifikationen. Extrahieren Sie die exprimierten Proteine aus dem Organismus Ihrer Wahl. Für pro IM und pro I mnc Resus.
Suspendieren Sie die Zellen in einem SDS-Seitenladepuffer, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail enthält. Dann kochen Sie die Zellen fünf Minuten lang und zentrifugieren Sie sie, um den Niederschlag zu entfernen, um Prosol und Prosol NC zu extrahieren. Verwenden Sie Standardverfahren. Das pro IMS kann unter denaturierenden Bedingungen extrahiert werden, da die Proteine nach der Immobilisierung in der Nitrozellulosemembran wieder gefaltet werden.
Prosol sollte jedoch extrahiert werden, um eine native Bestätigung zu erhalten, da sie dem Bindungspuffer zugesetzt werden, sobald die markierten Proteine extrahiert wurden. Bestimmen Sie die Konzentration der rekombinanten Proteine mit einer Standardmethode wie dem BioRad Protein Assay Kit. Wenn für den Assay Rohextrakt anstelle von gereinigtem Protein verwendet wird.
Schätzen Sie die Konzentration des interessierenden Proteins durch Rasterdensitometrie der entsprechenden Bande auf einem Kumasi-gefärbten SDS-Polyacrylamid-Gel. Unter Verwendung bekannter BSA-Konzentrationen als Referenz. Dann zeichnen Sie die Standardkurve basierend auf den Signalintensitäten, die mit der Rasterdensitometrie des BSA gemessen wurden, und berechnen Sie die Menge an Protein, die im Rohextrakt enthalten ist.
Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, pro Iam und pro IAM NC auf der Membran zu immobilisieren. Beginnen Sie damit, je ein Mikrogramm pro Iam und pro IAM NC Extrakte in doppelter Ausführung auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel zu laden. Nach der Elektrophorese nehmen Sie das Gel von den Glasplatten und legen es in 100 Milliliter Transferpuffer, dann inkubieren Sie es unter leichtem Rühren für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Führen Sie nach der Inkubation einen Western Blot durch, um die Proteine nach dem Transfer auf eine Nitrozellulosemembran zu übertragen, damit sich die membrangebundenen Proteine wieder falten können. Legen Sie die Membran in 15 Milliliter Puffer A und inkubieren Sie sie unter leichtem Rühren. Um SDS-Reste zu entfernen, 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig die Membran aus dem Puffer. Legen Sie dann die Membran in 25 Milliliter Denaturierungspuffer. Zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
Während der Inkubation wird die Nitrozellulosemembran undurchsichtig. Übertragen Sie dann die Membran mit einer Pinzette auf 25 Milliliter TBS und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang unter sanftem Rühren. Während dieses Schritts kehrt die Membran zu ihrer ursprünglichen weißen Farbe zurück.
Übertragen Sie anschließend die Membran auf 25 Milliliter Bindungspuffer. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren über Nacht. Als nächstes wird das lösliche Protein verwendet, um die Membran nach dem immobilisierten Protein zu untersuchen.
Zuerst bereiten Sie die Hybridisierungspuffer vor, verdünnen Sie ein bis 10 Mikrogramm Prosol und Prosol NC in getrennten Röhrchen mit 10 Millilitern frischem Bindungspuffer. Übertragen Sie dann den Puffer in einen Hybridisierungsbeutel. Schneiden Sie anschließend die Membran in zwei Streifen, die beide pro IM und pro IAM nc enthalten.
Diese Membranen werden in den Hybridisierungspuffer gelegt. Jede Membran in die Hybridisierungslösung prosol oder prosol NC überführen und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren. Entfernen Sie die Membranen aus den Hybridisierungslösungen und spülen Sie dreimal 15 Minuten lang in TBS.
Um Protein-Protein-Wechselwirkungen sichtbar zu machen, blockieren Sie die Membran eine Stunde lang mit 2,5 % Magermilch in TBST. Nach der Inkubation legen Sie die blockierten Membranen in die primäre Antikörperlösung. Hier wird der polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen Streptokokken verwendet.
Nachder Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren. Spülen Sie die Membranen 15 Minuten lang in 20 Millilitern TBST und zweimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Als nächstes platzieren Sie die Membranen in der HRP-konjugierten Sekundärantikörperlösung. Hier wird ein Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper verwendet, der an HRP konjugiert ist.
Eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren. Spülen Sie die Membranen in 20 Millilitern TBST für 15 Minuten und zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Rühren wie zuvor, nach dem abschließenden Spülen in TBS visualisieren Sie die Protein-Protein-Wechselwirkung mit einem HRP-chemilumineszierenden Substrat Hier Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.
HRP-Substrat wird nach dem Immunblotting des Prosols verwendet. Spülen Sie die Membran und TBST 15 Minuten lang und zweimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Sondieren Sie dann die Membranen erneut mit dem primären Antikörper, damit der Tag prociert wird.
Es folgt der passende Sekundärantikörper. Visualisieren Sie PRO I und pro Im NNC durch den Nachweis von Chemilumineszenz, um die Identität der im Proteinmembran-Overlay-Assay erhaltenen Banden zu validieren. Die Interaktion zwischen den Proteinen A und K sowie YFP und MP CYFP wurde in Epidermiszellen von Tabak mit der in diesem Video beschriebenen Methode untersucht, wie hier gezeigt.
Bei der Beurteilung der biomolekularen Fluoreszenzkomplemmentierung wurde das starke YFP-Signal rekonstruiert. Dieses BFC-Signal akkumulierte sich in Punta an der Zellperipherie, die für das Plasma diagnostisch ist, da MP ein hochgradig unlösliches Protein ist. Bei der Expression in Bakterien oder Pflanzen wurde der Proteinmembran-Overlay-Assay verwendet, um diese Interaktion zu validieren.
In-vitro-Proteinextrakte, die ein Mikrogramm GST MP oder nicht fusionierte GST enthielten, wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgelöst, gefolgt von einem Elektrotransfer auf eine Nitrozellulosemembran. Wenn diese Pro iame mit löslichen Streptokokken zwei GST mp, aber nicht unverschmelzt untersucht wurden, zeigte GST eine Bindung. Darüber hinaus wurde bei der Untersuchung desselben Satzes von pro-IMS mit einer nicht verwandten pro-Säge nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH-Kinase, die mit Streptokokken zwei markiert war, keine Bindung beobachtet, die die Spezifität der A NK MP-Interaktion weiter demonstriert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die immobilisierten Proteine gemäß dem vorgestellten Protokoll ordnungsgemäß nachzufüllen.
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Überblick
Dieser Artikel stellt einen in vitro Protein-Protein-Bindungsassay vor, der entwickelt wurde, um Interaktionen zwischen einem membranimmobilisierten Protein und einem löslichen Protein zu untersuchen. Die Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Prüfung von Interaktionen, die unlösliche Proteine betreffen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Protein-Protein-Interaktionen
- Biochemische Assays
- Membranproteine
Hintergrund
- Das Verständnis der Proteinfunktionalität erfordert die Untersuchung von Proteininteraktionen.
- Unlösliche Proteine stellen oft Herausforderungen in Interaktionsstudien dar.
- In-vitro-Assays können kontrollierte Umgebungen für das Studium dieser Interaktionen bieten.
- Membranimmobilisierte Proteine sind entscheidend für bestimmte Bindungsassays.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen membranimmobilisierten und löslichen Proteinen zu entwickeln.
- Die Zuverlässigkeit von Proteininteraktionsassays zu verbessern.
- Die Untersuchung von unlöslichen Proteinen in einem Lösungskontext zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Klonierung und Expression von Fusionsproteinen.
- Extraktion von markierten unlöslichen Proteinen.
- Immobilisierung von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen.
- Immunoblotting zur Erkennung von Interaktionen mit löslichen Proteinen.
Hauptergebnisse
- Der Assay zeigte erfolgreich Interaktionen zwischen immobilisierten und löslichen Proteinen.
- Immunoblotting bestätigte das Vorhandensein spezifischer Proteininteraktionen.
- Die Methode erwies sich als zuverlässig für die Untersuchung von Interaktionen unlöslicher Proteine.
- Die Ergebnisse unterstützen die Machbarkeit von In-vitro-Assays für Proteininteraktionsstudien.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Assay ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Proteininteraktionen.
- Er adressiert Herausforderungen, die mit der Untersuchung von unlöslichen Proteinen verbunden sind.
- Zukünftige Anwendungen können sich auf verschiedene Proteininteraktionsstudien erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Validating protein-protein interactions is essential for target de-risking in early discovery, particularly when studying insoluble or membrane-associated targets. The protein membrane overlay assay enables reliable in vitro assessment of interactions between soluble and insoluble proteins, addressing a key limitation of solubility-dependent methods like GST pull-down or Co-IP. When combined with orthogonal approaches such as BiFC, it supports mechanistic confidence and reduces false-positive risk in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving insoluble or membrane-embedded targets that are inaccessible to standard pull-down assays.
- Operational Value: Provides a complementary, principle-independent method to confirm interactions observed in live-cell systems like BiFC, reducing false-positive risk.
- Predictive Value: Supports target triage by confirming direct binding between soluble effectors and insoluble receptors or scaffolds under controlled conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates immobilized protein strips on nitrocellulose membrane that can be stored and reused for multiple rounds of soluble protein probing.
- Quantitative Output: Enables immunoblot-based detection with chemiluminescent signal proportional to bound soluble protein, supporting semi-quantitative comparison across conditions.
- Platform Adaptability: Compatible with various affinity tags (e.g., GST, Strep-II) allowing flexible detection strategies for diverse target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validates interactions identified in vivo (e.g., BiFC in plant epidermal cells) using a biochemical method, strengthening target-disease relevance.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed co-localization or complementation reflects direct binding versus indirect association in complex environments.
- Preclinical Alignment: Supports target validation in disease-relevant systems by confirming direct interaction between a viral movement protein and a host interactor, informing host-pathogen intervention strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, particularly for targets where solubility complicates biochemical validation. It enables progression from phenotypic hits or genetic interactors to mechanistically de-risked targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming direct interaction between a soluble probe (e.g., Strep-II tagged ANK) and an immobilized insoluble protein (e.g., GST-TMV MP).
- Screening: Enables preparation of standardized, refolded immobilized protein membranes for consistent probing across multiple soluble protein candidates.
- Analytics: Generates immunoblot signals that allow comparison of binding intensity between test and control conditions (e.g., specific vs. nonspecific interactors).
- Translational Research: Connects in vivo interaction data (e.g., BiFC signal accumulation at plasma membrane) to in vitro biochemical validation, reinforcing target validity.
- Enterprise Reuse: Immobilized membranes can be blocked, probed, stripped, and reprobed, supporting iterative testing and cross-project reuse of validated targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target engagement data by validating interactions independent of cellular context or overexpression artifacts.
- Operational Value: Uses standard molecular biology and immunoblotting infrastructure, requiring no specialized equipment beyond gel electrophoresis and blotting systems.
- Strategic Value: Reduces risk of advancing false-positive interactions by providing an orthogonal, biochemical confirmation step.
- Portfolio Impact: Enables more accurate go/no-go decisions in target prioritization by confirming direct binding between drug-target candidates and effector proteins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and immunoblotting techniques.
- Dependent on access to SDS-PAGE, electrotransfer systems, and chemiluminescent detection platforms.
- Necessitates optimization of refolding conditions post-immobilization to maintain native conformation of the immobilized protein.
- Requires careful design of tag controls (e.g., GST-only, Strep-II NC) to distinguish specific binding from tag-mediated artifacts.
- Limited to interactions detectable under non-denaturing binding buffer conditions; may not capture interactions requiring specific post-translational modifications or co-factors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Expression and Extraction of the Proteins
3:22
Immobilization of ProIM and ProIMnc on the Membrane
3:54
Re-folding of Membrane-bound Proteins
4:49
Probing the ProIM by ProSOL
5:33
Visualizing Protein-protein Interaction by Immunoblotting
7:06
Representative Results
8:20
Conclusion
