Name: Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro- /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Lernen Sie ein Proteinmembran-Overlay-Assay zur Untersuchung von Interaktionen zwischen unlöslichen und löslichen Proteinen in vitro. Diese Methode nutzt Immunoblotting zur zuverlässigen Detektion spezifischer Bindungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Arbeit in unserem Labor wird durch Zuschüsse von NIH, USDA National Institute of Food and Agriculture, NSF, BARD, DOE und BSF zu VC unterstützt

1. Expression und Extraktion der Proteine <ol><li> Unterschiedlich tag die Proteine ​​für ihre Erkennung getestet werden. Beschriften Sie die Protein auf der Membran (ProIM) mit einem Tag einer größeren Größe (zB GST) immobilisiert werden und die nicht kondensierten Tag kann als ein immobilisiertes negative Kontrolle (ProIMnc) verwendet werden. Beschriften Sie die Protein als löslich Sonde (PROSOL) entweder mit einem großen oder einem kleinen Etikett verwendet werden. Sicherung der gleichen Tag, um eine negative Kontrolle lösliches Protein (ProSOLnc) und beinhalten in der Interaktion Test, um die Spezifität der nachgewiesenen Bindung zu bestätigen. </li><li> Wählen Sie die Protein-Expression System tagged Proteine ​​zu exprimieren, dh E. coli, Baculovirus, etc., je nach Anforderung für potenzielle posttranslationalen Modifikationen und Renditen der Proteine. </li><li> Auszug ProIM und ProIM nc aus dem Organismus der Wahl (Schritt 1,2) mit SDS-PAGE-Ladepuffer (20% Glycerin, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH 6,8) mit Proteinase-Inhibitor-Cocktail. Verlassen Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 15 min, mit 0,5% 2-Mercaptoethanol und kochen für 5 min. </li><li> Auszug PROSOL und PROSOL nc aus dem Organismus der Wahl (Schritt 1,2) mit einem Standard-Protokolle 16. Diese Proteine ​​werden sollte leicht löslich in Bindungspuffer (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% BSA, 0,1% Tween 20) verwendet in den Schritt 4.1. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der rekombinanten Proteine ​​mit einem Standard-Verfahren, wie zB Bio-Rad Protein Assay Kit. wie Bio-Rad Protein Assay Kit. Wenn Rohextrakt, anstatt gereinigtes Protein, für den Assay verwendet wird, schätzen die Konzentration des Proteins von Interesse in diesem Extrakt durch Scannen Densitometrie der entsprechenden Band auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit Coomassie Brilliant Blue R-250 und mit bekannten Konzentrationen von BSA als Referenz. </li></ol> 2. Immobilisierung von ProIM und ProIMnc auf der Membran <ol><li> Resolve zwei Sätze von Extrakten, die jeweils 1 pg ProIM und ProIM nc auf einem SDS-Polyacrylamidgel nach dem Standardprotokoll 16. </li><li> Nach der Elektrophorese, platzieren Sie den Transfer des Gels in 100 ml Transferpuffer (60 mM Glycin, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) und inkubieren unter leichtem Schütteln für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Elektrotransfer die Proteine ​​in dem Gel auf eine Nitrozellulose-Membran enthielt nach dem Standardprotokoll 16. </li></ol> 3. Re-Faltung von Membran-gebundenen Proteine <ol><li> Nach Elektrotransfer, inkubieren Sie die Membran für 15 min in 15 ml Puffer A (30 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,05% Tween 20) unter leichtem Schütteln, um restliches SDS zu entfernen. </li><li> Nach dem Ablassen sorgfältig, übertragen Sie die Membran in 25 ml Denaturierungspuffer (7 M Guanidin-Hydrochlorid, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). und für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. (Hinweis: Die Nitrozellulosemembran wird undurchsichtig, wenn in der Denaturierung Puffer). und für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. </li><li> Übertragen Sie die Membran in 25 ml TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) und Inkubation unter leichtem Schütteln für 5 min (Anmerkung: In diesem Schritt gewinnt die Membran ihre ursprüngliche weiße Farbe). </li><li> Übertragen Sie die Membran in 25 ml Bindungspuffer (siehe Schritt 1.2) und inkubieren Sie bei 4 ° C unter leichtem Schütteln über Nacht. </li></ol> 4. Probing the ProIM durch PROSOL <ol><li> Schneiden Sie die Membran in zwei Streifen, die beide mit ProIM und ProIM nc. </li><li> Machen Sie den PROSOL und ProSOLnc Hybridisierung durch Verdünnung der Vorbereitung mit 1-10 ug entweder PROSOL oder ProSOLnc in 10 ml frisches Bindungspuffer. Übertragen Sie jede Membran in die PROSOL oder ProSOLnc Hybridisierungslösung und Inkubation für 1,5 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Membranen, die aus der Hybridisierung Lösungen und spülen dreimal für je 15 min in TBS. </li></ol> 5. Visualisierung von Protein-Protein-Interaktion durch Immunoblot <ol><li> Blockieren Sie die Membran mit 2,5% Magermilch in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) für 1 h bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die primären Antikörper (Anti-strepII polyklonale Kaninchen-Antikörper) in 0,5% Magermilch in TBST bei der Konzentration der vom Hersteller empfohlen. </li><li> Legen Sie die verstopfte Membranen in der Antikörper-Lösung, und für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Spülen Sie die Membranen in 20 ml TBST für 15 min und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Verdünnen Sie die Sekundär-Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper) konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) in 0,5% Magermilch in TBST bei der Konzentration der vom Hersteller empfohlen. Legen Sie die Membranen in der Sekundär-AntikörperLösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Spülen Sie die Membranen in 20 ml TBST für 15 min und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Nach dem letzten in TBS spülen, visualisieren die Protein-Protein Interaktion mit einem HRP Chemilumineszenz Substrat (z. B. Millipore Immobilon westlichen Chemilumineszenz HRP Substrat). </li><li> Probe der gleichen Membranen mit dem primären Antikörper für das Tag fusioniert ProIM, durch die entsprechenden Sekundär-Antikörper wie in den Schritten von 5,1 bis 5,4 beschrieben wird. Visualisieren Sie ProIM und ProIMnc wie beschrieben in Schritt 5,5 bis die Identität des Bands in die Proteinmembran Overlay-Assay (Schritt 5,5) erhalten zu validieren. In den meisten Fällen erfolgt das Ausbrechen nicht notwendig, da das Signal von diesem Schritt erhalten ist viel stärker als Restsignal von Schritt 5,5. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die ANK-MP-Interaktion wurde durch BIFC in Tabak Epidermiszellen (Abbildung 1A) beobachtet. Da MP ist ein hoch unlösliche Proteinablagerungen, wenn in Bakterien oder in Pflanzen exprimiert, wurde das Protein-Membran-Overlay-Assay angenommen, um diese Interaktion in vitro (Abbildung 1B) zu validieren. Proteinextrakte mit 1 pg GST-MP (ProIM) oder ungesichert GST (ProIM nc) wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Elektrotransfer auf eine Nitrozellulosemembran folgte aufgelöst. Wenn diese ProIMs mit löslichen ANK-strepII (PROSOL), GST-MP, aber nicht fusionierten GST wurden sondiert, zeigten Bindung (Abbildung 1B, Bahnen 1, 2, auf den Spuren 5, 6 zu vergleichen). Außerdem, wenn die gleiche Menge von ProIMs mit einem unabhängigen, ProSOLnc, dh Arabidopsis zytoplasmatischen NADH-Kinase markiert strepII (NADH3-strepII), keine Bindung wurde nicht beobachtet wurden sondiert ein weiterer Beweis für die Spezifität der ANK-MP-Wechselwirkung (Abbildung 1B, Bahnen 3, 4). <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Spezifische Bindung von Tabak ANK zu TMV MP in vivo und in vitro. (A) ANK-MP-Interaktion in lebenden Tabak Epidermiszellen wie BIFC erkannt. Starke YFP-Signal rekonstruiert wurde, wenn MP und ANK, um C-terminal und N-terminalen Hälften von YFP bzw. verschmolzen, wurden in Tabak Epidermis folgenden microbombardment ihrer kodierenden Gene koexprimiert. Diese BIFC Signal in puncta an der Zellperipherie, die Diagnose von Plasmodesmen 15 sind angesammelt. (B) ANK-MP-Interaktion in vitro durch Protein-Membran-Overlay-Assay nachgewiesen. Proteinextrakte mit 1 pg GST-MP (ProIM) oder ungesichert GST (ProIMnc) wurden auf einem 15% SDS-Polyacrylamidgel von Elektrotransfer auf eine Nitrozellulosemembran folgte aufgelöst. Die GST-MPProIM und GSTProIMnc wurden mit 0,5 ug / ml ANK-strepII (PROSOL) inkubiert und ANK Bindung wurde durch Untersuchung der Membran mit anti-strepII polyklonalen Kaninchen-Antikörper, gefolgt von Anti-Kaninchen-IgG + M konjugierten Sekundärantikörper detektiert HRP (Spuren 1 und 2). Weder GST-MPProIM noch GSTProIMnc mit einem nicht verwandten Proteinen, Arabidopsis zytoplasmatischen NADH-Kinase, fusioniert mit dem strepII tag (ProSOLnc, Bahnen 3 und 4) interagiert. Die Identität der Band in diesem Assay beobachtet wurde durch Untersuchung der Membran mit anti-GST-Antikörper (Spuren 5 und 6) bestätigt. Wenn die Membran mit Denaturierungspuffer wurde, ohne mit Puffer A gewaschen behandelt werden, ist die Bindung des GST-MP zu ANK verloren, während nicht identifizierte Proteine ​​in der GST-MP und GST contining Eiweißextrakte enthaltenen reagierte mit ANK-strepII, zeugt von der Bedeutung der Schritt 3.1 vor der Denaturierung (Spuren 7 und 8).

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P30+movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+is+a+single-strand+nucleic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein.</a> Cell. 60, 637-647 (1990).</li>
<li>Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tobamovirus+movement+proteins+with+the+plant+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton.</a> Science. 270, 1983-1985 (1995).</li>
<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieser Ansatz eignet sich zur Prüfung Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen Kombinationen der Proteine, wenn mindestens eine von denen die Proteine ​​ist leicht löslich in den Bindungspuffer und erfolgreich an andere Kombination von Proteinen 17,18 aufgebracht. Die iInteractions zwischen den Proteinen, die sowohl unter diesen Bedingungen unlöslich kann nicht durch dieses Protokoll getestet werden. Auch erfolgreiche Rückfaltung von ProIM kritisch für den Test. Spülen der Membra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Protein-Assay-Kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Proteinase-Inhibitor-Cocktail </td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN System </td><td> Bio-RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td> Semi-dry Western-Blot SD Elektrotransfer System </td><td> Bio-RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td> Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase </td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td> Anti-GST polyklonalen Kaninchen-Antikörper </td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td> Anti-strepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace, NT Nitrocellulose Transfer Membran </td><td> Pall Scientific </td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td> Immobilon westlichen Chemilumineszenz HRP Substrat </td><td> Millipore </td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

proteinmembran overlay assay: ein protokoll, die interaktion zwischen löslichen und unlöslichen proteinen testen in-vitro-</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating Interaktionen zwischen verschiedenen Proteinen ist von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen auf molekularer Ebene. Es gibt mehrere Methoden, sowohl in vitro und in vivo, um Protein-Bindung zu bewerten, und mindestens zwei Methoden, die die Mängel der einander ergänzen sollten durchgeführt werden, um zuverlässige Erkenntnisse zu erhalten. Für eine in vivo-Assay, der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC)-Assay die beliebteste und am wenigsten invasive Ansatz, um Protein-Protein Interaktion in lebenden Zellen erkennen kann ist, zu identifizieren sowie die intrazelluläre Lokalisation der wechselwirkenden Proteinen 1,2. In diesem Test nicht-fluoreszierenden N-und C-terminalen Hälften von GFP oder seinen Varianten zu testen Proteine ​​fusioniert sind, und wenn die beiden Fusionsproteine ​​zusammen sind aufgrund der getesteten Proteine ​​Interaktionen gebracht wird, wird das Fluoreszenzsignal 3-6 rekonstituierte . Da das Signal ist leicht nachweisbar durch Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie hat BIFC als ein mächtiges Werkzeug der Wahl unter Zellbiologen zur Untersuchung über Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen 3 entstanden. Dieser Test kann jedoch manchmal zu falschen positiven Ergebnissen. Zum Beispiel kann das Fluoreszenzsignal durch zwei GFP-Fragmenten so weit wie 7 nm von einander durch so angeordnet, dass eine dichte Packung in einem kleinen subzellulären Kompartiment aufgelöst werden, sondern dass aufgrund der spezifischen Wechselwirkungen 7. Aufgrund dieser Einschränkungen sollten die Ergebnisse von Live Cell Imaging-Technologien erhalten von einem unabhängigen Ansatz, der auf einem anderen Prinzip zur Detektion von Protein-Interaktionen bestätigt werden. Co-Immunpräzipitation (Co-IP) oder Glutathion-Transferase (GST) Pull-down-Assays stellen solche alternative Methoden, die häufig verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen in vitro zu analysieren. Allerdings bBei diesen Tests müssen jedoch die getesteten Proteine ​​werden leicht löslich in den Puffer, der für die Bindungsreaktion supportsused. Daher können keine speziellen Wechselwirkungen zwischen einem unlöslichen Protein nicht durch diese Techniken bewertet werden. Hier zeigen wir Ihnen das Protokoll für die Protein-Membran-Overlay-Bindungs-Assay, die diese Schwierigkeit umgeht. Bei dieser Technik kann die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen zuverlässig geprüft werden, weil eines der Proteine ​​auf eine Membran-Matrix immobilisiert ist. Diese Methode, die in Kombination mit in vivo-Experimente, wie BIFC, bietet eine zuverlässige Methode zu untersuchen und zu charakterisieren Interaktionen treu zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen. In diesem Artikel Bindung zwischen Tabak-Mosaik-Virus (TMV) Bewegung Protein (MP), die mehrere Funktionen ausübt während virale Zelle zu Zelle transportieren 8-14, und eine vor kurzem identifizierte Pflanze zellulären interactor, Tabak Ankyrin repeat-containing protein (ANK ) 15, wird gezeigt, mit dieser Technik.

Testen Protein-Protein-Interaktion ist für die Präparation von Protein-Funktionalität unverzichtbar. Hier stellen wir eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Protein-Protein-Bindungs-Assay auf eine Membran-immobilisierten Protein mit ein lösliches Protein-Sonde. Dieser Test liefert eine zuverlässige Methode, um die Interaktion zwischen einem unlöslichen Protein und ein Protein in Lösung zu testen.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Die Validierung von Interaktionen zwischen verschiedenen Proteinen ist für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung. Es gibt mehrere ...

Testen von Proteinen. Proteinwechselwirkungen sind unverzichtbar für die Aufklärung der Proteinfunktion. Dieses Video stellt einen in-vitro-Protein-Protein-Bindungsassay vor, mit dem die Wechselwirkung zwischen einem membranständigen und immobilisierten Protein sowie einem löslichen Protein getestet werden kann.Zunächst werden Fusionsproteine kloniert, exprimiert und extrahiert. Das markierte unlösliche Protein wird auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert und so behandelt, dass es in seine native Konformation zurückgefaltet wird. Anschließend wird die Membran mit markierten löslichen Proteinen inkubiert, und eine Immunblot-Analyse wird durchgeführt, um die Proteine nachzuweisen.Wenn die markierten Proteine wechselwirken, werden sie durch das auf der Membran immobilisierte Protein gebunden, und das Signal der Immunblotting wird detektiert. Somit bietet dieser Test eine zuverlässige Methode, um die Interaktion zwischen einem unlöslichen Protein und einem in Lösung befindlichen Protein zu überprüfen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Verfahren wie dem GST-Pull-down besteht darin, dass man die Bindung zwischen unlöslichem und löslichem Protein zuverlässig in vitro bewerten kann.Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, genetisch markierte Proteine zur Detektion herzustellen. Klonen Sie zunächst das Protein, das auf der Membran immobilisiert werden soll. Bezeichnen Sie dieses hier als pro Im (für immobilisiertes Protein) in einen Expressionsvektor, der einen großen Marker wie GST codiert. Der leere Expressionsvektor, der nur für den Marker kodiert, wird als negativer Kontrollstamm für das immobilisierte Protein verwendet und als pro IM nc bezeichnet.Klonieren Sie anschließend das Protein, das als löslicher Sondenstoff verwendet wird, in einen Expressionsvektor, der einen anderen Marker kodiert, beispielsweise Strep-Zwei. Dies wird im Folgenden als Prosol (lösliches Protein) als negativer Kontrollklon bezeichnet. Klonieren Sie ein lösliches Protein als negative Kontrolle in denselben Expressionsvektor. Dies wird als Prosol NK (lösliches Protein, negative Kontrolle) bezeichnet.Verwenden Sie anschließend ein Proteinausdruckssystem, wie beispielsweise ein coli- oder balo-Virus, um die markierten Proteine zu exprimieren. Das verwendete Expressionssystem sollte sorgfältig anhand der Anforderungen bezüglich posttranslationaler Modifikationen ausgewählt werden. Isolieren Sie die exprimierten Proteine aus dem gewählten Organismus. Für pro IM und pro I mnc Resus.Suspendieren Sie die Zellen in SDS-PAGE-Lade-Puffer unter Zusatz eines Proteaseinhibitorcocktails. Anschließend kochen Sie die Zellen fünf Minuten lang und zentrifugieren sie, um den Niederschlag zu entfernen, um Prosol und prosol NC zu gewinnen. Verwenden Sie Standardverfahren. Das pro IMS kann unter denaturierenden Bedingungen gewonnen werden, da die Proteine nach ihrer Immobilisierung auf der Nitrocellulosemembran wieder gefaltet werden.Prosol sollte jedoch extrahiert werden, um eine native Konformation zu gewährleisten, da sie dem Bindungspuffer hinzugefügt werden, nachdem die markierten Proteine extrahiert wurden. Bestimmen Sie die Konzentration der rekombinanten Proteine mithilfe einer Standardmethode, wie beispielsweise dem BioRad-Protein-Assay-Kit. Falls für den Assay ein Rohextrakt anstelle eines gereinigten Proteins verwendet wird.Schätzen Sie die Konzentration des Proteins der Wahl durch Dichtometrie der entsprechenden Bande auf einem mit Kumasis gefärbten SDS-Polyacrylamidgel. Verwenden Sie bekannte Konzentrationen von BSA als Referenz. Erstellen Sie anschließend die Standardkurve basierend auf den Signalintensitäten, die mittels Dichtometrie für BSA gemessen wurden, und berechnen Sie die Menge an Protein im Rohextrakt.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, pro Iam und pro IAM NC auf der Membran zu immobilisieren. Geben Sie jeweils ein Mikrogramm der pro Iam- und pro IAM NC-Extrakte im Duplikat auf ein SDS-Polyacrylamidgel. Entfernen Sie nach der Elektrophorese das Gel vorsichtig von den Glasplatten und legen Sie es in 100 Milliliter Transferpuffer. Inkubieren Sie anschließend unter leichtem Rühren 20 Minuten bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation eine Westernblot-Analyse durchführen, um die Proteine nach der Übertragung auf eine Nitrocellulose-Membran zu übertragen, damit die membrangebundenen Proteine sich neu falten können. Die Membran in 15 Milliliter Puffer A geben und unter leichtem Rühren inkubieren. Um restliches SDS zu entfernen, 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.Nach der Inkubation die Membran vorsichtig aus dem Puffer entfernen. Anschließend die Membran in 25 Milliliter Denaturierungspuffer geben. Zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.Während der Inkubation wird die Nitrocellulosemembran trüb. Überführen Sie die Membran anschließend mit einer Pinzette in 25 Milliliter TBS und inkubieren Sie sie unter leichtem Rühren für fünf Minuten. In diesem Schritt kehrt die Membran zu ihrer ursprünglichen weißen Farbe zurück.Als Nächstes überführen Sie die Membran in 25 Milliliter Bindungspuffer. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren über Nacht. Danach wird das lösliche Protein verwendet, um die Membran auf das immobilisierte Protein zu untersuchen.Zunächst bereiten Sie die Hybridisierungspuffer vor, indem Sie ein bis zehn Mikrogramm Prosol und Prosol NC in separaten Röhrchen mit je 10 Milliliter frischem Bindungspuffer verdünnen. Anschließend geben Sie den Puffer in eine Hybridisierungsfolie. Danach schneiden Sie die Membran in zwei Streifen, wobei beide Streifen pro IM und pro IAM nc enthalten.Diese Membranen werden in den Hybridisierungspuffer gegeben. Überführen Sie jede Membran in die ProSol- oder ProSol-NC-Hybridisierungslösung und inkubieren Sie 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie die Membranen aus den Hybridisierungslösungen und waschen Sie sie dreimal je 15 Minuten in TBS.Um Protein-Protein-Interaktionen sichtbar zu machen, blockieren Sie die Membran mit 2,5 % Magermilch in TBST für eine Stunde. Nach der Inkubation legen Sie die blockierten Membranen in die Primärantikörperlösung. Hier wird ein anti-Strep-II-polyklonaler Kaninchenantikörper verwendet.Ansatz für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren nach der Inkubation. Spülen Sie die Membranen mit 20 Milliliter TBST 15 Minuten lang und anschließend zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Danach geben Sie die Membranen in die mit HRP konjugierte sekundäre Antikörperlösung. Hier wird ein mit HRP konjugierter Antikörper gegen Kaninchen-IgG verwendet.Einmal für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Die Membranen nach der letzten Spülung in TBS mit 20 Milliliter TBST 15 Minuten lang und anschließend zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln wie zuvor waschen und danach die Protein-Protein-Interaktion mittels eines HRP-Chemilumineszenz-Substrats detektieren. Hier: Millipore. Im Molan Western Chemiluminescent.HRP-Substrat wird nach dem Immundotting des Prosols verwendet. Spülen Sie die Membran mit TBST 15 Minuten lang und anschließend zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur. Danach erneut die Membranen mit dem primären Antikörper gegen das Tag für Pro bebrüten.Im gefolgt von dem entsprechenden sekundären Antikörper. Visualisieren Sie PRO I und pro Im NNC durch Nachweis der Chemilumineszenz, um die Identität der Banden im Proteinmembran-Overlay-Assay zu bestätigen. Die Interaktion zwischen den Proteinen A und K sowie YFP und MP CYFP wurde in epidermalen Tabakzellen mit der in diesem Video beschriebenen Methode wie hier gezeigt untersucht.Wenn die biomolekulare Fluoreszenzkomplementation bewertet wurde, wurde ein starkes YFP-Signal rekonstruiert. Dieses BFC-Signal reicherte sich in den Punta an der Zellperipherie an, was charakteristisch für Plasma de ist, da MP ein hochgradig unlösbares Protein ist. Bei Expression in Bakterien oder Pflanzen wurde der Protein-Membran-Overlay-Assay angewendet, um diese Interaktion zu validieren.In-vitro-Proteinextrakte, die ein Mikrogramm GST-MP oder nicht fusioniertes GST enthielten, wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und anschließend elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Als diese Proiame mit löslichem annk-strep2-GST-MP sondiert wurden, zeigte nur GST-MP, nicht jedoch das nicht fusionierte GST, eine Bindung. Darüber hinaus wurde bei Sondierung derselben Pro-IMS mit einer无关en Pro-Saw-nc-IE-Arabidopsis-cytoplasmatischen, mit Strep2 markierten NADH-Kinase keine Bindung beobachtet, was die Spezifität der ANK-MP-Interaktion weiter belegt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die immobilisierten Proteine gemäß dem vorgestellten Protokoll ordnungsgemäß nachzufüllen.

protein-membrane-overlay-assay-protocol-to-test-interaction-between

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert...

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Dieses Video zeigt co-immunpräzipitierte Proteinkomplexe auf einer PVDF-Membran für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse. Die reduzierten Proteine aus den Komplexen wurden mit Trypsin behandelt, um die einzelnen Proteine an den kleineren Peptiden zu spalten, dann wurden die restlichen Peptide aus der PVDF-Membran extrahiert. Das gezogene Peptid, das von beiden Proteinen in dem Komplex abgeleitet war, wurde dann getrocknet und in einer niedrigen Konzentration von Ameisensäure für die weitere...

Proteinverdau auf der Membran zur Vorbereitung von co-immunpräzipitierten Proteinen für Interaktionsstudien

In diesem Video haben wir die bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung (BiCAP) demonstriert, um spezifische Proteindimere unter Verwendung von konformationsspezifischen Einzeldomänen-Antikörpern nachzuweisen und zu isolieren.

Bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung zur Isolierung von zwei interagierenden Proteinen

Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren In Vivo

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle Assay, den Beitrag der spezifischen Proteins Domänen der Plasmamembran Rezeptoren Enzym Rekrutierung und Enzym-Aktivität gleichzeitig zu studieren.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem

Lernen Sie ein Proteinmembran-Overlay-Assay zur Untersuchung von Interaktionen zwischen unlöslichen und löslichen Proteinen in vitro. Diese Methode nutzt Immunoblotting zur zuverlässigen Detektion spezifischer Bindungen.

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-

Weitere Videos entdecken