Fluoreszierende Silberfärbung: Eine Technik zur Visualisierung des Gesamtproteins in Polyacrylamid-Gelen

Bei der fluoreszierenden Silberfärbung von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen werden fluorogene Sonden verwendet, um die Proteine nachzuweisen und zu quantifizieren.

Beginnen Sie mit einem Polyacrylamid-Gel mit Proteinen, die durch Elektrophorese in Banden unterteilt sind. In einer fixierenden Mischung aus Ethanol und Essigsäure einweichen, die durch Denaturierung der Proteine die Diffusion der Banden verhindert.

Waschen Sie das Gel, um Essigsäure- und Ethanolreste zu entfernen. Tauchen Sie das Gel in Silbernitratfleck. Silberionen binden stark an negativ geladene Gruppen in Proteinen.

Im Dunkeln inkubieren. Spülen Sie das Gel in Reinstwasser ab, um ungebundene Silberionenkomplexe zu entfernen.

Tauchen Sie das Gel in eine Entwicklungslösung, die eine fluorogene Mehrkomponentensonde - TPE-4TA - enthält. Diese anionische Sonde zielt auf Silberionen ab, die an das Protein gebunden sind, und bildet unlösliche Aggregate, die die fluorogenen Eigenschaften der Sonde aktivieren und so Fluoreszenz verleihen.

Da die Fluoreszenzaktivierung von der Aggregation abhängt, emittieren die ungebundenen Sonden kein Signal, was eine vollständige Proteinfärbung mit reduzierter Hintergrundemission ermöglicht.

Inkubieren Sie das Gel im Dunkeln unter leichtem Rühren, um eine vollständige fluorogene Entwicklung zu gewährleisten. Übertragen Sie das Gel in einen Entfärbungspuffer, um ungebundene Sonden zu entfernen. Zum Schluss bilden Sie das Gel ab, um die Intensität des Bandsignals zu erhalten. Plotten Sie die Intensität des Fluoreszenzsignals gegen die Standardproteinkurve, um die Gesamtmenge der Proteine in der Probe zu berechnen.

Nach der Elektrophorese tauchen Sie das Gel in eine 100-Milliliter-Lösung, die Ethanol und Essigsäure enthält, auf einen Orbitalschüttler und inkubieren Sie es zweimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 50 U/min. Waschen Sie das Gel anschließend dreimal mit Reinstwasser in einem sauberen Behälter, wobei jeder Waschgang 10 Minuten dauert.

Zuerst werden 0,01 Gramm Silbernitrat in 10 Millilitern Reinstwasser gelöst, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 0,1 % herzustellen. Geben Sie 100 Mikroliter dieser Stammlösung in 100 Milliliter Reinstwasser, um die Silbernitrat-Arbeitslösung herzustellen. Tauchen Sie das Gel in einem Abzug in 100 Milliliter der Silbernitrat-Arbeitslösung in eine versiegelte Glaskammer.

Verwenden Sie Aluminiumfolie, um das Gel während der Imprägnierung vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie es 1 Stunde lang, während Sie es bei 50 U/min auf einem Orbitalschüttler schütteln. Waschen Sie das Gel danach zweimal mit Reinstwasser in einem sauberen Behälter, wobei jeder Waschgang etwa 100 Milliliter Wasser verwendet und 60 Sekunden dauert.

Es ist wichtig, das Gel nach der Silberimprägnierung mit ultrareinem Wasser zu reinigen, um Hintergrundflecken zu minimieren.

Fügen Sie zunächst 50 Milliliter Reinstwasser zu 3 Milligramm TPE-4TA-Farbstoff hinzu. Beschallen Sie die Lösung 3 Minuten lang und fügen Sie zwischen jeder Beschallungssitzung 5 Mikroliter 1 molare Natronlauge hinzu, um den Farbstoff aufzulösen, normalerweise bis zu dreimal. Überprüfen Sie dann die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365-Nanometer-UV-Lampe, um sicherzustellen, dass sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat. Nur schwache oder nicht emittierende Lösungen deuten auf eine vollständige Auflösung hin.

Zur Herstellung der fluorogenen Entwicklungslösung werden 10 Milliliter der TPE-4TA-Stammlösung zu 90 Millilitern Reinstwasser gegeben. Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert der Lösung zu überprüfen. Stellen Sie die Lösung mit verdünnter Natronlauge oder Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 7 und 9 ein, wenn der pH-Wert außerhalb des Bereichs liegt.

Füllen Sie dann das Gel in einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 Millilitern der fluorogenen Entwicklungslösung und stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig eingetaucht ist. Verschließen Sie den Behälter und decken Sie ihn ab, um ihn vor Licht zu schützen. Schütteln Sie den Behälter über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 50 U/min und bei Raumtemperatur.

Füllen Sie das Gel in einen sauberen Behälter und entfärben Sie es 30 Minuten lang in 100 Millilitern 10%igem Ethanol. Spülen Sie das Gel dann 5 Minuten lang in Reinstwasser aus. Das Gel kann auf einem Tisch-Transilluminator oder auf einer Geldokumentationsmaschine im 365-Nanometer-Kanal oder im 302-Nanometer-Kanal abgebildet werden.