Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Eine robuste Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten und derivatisierten Sialinsäuren, die aus Mausleber isoliert wurden

Sialinsäuren, wie N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylneuraminsäure, sind negativ geladene Kohlenhydratanteile, die an den distalen Enden von Oligosaccharidketten auf der Zelloberfläche von Säugetieren vorkommen.

Um die relativen Mengen dieser Sialinsäuren im Lebergewebe von Mäusen mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder RP-HPLC zu quantifizieren, wird zunächst das isolierte Sialinsäuregemisch mit einem Derivatisierungsmittel behandelt. Das Derivatisierungsmittel interagiert mit den funktionellen Gruppen der Sialinsäuren und erzeugt stabile, fluoreszierende Sialinsäurederivate.

Bauen Sie eine RP-HPLC-Säule zusammen, die mit einem Fluoreszenzdetektor verbunden ist. Die Säule besteht aus porösen stationären Phasen auf Siliziumdioxidbasis, die an unpolare, hydrophobe Alkylkettenliganden gebunden sind, um selektive Wechselwirkungen mit Sialinsäurederivaten während des chromatographischen Laufs zu erleichtern.

Äquilibrieren Sie die Säule mit einer wässrigen polaren mobilen Phase, die niedrige Konzentrationen von Acetonitril, einem weniger polaren organischen Lösungsmittel, enthält, um eine optimale Säulenkonditionierung zu gewährleisten.

Laden Sie das derivatisierte Sialinsäuregemisch in die Säule.

N-Acetylneuraminsäure, die eine hydrophobe N-Acetylgruppe enthält, adsorbiert stärker an die hydrophoben Liganden der stationären Phase als N-Glykolylneuraminsäure mit einer hydrophilen N-Glykolylgruppe.

Analysieren Sie die Proben mit einem Standard-HPLC-System, das mit einem Online-Fluoreszenzdetektor verbunden ist. Verwenden Sie für die Analyse eine Umkehrphasen-C-18-Säule mit einer Länge von 250 Millimetern und einem Durchmesser von 4,6 Millimetern.

Nach der Vorbereitung von Lösungsmittel A und Lösungsmittel B und der Einrichtung des HPLC-Laufs, wie im Textprotokoll beschrieben, injizieren Sie 50 Mikroliter der Probe in das HPLC-System.

Überwachen Sie Eluenten mit einer Anregungswellenlänge des Fluoreszenzdetektors von 373 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 448 Nanometern.

Berechnen Sie abschließend die relative Menge an Neu5Gc, wie im Textprotokoll beschrieben.