Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

Die Mitochondrien nehmen zytosolisches Kalzium auf, da es für ihr reibungsloses Funktionieren unerlässlich ist.

Ein übermäßiger Kalziumeinstrom in die mitochondriale Matrix - mitochondriale Kalziumüberladung - löst die Öffnung eines inneren Membrankanals aus, der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore oder MPTP. Die geöffnete Pore ermöglicht einen erhöhten Kalziumausfluss aus den Mitochondrien, was zu einer mitochondrialen Dysfunktion führt.

Um die mitochondriale Kalziumaufnahme zu messen, beginnen Sie mit einer Multiwell-Platte, die isolierte Mitochondrien enthält, die in einem geeigneten Puffer suspendiert sind. Ergänzen Sie die Vertiefung mit Pyruvat und Malat, die ATP-produzierende Substrate sind. Mischen Sie den Inhalt der Vertiefung und inkubieren Sie.

Während der Inkubation werden Pyruvat und Malat in ATPs umgewandelt, wodurch die Mitochondrien mit Energie versorgt werden. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die mitochondriale membranundurchlässige, kalziumempfindliche fluoreszierende Farbstoffmoleküle enthält. Geben Sie den kalziumhaltigen Puffer an die energetisierten Mitochondrien ab.

Überwachen Sie die Kalziumfluoreszenz des Farbstoffs, während die Farbstoffmoleküle an das