Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

Die Mitochondrien nehmen zytosolisches Kalzium auf, da es für ihr reibungsloses Funktionieren unerlässlich ist.

Ein übermäßiger Kalziumeinstrom in die mitochondriale Matrix - mitochondriale Kalziumüberladung - löst die Öffnung eines inneren Membrankanals aus, der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore oder MPTP. Die geöffnete Pore ermöglicht einen erhöhten Kalziumausfluss aus den Mitochondrien, was zu einer mitochondrialen Dysfunktion führt.

Um die mitochondriale Kalziumaufnahme zu messen, beginnen Sie mit einer Multiwell-Platte, die isolierte Mitochondrien enthält, die in einem geeigneten Puffer suspendiert sind. Ergänzen Sie die Vertiefung mit Pyruvat und Malat, die ATP-produzierende Substrate sind. Mischen Sie den Inhalt der Vertiefung und inkubieren Sie.

Während der Inkubation werden Pyruvat und Malat in ATPs umgewandelt, wodurch die Mitochondrien mit Energie versorgt werden. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die mitochondriale membranundurchlässige, kalziumempfindliche fluoreszierende Farbstoffmoleküle enthält. Geben Sie den kalziumhaltigen Puffer an die energetisierten Mitochondrien ab.

Überwachen Sie die Kalziumfluoreszenz des Farbstoffs, während die Farbstoffmoleküle an das freie Kalzium im Puffer binden.

Fügen Sie mehr Kalziumionen hinzu, um den mitochondrialen Kalziumeinstrom zu initiieren. Das allmählich ansteigende mitochondriale Kalzium verringert die Kalziumionen im Puffer, wodurch die Kalziumfluoreszenz des Farbstoffs verringert wird.

Sobald die Mitochondrien ihre maximale Kalziumtransportkapazität erreicht haben, öffnen die weitere Zugabe von Kalziumionen die MPTP-Kanäle und importieren Kalzium in den Puffer. Der Puffer Calcium bindet an die Farbstoffmoleküle, was zu einer erhöhten Fluoreszenz des Farbstoffcalciums führt.

Plotten Sie die Farbstofffluoreszenz zu verschiedenen Zeitpunkten der Kalziumzugabe, um die Kinetik der mitochondrialen Kalziumaufnahme zu überwachen.

Um die Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme mit einem Plattenlesegerät zu starten, programmieren Sie das Lesegerät so, dass es jede Sekunde eine kinetische Messung der Kalziumgrün-5N-Fluoreszenz für eine Gesamtzeit von 1.000 Sekunden durchführt.

Programmieren Sie die Reagenzinjektoren so, dass sie 5 Mikroliter Calciumchloridlösung zu verschiedenen Zeitpunkten abgeben. Grundieren Sie dann die Injektoren mit der zu verwendenden Calciumchloridlösung.

Als nächstes fügen Sie 200 Mikrogramm isolierter Mitochondrien in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu und fügen Sie das entsprechende Volumen Kaliumchloridpuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 197 Mikrolitern zu erreichen. Fügen Sie dann 1 Mikroliter 1 molare Pyruvat, 1 Mikroliter 500 Millimolar Malat und 1 Mikroliter 1 Millimolar Calciumgrün-5N-Brühe hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.

Inkubieren Sie geschützt vor Licht bei Raumtemperatur für 2 Minuten, damit die Mitochondrien mit Energie versorgt werden. Starten Sie abschließend das vorprogrammierte kinetische Protokoll und überwachen Sie die Fluoreszenz von Calciumgrün-5N.