Split-Luciferase-Komplementationsassay zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für lebenswichtige zelluläre Funktionen.

Um die Wechselwirkungen zwischen Transmembranproteinen – Membranproteinen, die die Lipiddoppelschicht der Zellmembran überspannen – zu untersuchen, beginnen Sie mit den Vertiefungen einer Multi-Well-Platte, die eine adhärente Säugetierzellkultur enthält.

Als nächstes fügen Sie eine Lösung hinzu, die ein geeignetes Transfektionsmittel und ein Paar Expressionsplasmide enthält.

Eines der Expressionsplasmide kodiert für ein Transmembranprotein von Interesse, das mit dem kleinen nicht-funktionellen Fragment des Luciferase-Enzyms fusioniert ist; das andere Plasmid kodiert ein zweites Transmembranprotein von Interesse, das mit dem großen nicht-funktionellen Fragment des Luciferase-Enzyms fusioniert ist.

Inkubieren Sie die Platte. Das Transfektionsmittel erleichtert die zelluläre Aufnahme der Expressionsplasmide.

Erfolgreich transfizierte Zellen exprimieren die Transmembranproteine. Die Wechselwirkung zwischen den exprimierten Transmembranproteinen bringt die kleinen und großen Fragmente, die dem Zytoplasma zugewandt sind, in enge Nähe, wodurch sie binden und das aktive Luciferase-Enzym bilden.

Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen durch serumfreie Medien, um die Hintergrundlumineszenz zu minimieren. Fügen Sie Furimazin hinzu – ein zelldurchlässiges Luciferase-Substrat – Lösung. Furimazin dringt in die Zellen ein, woraufhin Luziferase das Furiamazin oxidiert und eine hochintensive Lumineszenz erzeugt.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Lumineszenz, die auf eine starke Wechselwirkung zwischen den Transmembranproteinen hindeutet.

Ernten Sie das adhärente HEK293T der Zellkultur durch Trypsinisierung und resuspendieren Sie die Zellen in einem speziellen vollständigen Wachstumsmedium. Plattieren Sie die Zellen auf eine 96-Well-Platte mit klarem Boden und weißer Seite. Passen Sie die Gesamtzahl der Wells an, um alle getesteten Kombinationen und Kontrollen, einschließlich Replikationen, aufzunehmen. Kultivieren Sie die Zellen dann über Nacht unter Standardbedingungen.

Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Kombinationen von Expressionsplasmiden. Verdünnen Sie die Plasmide in einem serumfreien Medium auf 6,25 Nanogramm pro Mikroliter für jedes Konstrukt und fügen Sie das lipidbasierte Transfektionsreagenz in einem geeigneten Lipid-DNA-Verhältnis hinzu.

Inkubieren Sie die Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers. Geben Sie dann 8 Mikroliter des Lipid-DNA-Gemisches in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Mischen Sie den Inhalt der Platte mit sanfter Drehung und kultivieren Sie die Zellen 20 bis 24 Stunden lang unter Standardbedingungen.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das konditionierte Medium in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter eines serumfreien Mediums und achten Sie darauf, dass sich die Zellen beim Medienaustausch nicht ablösen.

Mischen Sie kurz vor der Messung der Lumineszenz ein Volumen Fruimazin mit 19 Volumen eines Verdünnungspuffers. Geben Sie 25 Mikroliter der Furimazin-Arbeitslösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Platte vorsichtig von Hand oder mit einem Orbitalschüttler.

Setzen Sie die Platte in einen Lumineszenz-Mikroplatten-Reader ein und äquilibrieren Sie die Platte 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus und lesen Sie die Lumineszenz mit einer Integrationszeit von 0,3 Sekunden aus. Überwachen Sie die Lumineszenz bei Bedarf bis zu zwei Stunden lang.