Chipbasierte digitale PCR zum Nachweis seltener Transkriptvarianten mit einem nanofluidischen Chip

Bei der chipbasierten digitalen PCR-Technik wird eine einzelne Reaktion in die Kammern eines nanofluidischen Chips aufgeteilt. Die Amplifikation der partitionierten Sequenzen ermöglicht den Nachweis seltener Transkriptvarianten – nicht-kanonische Transkripte, die mit einer niedrigen Häufigkeit auftreten.

Entnehmen Sie zunächst eine Probe, die cDNA der seltenen Zieltranskriptvariante und der häufigen Variante enthält. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die thermostabile DNA-Polymerase, dNTPs und Primer enthält.

Fügen Sie gängige und seltene Transkriptvarianten-spezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit verschiedenen fluoreszierenden Reportern und Quenchermolekülen markiert sind. Der Quencher absorbiert die Fluoreszenz des Reporters, wenn er sich in unmittelbarer Nähe befindet.

Laden Sie das Gemisch auf den nanofluidischen Chip. Die Lösung ist in gleichmäßig große Nanokammern unterteilt. Jede Kammer, die eine cDNA enthält, dient als unabhängiges Reaktionsgefäß.

Starten Sie den Temperaturwechsel. Eine hohe Denaturierungstemperatur trennt die doppelsträngige DNA in Einzelstränge. Senken Sie die Temperatur, so dass die Primer und Oligonukleotidsonden an den komplementären Regionen auf de