Chipbasierte digitale PCR zum Nachweis seltener Transkriptvarianten mit einem nanofluidischen Chip

Bei der chipbasierten digitalen PCR-Technik wird eine einzelne Reaktion in die Kammern eines nanofluidischen Chips aufgeteilt. Die Amplifikation der partitionierten Sequenzen ermöglicht den Nachweis seltener Transkriptvarianten – nicht-kanonische Transkripte, die mit einer niedrigen Häufigkeit auftreten.

Entnehmen Sie zunächst eine Probe, die cDNA der seltenen Zieltranskriptvariante und der häufigen Variante enthält. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die thermostabile DNA-Polymerase, dNTPs und Primer enthält.

Fügen Sie gängige und seltene Transkriptvarianten-spezifische Oligonukleotidsonden hinzu, die mit verschiedenen fluoreszierenden Reportern und Quenchermolekülen markiert sind. Der Quencher absorbiert die Fluoreszenz des Reporters, wenn er sich in unmittelbarer Nähe befindet.

Laden Sie das Gemisch auf den nanofluidischen Chip. Die Lösung ist in gleichmäßig große Nanokammern unterteilt. Jede Kammer, die eine cDNA enthält, dient als unabhängiges Reaktionsgefäß.

Starten Sie den Temperaturwechsel. Eine hohe Denaturierungstemperatur trennt die doppelsträngige DNA in Einzelstränge. Senken Sie die Temperatur, so dass die Primer und Oligonukleotidsonden an den komplementären Regionen auf den einzelnen DNA-Strängen abkühlen können.

Erhöhen Sie die Temperatur, um den Verlängerungsschritt zu erreichen, in dem die DNA-Polymerase den Primer verlängert und die Sonde spaltet. Die Entfernung zum Quencher ermöglicht die Fluoreszenzemission des Reporters. Lesen Sie das Fluoreszenzsignal ab.

Erstellen Sie ein Streudiagramm, das die Kammern mit dem amplifizierten Rare-Transkript-Ziel und die Kammern ohne das Ziel darstellt. Positive Signale für das Ziel weisen auf das Vorhandensein der seltenen Transkriptvariante in der Probe hin.

Lassen Sie den Mastermix und den Assay zunächst mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen. Laden Sie dann 0,5-Milliliter-Röhrchen mit 6-Mikroliter-Aliquoten der cDNA-Proben. Stellen Sie auch ein Kontrollrohr ohne Schablone her. Anschließend den Mastermix vorsichtig vortexen und 8,7 Mikroliter pro Reaktion in ein steriles Röhrchen aliquotieren.

Fügen Sie dann für jede Reaktion 0,87 Mikroliter des benutzerdefinierten Assay-Primers hinzu und fügen Sie 1,83 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu. Mischen Sie die Kombination vorsichtig und geben Sie 11,4 Mikroliter in jedes Röhrchen, das cDNA enthält, und in die Kontrolle ohne Vorlage. Mischen Sie dann die Röhrchen vorsichtig und bündeln Sie den Röhrcheninhalt mittels Impulszentrifugation. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, laden Sie die Chips so schnell wie möglich.

Schließen Sie den Spänelader an und warten Sie, bis die Kontrollleuchte grün leuchtet. Bereiten Sie dann die Tauchflüssigkeitsspritze vor, indem Sie den Kolben vorsichtig auf 1 bis 2 Millimeter ziehen, dann entfernen Sie die Kappe und fügen Sie die Spitze hinzu.

Notieren Sie sich als Nächstes den Code, der auf dem Deckel eines neuen Chips geschrieben ist, halten Sie dann den Deckel vorsichtig an die Seite, ziehen Sie die Schutzfolie ab und positionieren Sie ihn mit der klebrigen Seite nach oben im Deckelnest. Drücken Sie nun den Hebel nach unten, um die Klemme zu öffnen, und laden Sie den Chip vorsichtig in das Chipnest.

Setzen Sie anschließend ein neues Ladeschild in den Lader ein. Schieben Sie es vorsichtig an, um sicherzustellen, dass es fest sitzt. Übertragen Sie nun 14,5 Mikroliter Reaktionsgemisch auf das Lademesser. Machen Sie keine Luftblasen und lenken Sie die Klinge nicht ab. Drücken Sie dann die schwarze "Loading"-Taste, um das Volumen auf den Chip zu verteilen.

Es ist wichtig, dass Sie sicherstellen, dass die Ladeklinge an Ort und Stelle ist. Drücken Sie die Pipette dann beim Befüllen der Klinge nicht bis zum zweiten Anschlag, um Blasenbildung zu vermeiden. Lenken Sie die Klinge auch nicht mit der Spitze ab.

Fahren Sie fort, indem Sie mit der Spritze etwa 20 Tropfen Tauchflüssigkeit auf die Chipoberfläche geben. Achten Sie darauf, die Oberfläche nicht mit der Spitze zu berühren, und bedecken Sie die Oberfläche vollständig, ohne sie zu überlaufen. Drehen Sie dann den Rotorarm, sodass der Deckel mit dem Chip in Kontakt kommt, und drücken Sie ihn 15 Sekunden lang nach unten. Drücken Sie dann die Deckeltaste, um den Chip freizugeben und den Ladearm wieder in seine Ruheposition zu bringen. Öffnen Sie nun die Klemme und halten Sie den zusammengebauten Chip in einem 45-Grad-Winkel, um die Immersionsflüssigkeit vorsichtig über eine Spritze durch die Einfüllöffnung abzugeben. Drehen Sie dann den Chip leicht, um Luftblasen zu entfernen, und entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit mit dem sterilen Tuch.

Vermeiden Sie es, Immersionsflüssigkeit am Rand der Spitze zu verschütten. Entfernen Sie in diesem Fall vorsichtig den Überschuss, bevor Sie ihn versiegeln.

Verschließen Sie abschließend das Chipgehäuse, indem Sie das Etikett auf dem Deckel vorsichtig abziehen und dann die Einfüllöffnung für mindestens 5 Sekunden blockieren. Verwenden Sie den Chip nun innerhalb von zwei Stunden und lagern Sie ihn bis dahin im Dunkeln.

Um die Reaktion einzurichten, öffnen Sie den Deckel und installieren Sie die Adapter an beiden Blöcken, auch wenn ein einzelner Block verwendet wird. Platzieren Sie dann einen Chip auf den Probenblöcken und richten Sie die Füllöffnungen zur Vorderseite des Thermocyclers aus und heben Sie die Öffnung leicht an. Verwende leere Chips, um die beiden Blöcke auszubalancieren.

Legen Sie anschließend das Wärmeleitpad über das Setup, um die Chips vollständig abzudecken. Programmieren Sie dann die Zyklen, schließen Sie den Deckel und starten Sie die Reaktion.

Wenn die Reaktion beendet ist, schalten Sie den Thermocycler aus, entfernen Sie die Wärmeleitpads und entfernen Sie dann die Chips. Lassen Sie die Chips mindestens 10 Minuten im Dunkeln auf Raumtemperatur auftauen und analysieren Sie sie innerhalb einer Stunde. Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Isopropanol, während Sie sie auf Undichtigkeiten oder andere Probleme untersuchen.

Um die Daten zu speichern, stecken Sie einen USB-Speicherstick in das Detektorsystem, auf dem die Daten gespeichert werden können. Öffnen Sie dann die Chip-Schublade des Detektorsystems und legen Sie den Chip mit der bedruckten Seite nach oben ein. Schließen Sie das Fach und warten Sie 30 Sekunden, bis die Daten verarbeitet wurden. Entfernen Sie dann den Chip und wiederholen Sie den Vorgang für den nächsten Chip.

Verschieben Sie anschließend den USB-Stick vom Detektor auf einen Computer und übertragen Sie die Dateien. Öffnen Sie die Cloud-basierte Software, erstellen Sie ein Projekt und importieren Sie alle Datendateien für die gewünschten Chips. Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Definierte Chips" den verwendeten Farbstoff und Assay aus. Stellen Sie fest, ob der Chip akzeptabel ist, indem Sie ihn auf der Registerkarte "Daten überprüfen" visualisieren. Wenn die Probe gut geladen wurde, sollten mindestens 13.000 Punkte nutzbar sein.

Schauen Sie sich als Nächstes das Streudiagramm für den ausgewählten Chip an. Wenden Sie dort einen Schwellenwert an, der durch den Assay-Typ definiert ist. Für das Fluoresceinamidit-Reporterfarbstoffsignal wird ein Schwellenwert von 6.000 verwendet. Entfernen Sie nun alle zweifelhaften Signale, die zu Fehlalarmen führen könnten. Wählen Sie die fragwürdige Stelle im Streudiagramm mit dem "Lasso"-Werkzeug aus und wählen Sie die Option "Unbestimmt".

Alle verbleibenden positiven Spots deuten auf das Vorhandensein von cDNA-Kopien des analysierten seltenen Ziels hin.