Quantifizierung von Entzündungsmediatoren in infizierten menschlichen Gewebezellen

Während einer Infektion setzen aktivierte Lymphozyten Entzündungsmediatoren – Zytokine – frei, um eine Immunantwort auszulösen.

Um Entzündungsmediatoren in einem infizierten Gewebe zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer Zellsuspension, die Immunzellen aus menschlichem Lungengewebe enthält.

Inkubieren Sie die Zellen mit Haemophilus influenzae – einem pathogenen Bakterium der Atemwege. Die Oberflächenantigene der Bakterien interagieren mit Mustererkennungsrezeptoren auf phagozytischen Immunzellen. Dies initiiert die Internalisierung des Bakteriums, die Verarbeitung zu kleineren Peptiden und die Präsentation des Peptids durch das Hauptmolekül des Histokompatibilitätskomplexes.

Das Antigen-MHC-II-Molekül auf phagozytären Zellen bindet über die T-Zell-Rezeptoren an T-Lymphozyten, zusammen mit co-stimulatorischen Rezeptorinteraktionen, was zu einer Aktivierung der T-Lymphozyten und der Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen führt.

Behandeln Sie die Zellen mit Golgi-Blockern, die die Freisetzung von Zytokinen beeinträchtigen und deren Ansammlung in den Zellen verursachen. Waschen Sie die Zellen mit einem Blockierungspuffer, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.

Färben Sie die Zellsuspension mit einer Mischung aus Fluorophor-markierten Antikörpern, die spezifisch an menschliche T-Lymphozyten-Oberflächenmarker binden und so die Markierung der Lymphozyten ermöglichen.

Fixieren Sie die Zellen und permeabilisieren Sie sie mit einem porenbildenden Tensid. Inkubieren Sie die permeabilisierten Zellen mit Fluorophor-markierten Anti-Zytokin-Antikörpern, die in die Zellen eindringen und mit spezifischen Zytokinen interagieren.

Messen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie das Zytokin-Fluoreszenzsignal in markierten Lymphozyten, das mit der Produktion von Entzündungsmediatoren aufgrund einer bakteriellen Infektion korreliert.

Schneiden Sie etwa 20 bis 40 Gramm der Lobektomieprobe in 3- bis 5-Kubikmillimeter-Abschnitte. Legen Sie sie in eine sterile 50-Mikroliter-Kammer und fragmentieren Sie das Gewebe mechanisch mit einem geeigneten Disaggregator. Nach der Gewebedisaggregation lysieren Sie die roten Blutkörperchen wie gezeigt und resuspendieren Sie die Zellen in sterilem RPMI. Filtern Sie dann die Zellen durch ein 100 Mikrometer großes steriles Nylonnetz und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.

Für den Infektionsassay resuspendieren Sie die Lungenzellen in RPMI auf eine Endkonzentration von 4 Millionen Zellen pro Milliliter und Röhrchen. Infizieren Sie dann die Zellen mit einem MOI von 100 Bakterien pro Zelle. Lösen Sie die Kappe um eine halbe Umdrehung, um den Gastransfer in die Rohre zu ermöglichen. Legen Sie die Zellen in den Röhrenrotator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius, während sie sich mit 12 U/min drehen. Eine Stunde nach der Stimulation fügen Sie Brefeldin A hinzu, um den extrazellulären Export von Zytokinen zu verhindern, und inkubieren Sie die Zellsuspensionen für weitere 16 bis 22 Stunden mit Rotation.

Waschen Sie die Zellsuspension am nächsten Tag mit 500 Mikrolitern PBS, das 1 % Rinderserumalbumin und 0,01 % Natriumazid enthält. Bleiben Sie anschließend eine Stunde lang in der Zellsuspension für spezifische Oberflächenmarker der menschlichen Lymphozytenzellen. Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und fixieren und permeabilisieren Sie sie, wie zuvor gezeigt. Inkubieren Sie anschließend die Zellen eine Stunde lang mit intrazellulären Zytokin-färbenden Antikörpern. Waschen Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern PBS, bevor Sie die Daten auf einem Durchflusszytometer erfassen.