Quantifizierung von bioaktiven Typ-I-Interferonen mit Hilfe eines sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Reporter-Assays

Um die bioaktiven Typ-I-Interferone wie Interferon-alpha und Interferon-beta in einer Testprobe zu quantifizieren, wird eine Multi-Well-Platte mit manipulierten Reporterzellen entnommen. Diese Zellen exprimieren das sezernierte embryonale alkalische Phosphatase, SEAP, Reportergen unter der Kontrolle des Interferon-alpha- und beta-induzierbaren Promotors.

Geben Sie die Testprobe mit einer unbekannten Typ-I-Interferonkonzentration hinzu. Pipettieren Sie einen Bereich von humanen Typ-I-Interferon-Konzentrationen in andere Vertiefungen, die als Standardkontrollen dienen. Ausbrüten.

Typ-I-Interferon bindet in der Testvertiefung an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor und aktiviert so die Januskinasen. Diese Proteinkinasen phosphorylieren Signalwandler und Aktivatoren der Transkription, STAT, Proteine, die dimerisieren und einen Komplex mit einem spezifischen Interferon-Regulationsfaktor bilden.

Beim Eintritt in den Zellkern bindet der Komplex an eine spezifische DNA-Sequenz im Interferon-alpha- und beta-induzierbaren Promotor, aktiviert die Transkription des SEAP-Gens und produziert die SEAP-Enzyme, die in das Medium sezerniert werden.

Übertragen Sie das SEAP-haltige Medium in Multi-Well-Plattenvertiefungen mit einem SEAP-spezifischen Substrat. SEAP hydrolysiert das rosa Substrat und erzeugt ein violett-blaues Produkt.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption des Produkts in den Test- und Standard-Wells, die auf die SEAP-Werte und die Typ-I-Interferonkonzentration hinweisen.

Anhand der aufgetragenen Standard-Typ-I-Interferon-Kurve ist die Konzentration des bioaktiven Typ-I-Interferons in der Prüfprobe zu bestimmen.

Um bioaktives Typ-I-Interferon mit HEK-Blue-Interferon-alpha/beta-Reporterzellen zu messen, werden die Reporterzellen zunächst mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden auf ein Endvolumen von 180 Mikrolitern plattiert. Geben Sie dann 20 Mikroliter des gerade geernteten Co-Kultur-Überstands in doppelter Ausführung in jede Vertiefung. Fügen Sie eine Reihe interner Standardkontrollen hinzu und inkubieren Sie die Platte 18 bis 22 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um den Gehalt an alkalischer Phosphatase zu bestimmen, der aus den Reporterzellen freigesetzt wird, geben Sie 180 Mikroliter QUANTI-Blue-Lösung in jede Vertiefung einer neuen flachen Bodenplatte. Geben Sie dann 20 Mikroliter der induzierten HEK-blauen Interferon-alpha/beta-Zellüberstände in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis sich in den Standard-Interferon-Kontrollwells eine Farbe entwickelt.

Die QUANTI-Blue-Lösung wechselt in Gegenwart des Enzyms von rosa zu violett-blau. Verwenden Sie schließlich ein Spektralphotometer, um die Konzentrationen der sezernierten alkalischen Phosphatase bei 620 bis 655 Nanometern zu bewerten und die Konzentration von Typ-I-Interferon durch Extrapolation aus dem linearen Teil der Interferon-Standardkurve zu bestimmen.