Quantifizierung von bioaktiven Typ-I-Interferonen mit Hilfe eines sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Reporter-Assays
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 3:11 Min. • July 8th, 2025
Um die bioaktiven Typ-I-Interferone wie Interferon-alpha und Interferon-beta in einer Testprobe zu quantifizieren, wird eine Multi-Well-Platte mit manipulierten Reporterzellen entnommen. Diese Zellen exprimieren das sezernierte embryonale alkalische Phosphatase, SEAP, Reportergen unter der Kontrolle des Interferon-alpha- und beta-induzierbaren Promotors.
Geben Sie die Testprobe mit einer unbekannten Typ-I-Interferonkonzentration hinzu. Pipettieren Sie einen Bereich von humanen Typ-I-Interferon-Konzentrationen in andere Vertiefungen, die als Standardkontrollen dienen. Ausbrüten.
Typ-I-Interferon bindet in der Testvertiefung an einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor und aktiviert so die Januskinasen. Diese Proteinkinasen phosphorylieren Signalwandler und Aktivatoren der Transkription, STAT, Proteine, die dimerisieren und einen Komplex mit einem spezifischen Interferon-Regulationsfaktor bilden.
Beim Eintritt in den Zellkern bindet der Komplex an eine spezifische DNA-Sequenz im Interferon-alpha- und beta-induzierbaren Promotor, aktiviert die Transkription des SEAP-Gens und produziert die SEAP-Enzyme, die in das Medium sezerniert werden.
Übertragen Sie das SEAP-haltige Medium in Multi-Well-Plattenvertiefungen mit einem SEAP-spezifischen Substrat. SEAP hydrolysiert das rosa Substrat und erzeugt ein violett-blaues Produkt.
Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption des Produkts in den Test- und Standard-Wells, die auf die SEAP-Werte und die Typ-I-Interferonkonzentration hinweisen.
Anhand der aufgetragenen Standard-Typ-I-Interferon-Kurve ist die Konzentration des bioaktiven Typ-I-Interferons in der Prüfprobe zu bestimmen.
Um bioaktives Typ-I-Interferon mit HEK-Blue-Interferon-alpha/beta-Reporterzellen zu messen, werden die Reporterzellen zunächst mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden auf ein Endvolumen von 180 Mikrolitern plattiert. Geben Sie dann 20 Mikroliter des gerade geernteten Co-Kultur-Überstands in doppelter Ausführung in jede Vertiefung. Fügen Sie eine Reihe interner Standardkontrollen hinzu und inkubieren Sie die Platte 18 bis 22 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Um den Gehalt an alkalischer Phosphatase zu bestimmen, der aus den Reporterzellen freigesetzt wird, geben Sie 180 Mikroliter QUANTI-Blue-Lösung in jede Vertiefung einer neuen flachen Bodenplatte. Geben Sie dann 20 Mikroliter der induzierten HEK-blauen Interferon-alpha/beta-Zellüberstände in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis sich in den Standard-Interferon-Kontrollwells eine Farbe entwickelt.
Die QUANTI-Blue-Lösung wechselt in Gegenwart des Enzyms von rosa zu violett-blau. Verwenden Sie schließlich ein Spektralphotometer, um die Konzentrationen der sezernierten alkalischen Phosphatase bei 620 bis 655 Nanometern zu bewerten und die Konzentration von Typ-I-Interferon durch Extrapolation aus dem linearen Teil der Interferon-Standardkurve zu bestimmen.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung bioaktiver Interferone vom Typ I unter Verwendung genetisch veränderter Reporterkrebszellen beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Messung der sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase (SEAP), um die Interferonkonzentrationen in Testproben zu bestimmen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Biochemie
Hintergrund
- Typ-I-Interferone spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunantwort.
- Die Quantifizierung dieser Interferone ist entscheidend, um ihre biologischen Funktionen zu verstehen.
- Reporter-Assays stellen eine empfindliche Methode zur Messung der Interferonaktivität dar.
- SEAP ist ein häufig verwendetes Reportergen in solchen Assays.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Quantifizierung bioaktiver Typ-I-Interferone.
- Nutzung von gentechnisch veränderten Reporterkrebszellen zur Verbesserung der Empfindlichkeit.
- Einrichtung einer Standardkurve zur genauen Bestimmung der Interferonkonzentrationen.
Verwendete Methoden
- Es wurden gentechnisch veränderte Reporterkrebszellen, die SEAP exprimieren, verwendet.
- Testproben wurden mit den Reporterkrebszellen inkubiert, um die Transkription von SEAP zu aktivieren.
- Die SEAP-Konzentrationen wurden mittels einer farbmetrischen Assay-Methode mit einem spezifischen Substrat gemessen.
- Die Extinktionswerte wurden gemessen, um anhand einer Standardkurve die Interferonkonzentrationen zu bestimmen.
Hauptergebnisse
- Die Methode quantifizierte erfolgreich Typ-I-Interferone in Testproben.
- SEAP-Spiegel korrelierten gut mit bekannten Konzentrationen von Interferonen.
- Der Test zeigte eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität für Typ-I-Interferone.
- Die Ergebnisse waren über mehrere Experimente hinweg reproduzierbar.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Test ist ein wertvolles Werkzeug zur Messung bioaktiver Interferone vom Typ I.
- Diese Methode kann bei der Erforschung von Immunantworten und therapeutischen Interventionen hilfreich sein.
- Zukünftige Anwendungen könnten Untersuchungen der Interferonsignalwege umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung bioaktiver Interferone vom Typ I ist entscheidend für die Beurteilung der Aktivierung der angeborenen Immunität bei der Entdeckung antiviraler und immunmodulatorischer Wirkstoffe. Dieser berichterstattenden Assay ermöglicht eine mechanistische Entlastung durch quantitative, wegspezifische Messung der Interferonsignalübertragung. Er unterstützt die Zielvalidierung und die Identifizierung führender Substanzen in der frühen Entdeckungsphase, indem er die Wirkung von Verbindungen mit funktionellen Interferonantworten verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst die funktionelle Interferonaktivität, um Zielstrukturen in angeborenen Immunwegen zu validieren.
- Operationaler Wert: Verwendet gentechnisch veränderte Reporterkrebszellen für einen empfindlichen und spezifischen Nachweis von Interferon-alpha und -beta.
- Prädiktiver Wert: Ermöglicht die Beurteilung von interferoninduzierten Reaktionen durch Wirkstoffe für Go/No-Go-Entscheidungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative, farbmetrische Ausgaben, die mit Mikroplatten-Readern für Screening-Kampagnen kompatibel sind.
- Reproduzierbarkeit: Interpolation über die Standardkurve gewährleistet eine konsistente Quantifizierung über Experimente und Labore hinweg.
- Skalierbarkeit: Das Mehrmuldenformat ermöglicht das mittelhochdurchsatzfähige Screening immunmodulatorischer Substanzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet in-vitro-Interferon-Messungen mit präklinischen Modellen der Immunaktivierung.
- Biomarker-Abstimmung: Bietet eine pharmakodynamische Auswertung zur Modulation des Interferon-Signalwegs in der Therapieentwicklung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen zu Sicherheits- und Wirksamkeitsprofilen im Zusammenhang mit Zytokinen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test passt in die Entdeckungskette von der Zielvalidierung bis zur Leitstruktur-Optimierung und liefert funktionelle Daten, die die Priorisierung in der frühen Phase unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Interferonweg-Aktivierung durch Testverbindungen oder Biologika.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte zur Bestätigung von Hits und zur Entwicklung von SAR.
- Analytik: Ermöglicht die Interpolation von Interferonkonzentrationen aus Standardkurven für datengestützte Vergleiche.
- Translationale Forschung: Verbindet zelluläre Interferonantworten mit immunologischen In-vivo-Ergebnissen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Quantifizierung von Interferonen über therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert mechanistische Einblicke in die Interferonsignalgebung mit hoher Spezifität für bioaktive Isoformen.
- Operationaler Wert: Standardisiertes Protokoll mit definierten Inkubations- und Nachweisschritten gewährleistet Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Erhöht das Vertrauen in Daten zur Zielstrukturnbindung und Pfadmodulation.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikobasierte Priorisierung von Kandidaten anhand interferonbezogener Aktivität.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur und Zytokinsignalisierungsassays.
- Benötigt einen Mikroplattenreader, der Absorptionsmessungen im Bereich von 620–655 nm ermöglicht.
- Setzt eine Standardisierung der Interferon-Kontrollen und der Inkubationszeiten des SEAP-Substrats voraus.
- Die Anpassung an primäre Immunzellen kann eine Optimierung der Reporterempfindlichkeit erfordern.
- Auf Typ-I-Interferone beschränkt; Multiplex-Analysen würden alternative Reportersysteme benötigen.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026