Name: Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie einen hochdurchsatzfähigen qRT-PCR-Assay zur Analyse von Typ-I- und Typ-III-Interferon-Expressionssignaturen. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung einzelner Basenpaare zwischen ähnlichen Transkripten.

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Diese Arbeit wurde vom CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency Vereinbarung YI-AI-6153-01, FDA / CBER intra-Fonds und der FDA Medical Gegen Initiative unterstützt. TCT, MNB, VPM, LMS und KDK wurden von einer Berufung in die Forschung Beteiligungsprogramm in der Mitte für Biologics Evaluation und Forschung durch den Oak Ridge Institut für Pädagogik der Naturwissenschaften durch eine Interagency Abkommen zwischen den USA Departmen für Energie und den USA verwaltet unterstützt Food and Drug Administration.

1. Vorbereitung der Standardserienverdünnungen (3A) HINWEIS: Serienverdünnungsreihe linearisierte Plasmide, die die Sequenzen von einer Pr / Pb-Set ausgerichtet sind als quantitative Standards für die qRT-PCR-Assay verwendet. Jeder Standard-Verdünnungssatz für die IFN-Subtypen enthält genügend Volumen, um 90 Testplatten laufen. Die vier Punkte der Standardverdünnungskurve für den Assay verwendet werden ausgewählt, um Ct-Werte aus einem Bereich von 20 bis 32 (Tabelle 3). <ol><li> Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren Sie das Standard (50 pM) und Lachssperma-DNA (ssDNA, 10 mg / ml) Stammlösungen. </li><li> Bereiten Sie die ssDNA / Wasser-Gemisch für die 17 Standardverdünnungssätze durch Mischen von 51 ul von ssDNA mit 20,3 ml Wasser. </li><li> Beschriften Sie eine 8er PCR-Streifen für eine Standardverdünnungssatz. HINWEIS: Vorbereitung der Standardverdünnungsreihen aus den Stammlösungen wird 2-3 Stunden dauern. </li><li> Dispense 190 ul der ssDNA / Wasser-Gemisch in die first Rohr in dem Streifen und 180 ul von ssDNA / Wasser-Gemisch auf die verbleibenden fünf Röhrchen. </li><li> Führen Sie eine 1:20 Verdünnung durch die Übertragung von 10 &amp; mgr; l aus dem 50 pM Standard Lager mit dem Rohr mit 190 ul der ssDNA / Wasser, mischen; Wirbel und schnell Zentrifugieren Sie die PCR-Streifen. </li><li> Durchführen einer 1:10 Verdünnung durch Übertragung 20 &amp; mgr; l aus dem zuletzt verdünnt Rohr zum nächsten Rohr in der Reihe; Wirbel und schnell Zentrifugieren Sie die PCR-Streifen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis zum letzten Rohr in der Verdünnungsreihe hat den Standard aufgenommen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,7 für jeden Standard. </li></ol> Siehe Tabelle 3 unten 2. Herstellung der Primer / Probe (Pr / Pb) und Leerwert-Kontrolle (NTC) Funktion Stock Mixes (3B) HINWEIS: Jede 1,7 ml Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager und 128,6 ul Leerwert-Kontrolle (NTC) Arbeits Lager Mix 30 Assay-Platten zu machen. <ol><li> Bereiten Sie die Pr / Pb eingestellt Arbeitsstammmischungen. NICHTE: Herstellung des Pr / Pb-Set und NTC Arbeitsstammmischungen aus den Stammlösungen wird 2-3 Stunden dauern. <ol><li> Resuspendieren der Primer und Sonden bei 100 uM mit ultrareinem Wasser für die Herstellung von Stammlösungen. </li><li> Labels bis siebzehn 2-ml-Röhrchen; eine für jede Pr / Pb-Set im Test enthalten. </li><li> Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren der Primer (100 uM), Sonden (100 uM) und ssDNA (10 mg / ml) Stammlösungen. </li><li> Add 2 ul von ssDNA zu jedem Rohr mit dem 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Fügen Sie den entsprechenden Forward-Primer, Reverse-Primer und die Sonde auf jede Pr / Pb eingestellt Arbeitsstammrohr. Siehe Tabelle 1 für die Pr / Pb-Sets Targeting humanen IFN-Subtypen und Tabelle 2 für die Rhesusaffen Pr / Pb-Sets. Fügen Sie Wasser, um die Lautstärke der einzelnen Pr bringen / Pb eingestellt Arbeitsstammrohr zu 200 ul. ANMERKUNG: Das Volumen von Primern, Sonde und Wasser hinzufügen, hängt von der erforderlichen endgültigen Reaktions Konzentration eines Pr / Pbgesetzt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die NTC Arbeitsstammmischungen. <ol><li> Beschriften Sie zwei 5-tube PCR-Streifen für die NTC Arbeitsvorräte mischt. </li><li> Übertragen 14,3 ul jeder Pr / Pb auf die entsprechende NTC Arbeits Lager Mischrohr gesetzt. Siehe Tabelle 4 für die Pr / Pb oder Set-Kombinationen für NTC-Brunnen. Wasser In jedem der NTC Arbeits Lager mischt, um das Endvolumen auf 128,6 ul zu bringen. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren, und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln auf Eis oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li></ol></li></ol> Siehe Tabelle 4 unten <ol start="3"><li> Verdünnen Sie die Pr / Pb eingestellt Arbeitsvorräte. <ol><li> Nach der Entnahme einer Teilmenge der Pr / Pb-Sets für den NTC arbeiten Brühmassen erforderlich, fügen Sie 1,5 ml Wasser, um das Endvolumen jeder Pr / Pb bringen eingestellt Arbeitsstammrohr auf 1,7 ml. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren, und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln auf Eis oder bei -20 ° C für längere Lagerung. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Vorbereitung der 384-Well-Assayplatten mit Hilfe der automatischen Mehrkanalpipette <ol><li> Bereiten Sie eine 96-Loch-Source-Platte der Pr / Pb-Sets und NTC-Mischungen für Aliquotierung auf 384er Testplatten. HINWEIS: Herstellung der Source-Platte von den Pr / Pb Funktionsweise Brühmassen dauert weniger als 1 Stunde. Jeder 96-Loch-Source-Platte ist genug, um sechs 384er Testplatten (3C) zu machen. <ol><li> Vortex und kurz zentrifugieren die Pr / Pb eingestellt Arbeitsvorräte und NTC Arbeitsstammmischungen. </li><li> Legen Sie eine neue Platte mit 96 Vertiefungen in einem gekühlten 96-Loch-Kühlblock und bezeichnen die Vertiefungen für jede Pr / Pb-Set oder NTC mischen die Brunnen zu erhalten (siehe Abbildung 2). </li><li> Wasser hinzu, bis der 96-Well-Platte mit einer 250 ul elektronischen Mehrkanalpipette: Dispense 66 ul Wasser zu jedem Pr / Pb gesetzt und (mit Ausnahme der 4 Vertiefungen für Ziel 17). Dispense 82,5 ul Wasser zu den 4 Ziel 17 Brunnen. Dispense 27,5 ul Wasser zu jedem NTC gut mischen. </li&gt; <li> Fügen Sie die richtige Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die vorgesehenen Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen: Dispense 54 ul der korrekten Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die bezeichneten Pr / Pb-Set Brunnen (mit Ausnahme der 4 Vertiefungen für Ziel 17). Dispense 67,5 ul der Ziel 17 Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager an die vorgesehenen Ziel 17 Pr / Pb-Set Brunnen. In 22,5 ul der richtigen NTC Arbeits Lager Mix auf die Kavitäten pipettieren. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Klebefolie Dichtung und Zentrifuge für 1 min bei 700 xg, um sicherzustellen, der Inhalt am Boden der Wells. </li><li> Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in der Vortex-Mischer mit einer 96-Well-Platten-Adapter und mischen Sie für 1 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute. Zentrifuge die Platte mit 96 Vertiefungen 5 min bei 700 x g. </li><li> Lagern Sie die 96-well Platte Quelle in der Dunkelheit bei 4 ° C bei Verwendung am selben Tag, sonst bei -20 ° C bis zur Verwendung zu lagern. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die 384er Testplatten, indem Sie den Pr / Pb-Sets mit Hilfe der automatischen Mehrkanalpipette. HINWEIS: Herstellung von sechs Testplatten aus der 96-Well-Quellenplatte wird 3-4 Stunden dauern. <ol><li> Vor dem Herstellen von Druckplatten, vorge Kühlen der Kühlnest bis 4 ° C vorheizen den Plattenverdampfer bis 125 ° C und die untere Heizblock auf 80 ° C mit Luftstrom bläst zwischen 20-25 Litern pro Minute (LPM). </li><li> Schalten Sie den automatischen Mehrkanalpipette und öffnen Sie das Protokoll für die Herstellung von IFN-Testplatten durch Doppelklick auf das Programmsymbol. </li><li> Zur Einrichtung der Plattform, legen Sie einen vollständig gefüllt Pipettenspitze Box in Plattform Position 1, der 96-Loch-Source-Platte in Position 4 und eine neue 384-Well-Platte in Position 6. Starten Sie den Lauf durch Drücken der Play-Taste. HINWEIS: Nach Abschluss eines Durchlaufs, jede Vertiefung werden 5 ul Pr / Pb-Mix enthalten. HINWEIS: pro Loch der 384er Testplatte Die endgültige Höhe der ssDNA hinzugefügt 0,025 &amp; mgr; g. </li><li> Klopfen Sie leicht die 384er Testplatte auf eine ebene Fläche, um Flüssigkeiten zu gewährleisten sind am Boden der Vertiefungen und wenden einen KlebstoffPlattendichtung. </li><li> Zentrifuge die Platte für 1 min bei 700 x g. Die Klebeplatte Dichtung entfernen, setzen Sie den 384er Testplatte in die Tellertrockner und positionieren Sie den 384er vielfältigen direkt über den Brunnen. </li><li> Wenn der Inhalt des 384-Well-Assayplatte zu trocken ist, eine neue Klebeplatte Dichtung, in Folie wickeln, Etikett, und speichern im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. HINWEIS: Die Platten können bei 4 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3-3.2.6 bis 6 x 384er Testplatten werden vorbereitet oder die Flüssigkeit im 96-Well-Platte Quelle erschöpft ist. </li><li> Schalten Sie die Kühlnest, schließen Sie die Software, und schalten Sie den automatischen Mehrkanalpipette. Schalten Sie den Tellertrockner. </li></ol></li></ol> 4. Laden und Ausführen eines 384er Testplatte <ol><li> Bereiten Sie zwei Housekeeping-Gen (HKG) und Mischungen, die der Pr / Pb-Set für eine HKG, ssDNA, PCR-Mastermix und Wasser bestehen, zu einem getrockneten 384-Well-Assayplatte (hinzugefügt werden <strong&gt; 3D). HINWEIS: Die Herstellung der Mischungen und Laden der Testplatte wird 1-2 Stunden dauern. Ausführen der Testplatte wird weniger als 2 Stunden dauern. <ol><li> Beschriften Sie eine 1,5-ml-Röhrchen für jeden HKG-Mix. </li><li> Verdünne 2 ul ssDNA (10 mg / ml) mit 84,9 &amp; mgr; l Wasser. Add 2 ul der verdünnten ssDNA, 11,8 ul Wasser, 23 ul des Master-Mix und 9,2 ul der richtigen 20x HKG Pr / Pr zu jedem Rohr, Wirbel, und kurz zentrifugieren gesetzt. </li><li> Verwenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) und Ubiquitin C (UBC) als die HKG für das menschliche Assay (siehe Material Table). Verwenden GAPDH und 18S-rRNA als HKG für die Rhesus-Assay. HINWEIS: Die zur Durchführung des Assays HKG sind flexibel und sollte die für den Zelltyp geeigneten Genen widerspiegeln getestet GAPDH sind UBC und 18S Beispiele für häufig verwendete HKG;. andere HKG besser geeignet sein können. </li></ol></li><li> Probe vorbereiten und positiHab auch kontrollieren Mischungen, die von der Probe oder positive Kontrolle cDNA, Master-Mix und Wasser bestehen, zu einem getrockneten 384-Well-Assayplatte hinzugefügt werden. Probe vorbereiten und die positive Kontrolle Mischungen in genug Quantität zu 21 Plattenvertiefungen (3D) zu verzichten. <ol><li> Vor der cDNA-Synthese, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die RNA-Proben mit einem DNase-Verdau Schritt vorzubereiten. </li><li> Vorbereitung der Proben und der positiven Kontrolle im Voraus aus der cDNA-Synthese von mindestens 500 ng RNA, gefolgt von einer Behandlung mit RNase H (Endvolumen von 24 &amp; mgr; l für jede Probe) nach den Anweisungen des Herstellers. Bewahren Sie die vorbereitete cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung. Thaw, Wirbel, und kurz zentrifugieren die Probe cDNA. </li><li> In 78,8 ul des Master-Mix und 54,8 ul Wasser zu jeweils 24 ul-Probe und der positiven Kontrolle Rohr. </li><li> Vortex und kurz zentrifugiert werden die Rohre. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Standards und NTC gut mischt, conbestehend aus Master-Mix und Wasser zu einem getrockneten 384-well Testplatte (3D) zugesetzt werden. Für die Standards gut mischen, fügen Sie 165 ul Wasser und 275 ul der Master-Mix in einem 1,5-ml-Tube. Für die NTC gut mischen, fügen 52,5 ul Wasser auf 52,5 ul des Master-Mix in einem 1,5-ml-Tube. Vortex und kurz zentrifugiert werden die Rohre. </li><li> Bereiten Sie einen getrockneten 384-Well-Assayplatte zum Laden der Mischungen und Proben. <ol><li> Entfernen eines getrockneten 384er Testplatte von 4 ° C und Zentrifuge für 1 min bei 700 x g. </li><li> Legen Sie die Platte auf einer gekühlten 384-Well-Kühlblock, der Klebeplatte Dichtung zu entfernen und einen Überblick über die Vertiefungen der Platte zu bestimmen, wo die verschiedenen Mischungen und Proben pipettiert werden (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Laden Sie die 384er Testplatte mit Standard-Mischung gut, Normen, NTC gut mischen, Muster, Positivkontrolle und HKG-Mix (3E). Vortex und kurz zentrifugieren alle Lösungen vor der Abgabe an die Platte. <ol><li> Dispense 6 ul der Standards auch zu jedem Standard-mischen Sie gut mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Dispense 1,5 ul der richtigen Standardverdünnungsreihen, gut mit dem 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette die bezeichnet. </li><li> Dispense 7,5 ul des NTC gut aufeinander NTC mischen gut mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Verzichtet werden 7,5 ul der Probe auf die Kavitäten mit 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette. Dispense 2,5 ul der HKG Pr / Pb oder vermischt, um die Kavitäten mit 12,5 ul elektronischen Mehrkanalpipette. </li><li> Füllen Sie alle leeren Wells mit 7,5 ul der übrig gebliebenen Wasser und Master-Mix Mischung mit dem 30 ul elektronischen Mehrkanalpipette; 7,5 ul Wasser allein wird auch funktionieren. </li><li> Dichten den 384er Assay-Platte mit dem optischen Klebefolie und Zentrifuge für 1 min bei 700 x g. Mischen Sie den verschlossenen 384-Well-Platte in den Wirbelmischer für 2 Minuten bei 2600 Umdrehungen pro Minuteund Zentrifugieren für 5 min bei 700 x g. </li><li> Das verschlossene 384er Testplatte in der qRT-PCR-Maschine, öffnen Sie die Vorlage für den Test-Layout und beginnt den Lauf. HINWEIS: Die Ergebnisse können als Tabelle oder als Text-Datei zur Analyse exportiert werden. </li><li> Mit den folgenden optimalen Thermocycler Reaktionsbedingungen für den Test: i) 50 ° C für 2 min, ii) 95 ° C für 10 min, iii) 95 ° C für 25 s, iv) 59 ° C für 1 min. Wiederholen Sie die Schritte III und IV für 40 Zyklen. </li><li> Exportieren Sie die Rohdaten von der qRT-PCR-Plattform in ein Tabellenkalkulationsanwendungssoftware. Zeichnen Sie jedes 4-Punkt-Standard als Standardkurve, um die Linearität zu beobachten gesetzt. Führen Analyse durch Berechnung der ΔCq oder Kopienzahl auf der Grundlage der vier Punkt Standardkurven 27. </li></ol></li></ol> Siehe Abbildung 3 unten

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VPM und RLR sind Miterfinder der Technologie zur Messung der Expression von IFN- und IFN-Subtypen und zur Ableitung von Lizenzeinnahmen. Die übrigen Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Dieser Bericht beschreibt Design, Chargenproduktion, und einen Ansatz zur Analyse eines Assays, um die Transkription einer Reihe von sehr ähnlichen Genen in einer Forschungslaborumgebung zu messen. Die Hochdurchsatz-qRT-PCR Assay die hier berichtet misst die IFN- und - λ-Subtypen mit hoher Spezifität. Bei diesem Verfahren werden zwei wichtige Aspekte, die Gestaltung von Pr / Pb-Sets, die zwischen den Mitgliedern einer homologen Genfamilie und der Entwicklung einer Produktionsplattform für die Erstellung von zuverlässigen und konsistenten 384er Testplatten mit den Pr / Pb-Sets vorinstalliert diskriminieren. Die qRT-PCR-Sonden enthalten einen strukturellen (MB) oder chemische (LNA) Ansatz zur Verbesserung ihrer Spezifität 29. Für zwei der Primersätze in Rhesus Assay (Tabelle 2) wurde die Amplifikation Refractory Mutation System (ARMS) in die Primersequenzen enthalten, um die Spezifität weiter zu verbessern 30. Zwar ist es in der Regel am besten, Exon-Exon-Verbindungen zu ENHA Zielnz Spezifität eines qRT-PCR-Reaktion war das nicht möglich, weil der Typ I IFN-Gene fehlen Introns. Daher wird genomische DNA in die PCR-Reaktion amplifiziert werden, und müssen von einer DNase-Behandlung nach der RNA-Extraktion beeinträchtigt werden. Die Zielregion für die Pr / Pb Sets wurde zu den codierenden Regionen der reifen Peptids für jede IFN beschränkt. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den IFN-α-Subtypen, insbesondere der reifen Peptidregion, war es manchmal erforderlich, um die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen, um die Spezifität sicherzustellen. Dies war insbesondere der Fall bei IFN-α17, wo das reife Peptid Transkript hat nur vier einzigartigen Basen, wenn gegen die anderen IFN-α-Subtypen verglichen. Targeting IFN-α17 erforderlich Primern, die Transkripte mehrerer Subtypen binden, Einschränkung Spezifität der Sonde. Als Folge davon wird die PCR-Reaktion anderen Subtypen als IFN-α17 verstärken, wodurch ein wesentlicher Prozentsatz der PCR-Reagenzien und loweri aufwendigng die Amplitude des Fluoreszenzsignals aus der spezifischen Sonde für IFN-α17. Eine zusätzliche Herausforderung zur Gestaltung von sensitiven und spezifischen Pr / Pb-Sets für sehr ähnliche Gene wie dem IFN ist die Möglichkeit, dass die annotierte Sequenzen in der GenBank-Datenbank möglicherweise nicht vollständig oder Informationen zum Zeitpunkt der Konstruktion. Auch dies war eine Herausforderung für die IFN-α17, in denen neu kommentierte Sequenzen nicht perfekt mit der Version der Sequenz in der Datenbank zum Zeitpunkt der Konstruktion anzupassen. Daher bei der Gestaltung Pr / Pb-Sets für Gene, die nicht intensiv untersucht haben, ist es ratsam, regelmäßig die neuesten kommentierte Sequenz eines Zielgens. Schließlich ist es notwendig, sicherzustellen, dass die Pr / Pb Sätze nicht Pseudogene, die transkribiert werden kann, aber nicht umge amplifizieren. Nach der Entwicklung der Pr / Pb-Sets, ist die nächste Herausforderung Optimierung der PCR-Bedingungen von siebzehn verschiedenen Pr / Pb oder setzt auf einer 384-Well-Platte. Transcript Standards sind wich-tant bei der Prüfung der Spezifität eines Pr / Pb-Set und eine wesentliche Rolle bei der Harmonisierung der qRT-PCR-Bedingungen der zahlreichen verschiedenen PCR-Reaktionen. Testen eines Pr / Pb-Set gegen die Niederschrift Standards stellt seine Effizienz und Empfindlichkeit; Plasmide, die sehr ähnliche Pseudo ausdrücken kann notwendig sein, um sicherzustellen, dass die Pr / Pb gesetzt misst selektiv die Transkription des funktionalen Gens. Die Niederschrift Standards bieten auch ein quantitatives Mittel der Analyse (Zahl der Transkripte), zusätzlich zu den semi-quantitative Analyse relativ zu einem Housekeeping-Gen (ΔCq). Roboterkanalpipetten aus einer 96-well Quellenplatte in mehrfache 384-well-Assayplatten verbessert die Genauigkeit und Konsistenz der Plattenzwischenergebnisse. Lachssperma-DNA (ssDNA) als Träger, die stabilisiert und bewahrt die Pr / Pb-Sets für die Langzeitlagerung verwendet, ebenso wie das Trocknen der Reagenzien in den Platten entfallen. Trocknen der Platten verringert auch das Volumen des Reaktionserforderlich für reproduzierbare Ergebnisse, was wiederum bewahrt wertvollen Proben und verringert die Verwendung von teuren Reagenzien. Durch diese Schritte werden Chargen von Platten montiert, die Präzision und Konsistenz für mehr als sechs Monate ist. Nach Plattenherstellung, sind Maßnahmen zur Qualitätskontrolle entscheidend für die Konsistenz einer Charge von Platten zu überprüfen. Zu diesem Zweck sind vier zusätzliche Sätze von Standards auf einer Platte laufen. Die &quot;5-fach Standard&quot; Platte verfolgt Leistung und erzeugt eine Datenmenge, auf die Standards eines Individuums Schild verglichen. Während zehn 10-fache Verdünnungen jeder Standard in Assay-Design verwendet werden, erfordern Platzgründen, dass vier Punkte für die Standardkurve auf jeder Testplatte für die 5-fach Standard-Platte verwendet, und. Zusätzlich sollte eine positive Kontrolle auf jeder Platte enthalten sein, um die Gültigkeit der Platte zu gewährleisten. In der Regel dauert es 3-4 Stunden bis sechs Testplatten von einer Pr / Pb s vorbereitenource Platte; es ist möglich, zwölf Platten an einem einzigen Tag in einem Forschungslabor vorzubereiten. Da jeder humanen IFN-Subtyp Assayplatte untersucht siebzehn Pr / Pb-Sets und kann fünfzehn experimentellen Proben unterzubringen, ein Tag der Montage entsteht ein Stapel von Platten mit einer Kapazität bis zu 3.060 experimentellen Datenpunkte generieren. Rohdaten aus der qRT-PCR-Plattform bearbeitet werden können und mit der Programmierung Skripte in einem Tabellenkalkulationsprogramm-Software, um eine vordefinierte Analysevorlage automatisch füllen montiert. Diese Methode minimiert praktische Dateneingabe, wodurch verhindert wird, Kopierfehler und erlaubt es dem Forscher, auf die Datenanalyse, anstatt Daten Montage konzentrieren. Wie hier beschrieben, kann diese Hochdurch qRT-PCR-Assay verwendet, um die Expression von Interferon-Subtypen in der Human- oder Rhesusaffe Proben zu messen und könnte angepasst werden, dass andere Arten oder homologe Gene-Sets verwendet werden. Die Flexibilität des Plattenlayout kann der Benutzer ändern Primer / Sonde setzt, um die Gene von SchneiderInteresse zu einem bestimmten Zelltyp oder Modellsystem. Dieser Assay kann verwendet werden, um IFN-Expression Signaturen in Zellkulturmodellen studiert Pathogenen oder in Patientenproben im Rahmen des Erkrankungsmodellen gemessen, um die Signalmechanismen, die an der Immunantwort beteiligt aufzuklären.

Typ I und Typ III-Interferone (IFN) sind kritisch bei der Immunantwort auf Viren und anderen pathogenen Stimuli und Zeit in allen Vertebraten 1. Immun- und Nicht-Immun-Zellen zu exprimieren und sezernieren, aber auch reagieren auf, IFN 2. Angeborenen Immunsensoren, wie Toll-like Rezeptoren (TLR), STING und RIG-I, induzieren Typ I und III IFN-Expression bei Erkennung pathogen associated molecular patterns (PAMP) 3,4. Beim Menschen Typ I IFN umfassen IFN-β, -ω, -κ und 12 Subtypen von IFN-α und binden an den IFNAR1 / IFNAR2-Rezeptorkomplex 2,5. Typ III IFN gehören IFN-λ1, -λ2 und -λ3 und auf die IL10RB / IL28RA Rezeptor-Komplex 2 zu binden. Klassisch, Typ I und III IFN binden an ihren jeweiligen Rezeptor-Komplexe, die dann rekrutieren STAT1 / STAT2 Heterodimere und die Transkription der Interferon-stimulierte Gene (ISG) 6. ISG in ein breites Spektrum von Funktionen beteiligt, von antiviralen und antiproliferative Aktivität zur Aktivierung der adaptiven Immunantwort. 7 Die zahlreichen Mechanismen Krankheitserreger entwickelt haben, um zu entgehen, unterlaufen, und die Entführung von Elementen der IFN-Signalweges zeigen die Bedeutung von IFN in der angeborenen Immunantwort 8. Zum Beispiel Vaccinia-Virus exprimiert ein Köder-Rezeptor mit IFNAR1 Homologie, die Typ-I-IFN 9 während ein Yaba-like disease virus sondert ein Glykoprotein, das Typ I und III IFN Proteine ​​hemmt 10 maskiert. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Verteidigung des Wirts werden IFN auch in Krebsüberwachung und einer Reihe von Auto-entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht: Silencing von IFN-Expression in Brustkrebs-Zellen einschränkt immunosurveillance 11 ist eine Überproduktion von IFN-α ein Mechanismus in der Entwicklung von systemischer Lupus erythematodes 12 und fehlerhafte Aktivierung des STING führt zu systemischen Entzündung durch übermäßige Mengen von IFN in STING-assoziierten Vaskulopathie verursacht13. Therapeutisch IFN verwendet werden, um Multiple Sklerose zu behandeln 14, chronischen Virusinfektionen, wie HBV 15 und HCV 16,17 und Krebsarten, wie Haarzellenleukämie 18 und chronischer myeloischer Leukämie 19. Fragen über den Stellenwert von IFN in einem bestimmten physiologischen Prozess zeigen kontinuierlich die allgegenwärtige Natur dieser Zytokin-Familie. Typ-I-IFN, insbesondere der IFN-α-Subtypen, werden häufig als eine Einheit 20-23, anstatt als eine Gruppe von eng verwandten, aber verschiedene Proteine ​​betrachtet. Die Existenz und die Persistenz von mehreren IFN-Spezies einschließlich der IFN-α-Subtypen, ganz der Wirbeltierevolution 24 wird vorgeschlagen, dass zumindest eine Teilmenge dieser Subtypen spezifische oder spezielle Funktionen. Es ist möglich, dass die Festlegung Muster IFN Ausdruck wird zu entschlüsseln und zur Charakterisierung der spezifischen Funktionen von einem oder mehreren der Subtypen 17. Die Herausforderung des Studiums ter I und III IFN Subtypen geben auf ihrer gemeinsamen Sequenzidentität zu Grunde: die zwölf IFN-α-Subtypen teilen&gt; 50% 25 und die IFN-λ-Subtypen Aktien 81-96% 26 ihrer Aminosäuresequenzen. In der beschriebenen qRT-PCR-Assay, Molecular Beacons (MB) und die Locked Nucleic Acid (LNA) Fluoreszenzsonden unterscheiden einzigen Basenpaar Unterschiede zwischen den in hohem Maße ähnlich IFN-Subtyp-Sequenzen und ermöglichen die Charakterisierung der IFN-Expression Signatur. 384-Well-Plattenformat des Assays umfasst sowohl quantitative (transcript-Standards) und semi-quantitative (die Haushaltsgene (HKG)) Maßnahmen, was eine Analyse durch Transkript Kopienzahl und ΔCq auf. Batch Montage, durch automatisierte Mehrkanalpipetten, und die Langzeitlagerung, möglich durch das Trocknen der Primer / Probe (Pr / Pb) erleichtert setzt auf den Platten, erhöhen die Reproduzierbarkeit, Nutzen und Praxistauglichkeit des Assays. Dieses Protokoll beschreibt den Prozesszur Herstellung von 384-Well-qRT-PCR-Platten (1) mit bis zu siebzehn verschiedenen Pr / Pb Sätze Targeting human IFN-Subtypen (Tabelle 1). Pr / Pb eingestellt Arbeits Lager Quelle Platten (Bild 2) werden verwendet, um mehrere 384-Well-Assayplatten in einem Prozess, der mit Hilfe eines Roboter-Mehrkanalpipette automatisiert werden kann vorzubereiten. Während die anfängliche Schwerpunkt lag auf der Erstellung eines Protokolls für das Studium der menschlichen IFN-Expression Signaturen hat sich diese Methode, um Rhesusaffen als auch angewendet. Obwohl die Plattenlayouts sind etwas anders und die Pr / Pb Sätze (Tabelle 2) unterscheiden, ist die Gesamtherstellungsverfahren für die Erstellung der menschlichen und Rhesus-Platten identisch. Mit minimalen Modifikationen des Protokolls kann das Verfahren ausgeführt werden, um für die Entwicklung von Assays für andere Gruppen von eng verwandten Genen zu untersuchen erlaubt. Siehe 1 und 2 unten Siehe Tabellen 1 und 2 Below

<table><tbody><tr><td>0,2 ml PCR-Röhrchenstreifen&nbsp;</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>E0030 124 286</td><td></td></tr><tr><td>12-Kanal 384 Equalizer Elektronische Pipette, 0,5-12,5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-139</td><td>*Eingestellt</td></tr><tr><td>12-Kanal 384 Equalizer Elektronische Pipette, 1-30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-137</td><td>*Eingestellte</td></tr><tr><td>12-Kanal Elektronische Pipette, 5-250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-118</td><td>*Abgekündigtes</td></tr><tr><td>2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, steril</td><td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische 8-Kanal-Pipette, 15-1250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-115</td><td>*Abgekündigte</td></tr><tr><td>Einweg-Reagenzreservoire&nbsp;</td><td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td><td>89094-668</td><td>25-ml-Reservoire mit 2 Teilern</td></tr><tr><td>E-Zentrifuge</td><td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td><td>1090003</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotische 18S rRNA (18S)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs99999901_s1</td><td>Rhesus HKG Primer/Sonden-Set</td></tr><tr><td>Mini-Vortexer</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>Gasdurchlässige selbstklebende Plattendichtung</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB-0580</td><td>Einweg-Plattendichtung, die während des Plattenvorbereitungsprozesses verwendet wird&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td>humaner HKG Primer/Sonde Set</td></tr><tr><td>Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>Rh02621745_g1</td><td>Rhesus HKG Primer/Sonde Set</td></tr><tr><td>Hudson Solo automatisierter Mehrkanal-Pipettierer&nbsp;</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800200</td><td>Modifiziert mit einem 384-Well-Kühlnest</td></tr><tr><td>Linearisierte Plasmide (IFN-Gene)</td><td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Artikel 3000, 3580; wird für Assay-Standards verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>LNA-Inhibitoren</td><td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td><td>Sonderanfertigungsartikel</td><td>500100</td></tr><tr><td>LNA-Sonden</td><td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Materialnummer VC00023</td></tr><tr><td>Matrixfiltrierte Pipettenspitzen, 12,5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-193</td><td></td></tr><tr><td>Matrixfiltrierte Pipettenspitzen, 30 μl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-196</td><td></td></tr><tr><td>Matrix TallTip Pipettenspitzen mit verlängerter Länge, 1.250 μl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-160</td><td></td></tr><tr><td>Matrix TallTip Pipettenspitzen mit verlängerter Länge, 250 μl</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>14-387-152</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 384-Well-Reaktionsplatte mit Barcode</td><td>von Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>für angewandte Biosysteme (Foster City, CA, USA)</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4311971</td><td>Klebefolie, die zum Versiegeln der Platte vor dem qRT-PCR-Lauf verwendet wird&nbsp;</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010 Tabellenkalkulation</td><td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&nbsp;</td><td>Office 2010</td><td>Visual Basic-Programmiersprache</td></tr><tr><td>MixMate Vortex Mixer</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>5353 000.014</td><td>2-dimensionales Platten-Vortex-Gerät</td></tr><tr><td>Molecular Beacon Probes</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Kühler, eisloses Kühlsystem für 96-Well-Platten und PCR-Röhrchen</td><td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Plattentrockner (Verteiler)</td><td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Primer-Sets</td><td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>pUC57 Plasmid DNA</td><td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-freie 1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freie DNase Set (50)</td><td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Roboterspitzen (durchsichtige Spitze, vorsterilisierte Pipettenspitzen)</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>800350-S</td><td></td></tr><tr><td>Lachsspermien-DNA-Lösung</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>SoftLinx Version V</td><td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Software zur Programmierung von Pipettierschritten</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), ohne AmpErase UNG</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>ABgene Klebeplattendichtungen&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB0580</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitin C (UBC)</td><td>Angewandte Biosysteme (Foster City, CA, USA)</td><td>Hs01871556_s1</td><td>Humanes HKG Primer/Sonden-Set</td></tr><tr><td>Verso cDNA-Synthese-Kit</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Water-Ultra Pure</td><td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td><td>351-029-101</td><td></td></tr><tr><td>Zipvap 384 (Heizelement für Plattentrockner)</td><td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td><td>384-109A</td><td>Plattentrockner</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-quantitative echtzeit-rt-pcr-assay zur bestimmung expressionsprofile der typen i und iii interferon-formationsglieder

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

In diesem Bericht wird ein qRT-PCR-Assay für die Analyse von siebzehn humanen IFN-Subtypen in einem 384-Well-Plattenformat beschrieben, das hochspezifische Locked Nucleic Acid (LNA)- und Molecular Beacon (MB)-Sonden, Transkriptstandards, automatisiertes Mehrkanal-Pipettieren und Plattentrocknung enthält. Die Bestimmung der Expression unter den Typ-I-Interferonen (IFN), insbesondere den zwölf IFN-α-Subtypen, ist durch ihre gemeinsame Sequenzidentität begrenzt; Ebenso sind die Sequenzen des Typ-III-IFN, insbesondere IFN-λ2 und -λ3, sehr ähnlich. Dieser Assay bietet ein zuverlässiges, reproduzierbares und relativ kostengünstiges Mittel zur Analyse der Expression der siebzehn Interferon-Subtyp-Transkripte.

Die qRT-PCR-Assay beschrieben implementiert werden, um die Expressionsmuster der Typen I und III IFN in einer Vielzahl von Zelltypen und Kontexte zu analysieren. So wurden beispielsweise menschlichen Typ I und III IFN Expression Signaturen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 6 Spendern stimuliert mit TLR-Liganden untersucht; Poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml), Imiquimod (10 uM) und CpG-Oligonukleotide (1 uM) (Figur 4). Die Daten wurden unter Verwendung eines Tabellenkalkulationsanwendungsprogramm analysiert und als Netzdiagramme mit den IFN-α-Subtypen gemß dem phylogenetischen Baum ihrer Proteinsequenz 27 im Uhrzeigersinn angeordnet dargestellt. Die Radardiagramme des menschlichen IFN-Expression in einer Berechnung mit den zwei verschiedenen Analyseverfahren in das Assaydesign integriert logarithmischen Skala dargestellt: absolute Cq Wert HKG (ΔCq) normalisiert, und die Kopienzahl der Vorlage pro Mikrogramm (ug) der Gesamt-RNA . Kopienzahl-Werte werden von der Ergebnisse o berechnet<html> Standardkurve fa Transkript ist. Die Daten zeigen, dass das menschliche IFN-Expression Signaturen von TLR-Agonisten hervorgerufen sind Liganden spezifisch. Siehe Abbildung 4 unten Was die menschliche IFN-Expression Signaturen gezeigt, Ausdruck Unterschriften von Typ I und III IFN in Rhesusaffen waren ebenfalls TLR-Liganden spezifisch. C (50 ug / ml), LPS (10 ug / ml), Imiquimod (10 ug / ml) für 3 Stunden (Figur 5): PBMC von 3 Spendern wurden mit Poly I stimuliert. IFN-Subtyp Ausdruck in unstimulierten Zellen zu Beginn der Studie war gering. C: Eine begrenzte Anzahl von IFN- Subtypen wurden als Reaktion auf LPS und Poly I ausgedrückt. Im Gegensatz dazu IFN-Expression in Reaktion auf Imiquimod war hoch und der Subtyp Ausdruck war breit. Die Expression von IFN-β und IFN-λ1 wurde verbessert, indem alle drei TLR-Agonisten 28. Siehe Abbildung 5 unten immer &quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> Abb. 1: Das Layout für eine 384-Well-Testplatte mit siebzehn Pr / Pb-Sets Zielzahl bezieht sich auf eine Pr / Pb-Set. Die Vierpunkt-Standardkurven (dunkelgrau Dreieck) werden die Spalten 1-5 aufgenommen. Die HKG Pr / Pb Sätze (weißer Hintergrund) werden den Spalten 6 und 7. Die verbleibenden Spalten 8-24 aufgenommen, sind spezifisch für eine der siebzehn Pr / Pb-Sets. Die Proben werden auf Zeilen AP aus den Spalten 6-24 (schwarze Pfeile) zugegeben. Die beiden Bohrungen (O5, P5) am unteren Rand des Spalte 5 erhalten nur Wasser und Master-Mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> Abb. 2: Das Layout für ein 96-Loch-Source-Platte mit siebzehn Pr / Pb-Sets Zielzahl bezieht sich auf eine Pr / Pbgesetzt. Schwarze Pfeile zeigen, wenn ein Pr / Pb-Set ist mit mehreren Vertiefungen gegeben. NTC-Mischungen in die Kavitäten pipettieren (dunkelgrau Hintergrund) aufgenommen. Die beiden Bohrungen (F3, G3) mit diagonalen Linien werden nicht verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> Abbildung 3: Schematische Darstellung der einzelnen Schritte in der qRT-PCR Assay-Protokoll AE Diagramm wählen Teile des Protokolls.. (A) Schritt 1: Herstellung der Standardverdünnungsreihen. (B) Schritt 2: Herstellung von Pr / Pb und NTC Arbeitsstammmischungen. (C) Schritt 3.1: Herstellung einer 96-Well-Platte Arbeitsvorräte der Pr / Pb-Sets und NTC Mischungen. (D) Schritt 4.1-3: Herstellung der Mischungen für das Laden der 384-Well-Testplatte. (Estep 4.5: Laden des 384-Well-Assayplatte. Zeichnungen sind von links oben nach rechts unten zu lesen. Reagenzien für die Interferon (IFN) Assay bei -20 ° C gelagert und sind in der linken Spalte aufgelistet ist; Linien separate Aktionen im Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> Abbildung 4: Das IFN-Expression Signatur in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) menschliche unterscheidet sich in Abhängigkeit von den für die Stimulation verwendeten PBMCs wurden mit TLR-Liganden stimuliert, und RNA wurde nach qRT-PCR-Analyse geerntet TLR-Liganden.. Die geometrischen Mittel der Peak-Antworten zu Poly I: C (25 ug / ml) auf 8 h (rote Quadrate), LPS (10 ng / ml) bei 4 h (grüne Dreiecke), Imiquimod (10 uM) bei 16 h ( lila Diamanten), CpG (1 uM) an16 Stunden (schwarze Kreise), und nicht-stimulierten Kontrolle bei 16 Stunden (blaue Kreise) von 6 Spendern werden in log 10 Skala als Funktion der Ausdruck der HKG UBC ΔCq (links) gezeigt, oder als Kopienzahl pro ug RNA (rechts) . IFN-α-Subtypen werden nach der phylogenetischen Plot der Aminosäuresequenzähnlichkeit geordnet. Diese Zahl wurde ursprünglich in Immunologie und Zellbiologie 27 veröffentlicht. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> Abb. 5: Die Rhesusaffen IFN-Expression Signatur in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) unterscheidet sich in Abhängigkeit von den für die Stimulation von PBMC drei Rhesusaffen (durch das Quadrat, Diamant und Dreieck bezeichnet) verwendet TLR-Liganden wurden aus Vollblut isoliert und C (50 ug / ml) oder Imiquimod (10 ug / ml): mit Lipopolysaccharid (LPS) (10 ug / ml), Poly-I stimuliert. Die Zellen wurden bei 0 h geerntet (open Formen) oder nach 3 h von TLR-Stimulation (geschlossene Form) zur Messung der IFN-Expression. Transcript Ebenen des Typs I, II, und III IFN in log 10 Skala als Funktion der Ausdruck der HKG GAPDH ΔCq (links) oder als Kopiernummer / ug RNA (rechts) angezeigt. Diese Zahl wurde ursprünglich in der Zeitschrift der Interferon und Zytokin-Forschung 28 veröffentlicht. <img alt="Tabelle 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> Tabelle 1:. Menschen IFN Primer / Sonden-Set Sequenzen und Reaktionsinformationen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> Tabelle 2:. Rhesusaffe IFN Primer / Sonden-Set Sequenzen und Reaktionsinformationen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Plasmid-Konzentration (fM) </td></tr><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Standardverdünnung Satz Konzentration Informationen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN Pr / Pb-Sets hinzugefügt </td><td> Wassermenge aufgenommen (ml) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114,3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114,3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: NTC Arbeits Lager mischt Informationen.

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-qRT-PCR-Assay für die Analyse von Typ I und III IFN-Expressionssignaturen. Der Assay unterscheidet Unterschiede zwischen einzelnen Basenpaaren zwischen den sehr ähnlichen Transkripten dieser Gene. Durch die Chargenmontage und das robotergestützte Pipettieren sind die Assays konsistent und reproduzierbar.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, 384-Well-Assayplatten für die Hochdurchsatzanalyse einer stark homologen Gruppe von Genen, wie beispielsweise der Typ-I- und Typ-III-Interferonsubtypen, vorzubereiten und durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Standardverdünnungsreihe hergestellt wird, die zur Durchführung der Assayplatten verwendet wird. Anschließend werden die Primer-Probe- und No-Template-Control-Arbeitsansätze, die zur Herstellung der Platten benötigt werden, vorbereitet.Dann werden die 384-Well-Assayplatten mithilfe eines automatisierten Mehrkanalpipettiersystems vorbereitet und zum Lagern eingeengt. Schließlich werden die 384-Well-Assayplatten durchgeführt und analysiert. Letztendlich kommt der hochdurchsatzfähige quantitative Echtzeit-Einzelstrang-RNA-PCR-Assay zum Einsatz, um Interferon-Expressionsprofile in Zellkultursystemen, bei der Untersuchung von Pathogenen oder in klinischen Proben im Kontext infektiöser oder autoinflammatorischer Erkrankungen zu definieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen R2-PCR unter Verwendung standardmäßiger linearer Sonden oder Cybergreen besteht darin, dass molekulare Sonden in Form von Molekular-Fallen und fluoreszierenden Sonden mit verriegelter Nukleinsäure eingesetzt werden können, um Einzelbasenpaar-Unterschiede zwischen stark ähnlichen Sequenzen zu unterscheiden. Nach dem Auftauen, Vortexen und kurzem Zentrifugieren eines Standards und von Lachssperma- oder S-S-D-N-A bereiten Sie die S-S-D-N-A-Wasser-Mischung für die 17 Standardverdünnungsreihen vor, indem Sie 51 Mikroliter S-S-D-N-A mit 20,3 Millilitern Wasser mischen. Geben Sie 190 Mikroliter der S-S-D-N-A-Wasser-Mischung in das erste Röhrchen eines acht-Röhrchen-PCR-Streifens und 180 Mikroliter in die folgenden fünf Röhrchen.Führen Sie eine Verdünnung im Verhältnis 1:20 durch, indem Sie 10 Mikroliter von der 50 Picomolar Standard-Stammlösung in das Reagenzglas mit 190 Mikrolitern S-S-D-N-A-Wasser-Mischung überführen, vortexen und kurz zentrifugieren. Führen Sie im PCR-Streifen eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 durch, indem Sie 20 Mikroliter aus dem zuletzt verdünnten Reagenzglas in das nächste Reagenzglas der Reihe überführen, vortexen und den PCR-Streifen kurz zentrifugieren. Wiederholen Sie die Verdünnung im Verhältnis 1:10, bis das letzte Reagenzglas der Reihe das Standardpräparat erhalten hat.Nachdem bis zu 17 Zweimilliliter-Röhrchen beschriftet wurden, zwei Mikroliter S-S-D-N-A unter Verwendung von Primern und Sonden, die gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurden, mit einer 12,5-Mikroliter-elektronischen Mehrkanalpipette jedem Röhrchen hinzufügen. Den entsprechenden Vorwärtsprimer, Rückwärtsprimer und die Sonde jedem Primer hinzufügen. Die Arbeitsbestandslösung des Sondensatzes verwenden, um die Mischungen für die Kontrolle ohne Matrize (NTC) herzustellen.Übertragen Sie 14,3 µL jedes Primer-Probe-Sets gemäß dieser Tabelle in das entsprechende NTC-Arbeitsbestandsgemischrohr. Nach dem Entfernen eines Eloqua der für die NTC-Arbeitsbestandsgemische benötigten Primer-Probe-Sets werden 1,5 mL Wasser hinzugefügt, um das Endvolumen jedes Primer-Probe-Sets-Arbeitsbestandsgemischrohrs auf 1,7 mL aufzufüllen. Zur Vorbereitung einer 96-Well-Quellplatte der Primer-Probe-Sets und NTC-Gemische.Platzieren Sie eine neue 96-Well-Platte in einem gekühlten 96-Well-K&uuml;hlblock und kennzeichnen Sie die Vertiefungen mit dem entsprechenden Primer-Probe-Set oder NTC-Mix unter Verwendung einer elektronischen Mehrkanalpipette mit 250 Mikroliter. Geben Sie 66 Mikroliter Wasser zu jedem Primer-Probe-Set hinzu. Dispensieren Sie jeweils 82,5 Mikroliter Wasser in die vier Ziel-17-Vertiefungen.Geben Sie 27,5 µL Wasser in jede Anti-C-Mischung. Als Nächstes fügen Sie 54 µL der korrekten Primer-Proben bei Arbeitskonzentration zu den dafür vorgesehenen Primer-Proben in den Vertiefungen hinzu. Geben Sie 67,5 µL des Ziel-17-Primer-Probe-Arbeitsbestands in die dafür vorgesehenen Ziel-17-Primer-Proben in den Vertiefungen.Fügen Sie 22,5 µL der korrekten NTC-Arbeitsbestandsmischung in die vorgesehenen Vertiefungen hinzu. Versiegeln Sie dann die 96-Loch-Platte mit einem Klebeplattenverschluss und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 700 ×g, um sicherzustellen, dass sich der Inhalt mit dem 96-Loch-Adapter an der Unterseite der Vertiefungen befindet. Stellen Sie die Platte in den Vortexmischer und mischen Sie sie eine Minute lang bei 1000 rpm. Danach die Platte fünf Minuten lang bei 700 × g zentrifugieren. Um die 384-Well-Assayplatten vorzubereiten, schalten Sie den automatisierten Mehrkanalpipettierer ein und doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, um das Protokoll zum Herstellen von Interferon-Assayplatten für die Plattformeinrichtung zu öffnen. Stellen Sie eine vollständig gefüllte Pipettenspitzenbox in Position eins der Plattform, die 96-Well-Quellplatte in Position vier und eine neue 384-Well-Platte in Position sechs.Starten Sie den Durchlauf, indem Sie nach Abschluss des Durchlaufs auf die Wiedergabetaste drücken. Klopfen Sie vorsichtig auf die 384-Well-Assayplatte auf einer flachen Oberfläche, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeiten am Boden der Vertiefungen befinden, und bringen Sie nach dem Zentrifugieren der Platte bei 700 G für eine Minute eine haftende Plattenfolie auf. Entfernen Sie die haftende Plattenfolie.Legen Sie die 384-Well-Assayplatte in den Plattendehydrator und positionieren Sie das 384-Well-Manifold direkt über den Vertiefungen. Sobald der Inhalt der 384-Well-Assayplatte trocken ist, bringen Sie eine neue klebende Plattenversiegelung und ein Schnellfolienetikett an und lagern Sie die Platte bis zur Verwendung zur Beladung und Durchführung des Assays im Dunkeln bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie zwei Ansätze für Housekeeping-Gen- oder HKG-Gruben vor, indem Sie zwei Mikroliter S-S-D-N-A in 84,9 Mikrolitern Wasser verdünnen. Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter der verdünnten SSD-NA, 11,8 Mikroliter Wasser, 23 Mikroliter Master-Mix und 9,2 Mikroliter des korrekten 20×HKG-Primer-Probe-Sets jedem beschrifteten HKG-Röhrchen hinzu, wirbeln Sie um und zentrifugieren Sie kurz. Bereiten Sie danach die Proben- und Positivkontroll-cDNA vor, indem Sie jeweils 78,8 Mikroliter Master-Mix und 54,8 Mikroliter Wasser zu jedem 24-Mikroliter-Proben- und Positivkontrollröhrchen hinzufügen. Um die Standard- und NTC-Grubenansätze vorzubereiten, die einer getrockneten 384-Loch-Assayplatte zugegeben werden sollen, geben Sie 165 Mikroliter Wasser zu 275 Mikrolitern Master-Mix in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen für den NTC-Grubenansatz bzw. 52,5 Mikroliter Wasser zu 52,5 Mikrolitern Master-Mix in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Entnehmen Sie eine zuvor vorbereitete getrocknete 384-Well-Assayplatte aus vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 700 ×g. Geben Sie mit der 30-Mikroliter-Elektronik-Multikanalpipette 7,5 Mikroliter NTC in jedes Well. Mischen Sie den NTC gut.Geben Sie sechs Mikroliter der Standard-Mischung und 1,5 Mikroliter des Standards in jedes Standard-Loch. Geben Sie anschließend 7,5 Mikroliter der Probe mit einer 12,5-Mikroliter-Elektronik-Multikanalpipette in die vorgesehenen Löcher. Geben Sie 2,5 Mikroliter der HKG-Primer-Sonden-Mischung in die vorgesehenen Löcher, nachdem Sie die Platte mit optischem Versiegelungsfolie verschlossen und eine Minute bei 700 ×g zentrifugiert haben. Vortexen Sie die verschlossene 384er-Platte zwei Minuten lang im Vortex-Mischer bei 2.600 U/min und zentrifugieren Sie sie anschließend fünf Minuten bei 700 ×g.Schließlich die versiegelte Testplatte in die Q-R-T-P-C-R-Maschine geben. Die Vorlage für das Assay-Layout öffnen und die folgenden Reaktionsbedingungen verwenden. Den Lauf starten, die Daten gemäß dem Textprotokoll exportieren und analysieren, wie in dieser Abbildung dargestellt; die Expressionsprofile menschlicher Typ-1- und Typ-3-Interferone wurden in peripheren mononukleären Blutzellen oder pBMCs von sechs Spendern analysiert, die mit Liganden von Toll-ähnlichen Rezeptoren stimuliert worden waren.Die Daten werden als Radarcharts in logarithmischer Skala mit zwei Analysemethoden dargestellt, einschließlich des absoluten CQ-Werts, normiert auf das Housekeeping-Gen, und der Kopienzahl der Vorlage pro Mikrogramm gesamter RNA. Die Daten zeigen, dass humane Interferon-Expressionsprofile, die durch TLR-Agonisten hervorgerufen werden, ligandenspezifische Expressionsprofile von Typ-I- und Typ-III-Interferonen in Resus Maccas sind. Auch in diesem Experiment waren die TLR-Liganden spezifisch; PBMC von drei Spendern wurden drei Stunden lang mit drei Liganden stimuliert.Die Expression von Interferon-Subtypen in unstimulierten Zellen im Ausgangszustand war, wie hier gezeigt, gering. Eine begrenzte Anzahl von Interferon-alpha-Subtypen wurde als Reaktion auf LPS und Poly I:C exprimiert. Im Gegensatz dazu war die Interferon-Expression als Reaktion auf Imiquimod hoch, und die Subtyp-Expression umfasste eine breite Expression von Interferon-beta und Interferon.Lambda eins wurde durch alle drei TLR-Agonisten verstärkt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 3D-Vier-Well-Testplatten zur hochdurchsatzfähigen Analyse einer stark verwandten Gruppe von Genen, wie den Typ-I- und Typ-III-Interferonsubtypen, vorbereitet, durchführt und auswertet.

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Research

Forschung

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Immunology and Infection

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Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

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