Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Vorbereitung und Ausführung von 384-Well-Assay-Platten für die Hochdurchsatzanalyse einer hochgradig homologen Gruppe von Genen, wie z. B. der Interferon-Subtypen Typ 1 und 3. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Standard-Reihenverdünnung hergestellt wird, die für den Betrieb der Assay-Platten verwendet wird. Als nächstes werden die Primersonde und die für die Herstellung der Platten verwendeten Materialmischungen ohne Schablonenkontrolle vorbereitet.

Anschließend werden die 384-Well-Assay-Platten mit einer automatisierten Mehrkanalpipette vorbereitet und für die Lagerung getrocknet. Schließlich werden die 384-Well-Assay-Platten gefahren und analysiert. Letztendlich wird der quantitative Echtzeit-RT-TR-PCR-R-Assay mit hohem Durchsatz zur Definition von Interferon-Expressionssignaturen in Gewebekulturmodellen, zur Untersuchung von Krankheitserregern oder in klinischen Proben im Rahmen von infektiösen oder autoinflammatorischen Erkrankungen eingesetzt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen R-2-PCR unter Verwendung von linearen Standardsonden oder Cyberg Green besteht darin, dass molekulare Beacon- und Lock-Nukleinsäure-Fluoreszenzsonden verwendet werden können, um Unterschiede zwischen einzelnen Basenpaaren zwischen sehr ähnlichen Sequenzen zu unterscheiden. Nach dem Auftauen, Vortexen und kurzen Zentrifugieren eines Standard- und Lachsspermiums oder S-S-D-N-A. Bereiten Sie die SSD NA-Wassermischung für die 17 Standardverdünnungssets vor, indem Sie 51 Mikroliter S-S-D-N-A mit 20,3 Millilitern Wasser mischen. Geben Sie 190 Mikroliter der SS-DNA-Wassermischung in das erste Röhrchen eines PCR-Streifens mit acht Röhrchen und 180 Mikroliter in die nächsten fünf Röhrchen.

Führen Sie eine Verdünnung von eins bis 20 durch, indem Sie 10 Mikroliter aus dem 50-Picomolar-Standardmaterial in das Röhrchen mit 190 Mikrolitern S-S-D-N-A-Wasser übertragen, den Vortex mischen und schnell zentrifugieren. Der PCR-Streifen führt eine Verdünnung von eins bis 10 durch, indem er 20 Mikroliter aus dem zuletzt verdünnten Röhrchen in das nächste Röhrchen im Serienwirbel überträgt und den PCR-Streifen schnell zentrifugiert. Wiederholen Sie die Verdünnung von eins bis 10, bis das letzte Röhrchen in der Serie den Standard erhalten hat.

Nach der Markierung von bis zu 17 Zwei-Milliliter-Röhrchen verwenden Sie eine elektronische 12,5-Mikroliter-Mehrkanalpipette, um jedem Röhrchen zwei Mikroliter S-S-D-N-A hinzuzufügen, wobei Sie Primer und Sonden verwenden, die gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden. Geben Sie den entsprechenden Vorwärtsprimer, den Rückwärtsprimer und die Sonde zu jedem Primer. Sondenset Arbeitsmaterialrohr zur Vorbereitung der Mischungen ohne Schablonenkontrolle oder NTC-Arbeitsmaterial.

Übertragen Sie 14,3 Mikroliter jedes Primersondensatzes in das entsprechende NTC-Arbeitsmaterial-Mischröhrchen gemäß dieser Tabelle. Nach der Entfernung eines Eloqua aus den für das NTC-Arbeitsmaterial erforderlichen Primer-Sondensets wird 1,5 Milliliter Wasser gemischt, um das endgültige Volumen jedes Primer-Sondensatz-Arbeitsmaterialrohrs auf 1,7 Milliliter zu bringen. Zur Vorbereitung einer 96-Well-Quellplatte für die Primersondensätze und NTC-Mischungen.

Setzen Sie eine neue 96-Well-Platte in einen gekühlten 96-Well-Kühlblock ein und bezeichnen Sie die Wells mit dem richtigen Primersondensatz oder der richtigen NTC-Mischung mit einer elektronischen 250-Mikroliter-Mehrkanalpipette. Geben Sie 66 Mikroliter Wasser in jedes Primersondenset. Brunnen geben 82,5 Mikroliter Wasser an die vier Zielbrunnen 17 ab.

Geben Sie 27,5 Mikroliter Wasser in jede Anti-C-Mischung. Nun, als nächstes fügen Sie 54 Mikroliter der richtigen Primersonden im Arbeitsmaterial zu den dafür vorgesehenen Primersonden bei der Abgabe in den Vertiefungen hinzu. 67,5 Mikroliter des Ziels 17 Primer Sonde Arbeitssatz Material auf das vorgesehene Ziel 17 Primersonden in den Bohrlöchern.

Geben Sie 22,5 Mikroliter der richtigen NTC-Arbeitsmaterialmischung in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Verwenden Sie dann eine Klebeplatte, um die 96-Well-Platte zu versiegeln, und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 700 g, um sicherzustellen, dass sich der Inhalt mit dem 96-Well-Adapter am Boden der Wells befindet. Stellen Sie die Platte in den Vortex-Mixer und mischen Sie eine Minute lang bei 1000 RP.

Dann zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 700 g. Um die 384-Well-Assay-Platten vorzubereiten, schalten Sie die automatische Mehrkanalpipette ein und doppelklicken Sie auf das Software-Symbol, um das Protokoll zur Herstellung von Interferon-Assay-Platten für die Einrichtung der Plattform zu öffnen. Platzieren Sie eine vollständig gefüllte Pipettenspitzenbox in Position eins, die 96-Well-Quellplatte in Position vier und eine neue 384-Well-Platte in Position sechs.

Starten Sie den Lauf, indem Sie die Wiedergabetaste drücken, wenn der Lauf abgeschlossen ist. Klopfen Sie vorsichtig auf die 384-Well-Assay-Platte auf eine ebene Fläche, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeiten am Boden der Wells befinden, und bringen Sie eine Klebeplatte an, nachdem Sie die Platte eine Minute lang bei 700 g gedreht haben. Entfernen Sie die Klebeplattendichtung.

Setzen Sie die 384-Well-Assay-Platte in den Plattentrockner ein und positionieren Sie den 384-Well-Verteiler direkt über den Wells. Sobald der Inhalt der 384-Well-Assay-Platten trocken ist. Bringen Sie eine neue Klebeplatte und ein neues Schnellfolienetikett an und lagern Sie es im Dunkeln bei vier Grad Celsius, bis Sie zum Laden und Ausführen der Assay-Platte verwendet werden.

Bereiten Sie zwei Hauswirtschafts-Gen- oder HKG-Brunnenmischungen vor, indem Sie zwei Mikroliter S-S-D-N-A in 84,9 Mikrolitern Wasser verdünnen. Geben Sie dann zwei Mikroliter des verdünnten SSD NA, 11,8 Mikroliter Wasser, 23 Mikroliter Mastermix und 9,2 Mikroliter des korrekten 20 XHKG-Primersondensets in jedes markierte HKG-Röhrchen, wirbeln Sie vor und zentrifugieren Sie kurz, nachdem Sie die Proben vorbereitet und CDNA bei 78,8 Mikrolitern Mastermix und 54,8 Mikrolitern Wasser auf jede 24-Mikroliter-Probe und jedes Positivkontrollröhrchen positiv kontrolliert haben. Zur Vorbereitung der Standards und NTC-Well-Mischungen, die in eine getrocknete 384-Well-Assay-Platte gegeben werden sollen, fügen Sie 165 Mikroliter Wasser zu 275 Mikrolitern Mastermix in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu, für das NTC-Well-Mixen Sie 52,5 Mikroliter Wasser zu 52,5 Mikrolitern Mastermix in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Nehmen Sie eine zuvor vorbereitete getrocknete 384-Well-Assay-Platte von vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 700 GS. Mit der elektronischen 30-Mikroliter-Mehrkanalpipette können 7,5 Mikroliter NTC dosiert werden. Zu jedem NTC gut mischen.

Geben Sie sechs Mikroliter der Standards gut mischen und 1,5 Mikroliter des Standards auf jeden Standard. Geben Sie dann 7,5 Mikroliter der Probe mit einer elektronischen 12,5-Mikroliter-Mehrkanalpipette in die dafür vorgesehenen Vertiefungen. Geben Sie 2,5 Mikroliter des HKG-Primers Probe in die dafür vorgesehenen Vertiefungen, nachdem Sie die Platte mit optischem Klebefilm versiegelt und eine Minute lang bei 700 g zentriffusioniert haben, wirbeln Sie die versiegelte 384-Well-Platte im Vortex-Mischer bei 2.600 U/min für zwei Minuten und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 700 Käse.

Setzen Sie abschließend die versiegelte Assay-Platte in das Q-R-T-P-C-R-Gerät ein. Öffnen Sie die Vorlage für das Assay-Layout und verwenden Sie die folgenden Reaktionsbedingungen. Starten Sie den Lauf, exportieren und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, wurden die Interferon-Expressionssignaturen des menschlichen Typs eins und drei in mononukleären Zellen des peripheren Blutes oder p-BMCs von sechs Spendern analysiert, die mit Toll-like-Rezeptor-Liganden stimuliert wurden.

Die Daten werden als Radardiagramme in einer logarithmischen Skala unter Verwendung von zwei Analysemethoden dargestellt, einschließlich des absoluten CQ-Wertes, der auf das Housekeeping-Gen normiert ist, und der Kopienzahl des Templates pro Mikrogramm Gesamt-RNA. Die Daten zeigen, dass humane Interferon-Expressionssignaturen, die durch TLR-Agonisten hervorgerufen werden, ligandenspezifische Expressionssignaturen von Interferon vom Typ eins und drei in Resus Maccas sind. Waren auch TLR-Liganden spezifisch in diesem Experiment, wurden PBMC von drei Spendern mit drei Liganden für drei Stunden stimuliert.

Expression des Interferon-Subtyps in unstimulierten Zellen war zu Studienbeginn gering, wie hier gezeigt. Eine begrenzte Anzahl von Interferon-alpha-Subtypen wurde als Reaktion auf LPS und Poly ic exprimiert. Im Gegensatz dazu war die Interferonexpression als Reaktion auf Imiquimod hoch und die Subtypexpression war eine breite Expression von Interferon beta und Interferon.

Lambda one wurde mit allen drei TLR-Agonisten verstärkt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Four-Well-Assay-Platten für die Hochdurchsatzanalyse einer sehr ähnlichen Gruppe von Genen wie den Interferon-Subtypen Typ 1 und 3 vorbereiten, ausführen und analyze. 3D.