JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 3:05 Min. • July 8th, 2025
Chikungunya-Virus-ähnliche Partikel, VLPs, sind nicht-infektiöse Strukturen, die aus viralen Hüllproteinen bestehen, die in eine Lipiddoppelschicht eingebettet sind und kein genetisches Material enthalten.
Um Chikungunya-VLPs herzustellen, infizieren Sie Spodoptera frugiperda Sf9-Insektenzellen mit rekombinanten Baculoviren, die eine Chikungunya-Strukturgenkassette exprimieren. Die Kassette besteht aus einem Baculovirus-Promotor, der mit Chikungunya-Strukturgenen fusioniert ist, die für Kapsid- und Hüllproteine kodieren.
Während der Inkubation binden Baculovirus-Hüllglykoproteine an Oberflächenrezeptoren auf den Insektenzellen. Dies erleichtert den Eintritt und die Freisetzung von viraler DNA durch Baculoviren in das Zytoplasma und erzeugt Polyproteine, die Chikungunya-Kapsid- und Hüllproteine enthalten.
Nach der Synthese erzeugt die autokatalytische Spaltung des Kapsidproteins das Vorläuferpolyprotein, das Hüllproteine im endoplasmatischen Retikulum, ER, besitzt. Im ER-Lumen spalten Enzyme das Vorläufer-Polyprotein und erzeugen einzelne Proteine, die zur weiteren Verarbeitung in das Golgi-Kompartiment gelangen und Protein-Heterotrimere bilden.
Golgi-residente Proteasen spalten die Protein-Heterotrimere und produzieren reife Hüllproteine mit E2- und E1-Proteinen. Diese Hüllproteine translozieren zur Membran, knospen zu VLPs und werden in das Medium freigesetzt.
Übertragen Sie die infizierte Kultur in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie, um die Insektenzellen zu pelletieren. Saugen Sie den VLP-haltigen Überstand an und filtern Sie ihn, um Schmutz zu entfernen.
Das resultierende Filtrat, das Chikungunya-VLPs enthält, ist bereit für immunpathologische Studien.
Zuvor wurden Spodoptera frugiperda oder Sf9-Zellen in Suspension in Spinnerkolben durch kontinuierliches Rühren bei 130 U/min auf einem Mehrpunkt-Rührplattensystem kultiviert. Das Kulturvolumen wird für eine ordnungsgemäße Belüftung auf nicht mehr als der Hälfte des Volumens des Spinnerkolbens gehalten. Als nächstes exprimieren Sie CHIK-VLPs, indem Sie 250 Milliliter Sf9-Zellen in einem Spinnerkolben mit einer Dichte von 2 x 106 Zellen pro Milliliter mit zuvor vorbereiteten rekombinanten Baculoviren infizieren und die Zellen in einen 28-Grad-Inkubator zurückführen.
Verwenden Sie den Trypanblau-Ausschluss, um festzustellen, ob die Zellviabilität auf 70 % bis 80 % gesunken ist. Nach der Bestätigung werden die Kulturen direkt aus der Suspension in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen nach unten geschleudert. Sammeln Sie die Überstände und filtern Sie sie vor der Sedimentation durch eine 0,22-Mikron-Porenmembran.