Nachweis der Bindung von Vitronectin an bakterielle Oberflächen mittels Durchflusszytometrie

Nehmen Sie Durchflusszytometer-Röhrchen mit Wildtyp- und mutierten Stämmen von Haemophilus influenzae, Typ f.

Pipettieren Sie einen Puffer, der blockierende Proteine und Vitronektin enthält. Ausbrüten.

Die Blockierungsproteine reduzieren unspezifische Wechselwirkungen auf der Bakterienoberfläche, während Vitronektin-Moleküle an Protein H, ein Vitronectin-bindendes Protein, auf der Oberfläche von Wildtyp-Bakterien binden. Im mutierten Stamm bindet Vitronektin aufgrund des Fehlens von Protein H nicht.

Zentrifuge. Entfernen Sie ungebundenes Vitronektin und blockierende Proteine.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der primäre Anti-vitronektin-Antikörper enthält, die spezifisch an Vitronektin binden, das an die Oberflächen der Wildtyp-Bakterien gebunden ist.

Führen Sie als Nächstes Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper ein, die an die primären Antikörper auf Vitronektin binden und den Nachweis von Vitronektin erleichtern.

Zentrifuge. Entfernen Sie ungebundene Sekundärantikörper. Resuspendieren Sie Bakterien im Puffer.

Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Bindung von Vitronektin an die Bakterienoberfläche zu bestimmen.

Vergleichen Sie die Fluoreszenzsignale von Wildtyp- und Mutantenstämmen. Eine Verschiebung des Fluoreszenzsignals in Wildtyp-Bakterien bestätigt die Bindung von Vitronektin an die Bakterienoberfläche.

Zur Vorbereitung der Durchflusszytometrie resuspendieren Sie die Bakterienpellets mit 50 Mikrolitern Blockpuffer mit 250 nanomolaren Vitronektin. Inkubieren Sie die Proben dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur, ohne sie zu schütteln. Nach der Inkubation pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 3.500 x g für 5 Minuten. Waschen Sie die Pellets dann dreimal mit PBS und ähnlichen Zentrifugationsschritten.

Nach dem Waschen werden 50 Mikroliter primärer polyklonaler Anti-Human-Antikörper gegen Vitronektin für Schafe in das Bakterienpellet in einer Verdünnung von 1 bis 100 in PBS/BSA gegeben. Inkubieren Sie die Suspension 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Bakterien dreimal mit PBS, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter PBS/BSA, das Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierte polyklonale Antikörper gegen Schafe enthält, zum Pellet. Bei Raumtemperatur 1 Stunde im Dunkeln inkubieren. Zum Schluss wird das Bakterienpellet nach drei Waschschritten mit 300 Mikrolitern PBS resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert.