Entwicklung einer Neuronen- und Makrophagen-Kokultur in vitro

Beginnen Sie mit isolierten murinen Spinalganglienneuronen in einem Wachstumsmedium.

Säen Sie sie auf eine polymerbeschichtete Multi-Well-Platte, um die neuronale Anheftung zu fördern.

Nehmen Sie als nächstes eine sezierte, eingeschläferte Maus und injizieren Sie eiskaltes PBS in ihre Bauchhöhle.

Massieren Sie sanft das Bauchfell, um Makrophagen von der Peritoneumwand zu lösen.

Drücken Sie die Maus zusammen, um die Bauchfellflüssigkeit zu sammeln, und behandeln Sie sie mit einem Lysepuffer, um die roten Blutkörperchen, die als Verunreinigungen erscheinen, selektiv zu lysieren. Zentrifugieren und resuspendieren Sie die Zellen in einem Kulturmedium.

Übertragen Sie die Makrophagen auf einen porösen Einsatz, der in der Vertiefung mit den kultivierten Neuronen positioniert ist.

Diese Co-Kultur ermöglicht es, dass Neuronen und Makrophagen in unmittelbarer Nähe sind.

Behandeln Sie die Co-Kultur mit db-cAMP und inkubieren Sie, um den Eintritt in die Zellen zu erleichtern. Dadurch werden die Neuronen aktiviert, um die Signalmoleküle auszuschütten.

Diese Signalmoleküle veranlassen zusammen mit db-cAMP Makrophagen, einen pro-regenerativen Phänotyp anzunehmen und essentielle Faktoren für das Wachstum von Neuronen zu sezernieren.

Vor dem Einrichten der Kultur ist eine 6-Well-Platte mit Poly-D-Lysin und Laminin vorzubeschichten. Inkubieren Sie anschließend die 6-Well-Platte mit 0,01 Poly-D-Lysin bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden oder bei 4 Grad Celsius über Nacht. Danach den Teller zweimal mit destilliertem Wasser waschen.

Inkubieren Sie dann die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit Lamininlösung in einer Konzentration von 3 Mikrogramm pro Milliliter. Waschen Sie den Teller anschließend zweimal mit destilliertem Wasser und trocknen Sie den Teller mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Schneiden Sie nun mit einer chirurgischen Klinge die Haut über der Wirbelsäule einer euthanasierten Maus ein und präparieren Sie die paravertebralen Muskeln beidseitig, um die Wirbelknochen freizulegen. Entfernen Sie die Wirbelknochen sorgfältig mit einem chirurgischen Rondure mit schmaler Spitze, bis die DRG vollständig freigelegt sind.

Unter einem Präpariermikroskop wird das DRG mit einer Iridektomieschere und einer Pinzette mit feiner Spitze beidseitig von S1 bis hinauf zur C1-Ebene entfernt. Übertragen Sie das DRG mit einer blauen Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende auf ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.

Entfernen Sie dann das DMEM nach einer kurzen Drehung für einige Sekunden mit einer Mini-Zentrifuge. Fügen Sie 1 Milliliter DMEM hinzu, das 125 Einheiten pro Milliliter Typ-11-Kollagenase enthält, und inkubieren Sie das Röhrchen 90 Minuten lang mit einer sanften Drehung mit einer Drehung oder einem Shaker bei 37 Grad Celsius.

Entsorgen Sie anschließend kollagenasehaltiges DMEM und fügen Sie 1 Milliliter frisches DMEM hinzu. Übertragen Sie das DRG mit einer blauen Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie dann mindestens 15 Mal vorsichtig auf und ab, um eine homogene Zellsuspension herzustellen.

Das Röhrchen bei 239 g drei Minuten lang zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit den Treibgut entsorgen. Fügen Sie 1 Milliliter neurobasales Medium, das mit B27 ergänzt ist, hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es vorsichtig fünf- bis zehnmal auf und ab pipettieren.

Führen Sie dann die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Rohr überlagert ist. Plattieren Sie dann alle gesammelten DRG-Neuronen auf zwei Vertiefungen der 6-Well-Platte.

Um primäre Peritonealmakrophagen von einer erwachsenen Maus zu präparieren, schneiden Sie die Bauchhaut vorsichtig ein, um das Peritoneum freizulegen, und vermeiden Sie es, das Peritoneum zu schneiden, um ein Austreten von Lavageflüssigkeit zu verhindern.

Als nächstes punktieren Sie das Peritoneum mit einer Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel und injizieren 10 Milliliter eiskaltes PBS in die Bauchhöhle. Massieren Sie das Bauchfell sanft für ein bis zwei Minuten. Ziehen Sie dann die Nadel heraus, drücken Sie das PBS durch die Einstichstelle der Nadel heraus und sammeln Sie die Spülflüssigkeit in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.

Anschließend zentrifugieren Sie die Spülflüssigkeit bei 239 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um die Zellbestandteile zu pelletieren. Anschließend das Pellet drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 Millilitern des Lysepuffers für rote Blutkörperchen erneut suspendieren.

Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 239 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Suspendieren Sie die pelletierten Zellen in 1 Milliliter neurobasalem B27-Medium. Die Hälfte aller gesammelten Makrophagen wird auf einen Zellkultureinsatz mit einer effektiven Fläche von 4,2 Zentimetern im Quadrat aufgelegt, der auf die Vertiefung aus dissoziiertem DRG gelegt wird.

Vier Stunden nachdem die Neuron-Makrophagen co-kultiviert wurden, fügen Sie 2 Mikroliter 100-mikromolare db-cyclische AMP-Lösung zu den Neuron-Makrophagen-Co-Kulturen hinzu. Füllen Sie nach 24 Stunden eine leere Vertiefung mit 1 Milliliter Makrophagen-Kulturmedium in dieselbe 6-Well-Platte.

Übertragen Sie den Zellkultureinsatz in der Neuronen-Makrophagen-Co-Kultur in die leere Vertiefung mit Makrophagen-Kulturmedium.