Analyse der Calciumdynamik und der Membranpotentialänderungen in einem arteriolären Endothel der Maus

Sichern Sie eine arterioläre Endothelröhre, die aus einem Mäusegehirn entnommen wurde, in einer Kammer mit einem kontinuierlichen Pufferfluss.

Platzieren Sie die Kammer in einem Aufnahme-Setup.

Führen Sie einen kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff ein. Inkubieren, um die zelluläre Aufnahme des Farbstoffs zu ermöglichen.

Waschen Sie, um nicht verinnerlichte Farbstoffe zu entfernen.

Führen Sie eine Elektrode in eine Endothelzelle ein und erfassen Sie das Ruhemembranpotential.

Erhöhen Sie die Badtemperatur auf eine physiologische Temperatur, um die intrazelluläre Kalziumbindung an den Farbstoff zu erleichtern.

Anregung des Farbstoffs und Messung der Fluoreszenz, um den zellulären Kalziumspiegel zu Beginn zu quantifizieren.

Einführung eines Medikaments, das an spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf den Endothelzellen bindet und so eine Signalkaskade in Gang setzt.

Diese Kaskade setzt Kalziumionen aus dem endoplasmatischen Retikulum in das Zytoplasma frei, wodurch die Kalzium-Farbstoff-Bindung und die Fluoreszenz verbessert werden.

Erhöhte zytoplasmatische Kalziumspiegel aktivieren auch Kaliumkanäle, was den Ausfluss von Kaliumionen erleichtert und das Membranpotenzial verringert

Notieren Sie die Daten.

Eine erhöhte Fluoreszenz und ein verringertes Membranpotential deuten auf eine funktionsfähige Endothelröhre hin.

Um das Endothelmembranpotential zu messen, während Sie durch das vierfache Objektiv sehen, positionieren Sie die scharfe Elektrodenspitze vorsichtig knapp über einer Zelle des arteriellen Endothelrohrs in der fließenden physiologischen Salzlösung mit einem Mikromanipulator. Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 400-fache und positionieren Sie die Elektrodenspitze nach Bedarf neu. Führen Sie mit dem Mikromanipulator vorsichtig die Spitze einer scharfen Elektrode in eine der Zellen der Endothelröhre ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der VM mit einem Elektrometer.

Sobald die endotheliale Ruhe-VM von minus 30 bis minus 40 Millivolt stabil ist, wenden Sie die gewünschten pharmakologischen Wirkstoffe pro experimentellem Ziel an. Beladen Sie die Endothelröhre mit dem Fluoreszenztracker für die Plasmamembran oder das gewünschte Organell bei 37 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit frischer physiologischer Superfusionssalzlösung und bilden Sie lebende Zellen unter dem Mikroskop bei der Anregungswellenlänge der jeweiligen Farbstoffe ab.