Ultrastrukturelle Analyse eines Schnitts aus dem Gehirn einer Maus mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Nehmen Sie einen Osmiumtetroxid-fixierten Abschnitt des Gehirns einer Maus, der in einen Harzblock eingebettet ist.

Rufen Sie ein Schnittbild ab, und richten Sie es an einem vorbereiteten Atlasbild aus, um den interessierenden Bereich zu identifizieren.

Markieren Sie die Grenzen dieses Bereichs auf dem Block.

Erhitzen Sie das Harz, um es weicher zu machen und den markierten Bereich herauszuschneiden.

Kleben Sie das Exemplar auf eine Glashaltestange und schneiden Sie es ab.

Bereiten Sie mit einem Ultramikrotom halbdünne und ultradünne Schnitte vor.

Übertragen Sie die halbdünnen und ultradünnen Schnitte auf Glasträger bzw. Nickelgitter

Färben Sie die halbdünnen Schnitte mit einem Farbstoff, der an Nukleinsäuren, ribosomenreiches Zytoplasma und die extrazelluläre Matrix bindet.

Waschen Sie die Schnitte und untersuchen Sie sie unter einem Lichtmikroskop, um das Vorhandensein des Zielbereichs zu bestätigen.

Betrachten Sie die ultradünnen Schnitte unter einem Transmissionselektronenmikroskop.

Osmiumtetroxid erhöht die Elektronendichte von Zell- und Organellenmembranen und bietet einen hohen Kontrast zu dem weniger elektronendichten Zytoplasma, was die Visualisierung der zellulären Ultrastruktur ermöglicht.

Um einen Interessenbereich zu kartieren, wählen Sie ein Bild aus, das den Interessenbereich aus dem zuvor vorbereiteten Bildatlas enthält. Skizzieren Sie die Ränder des Interessenbereichs auf das geschnittene Bild. Überlagern Sie diese Ränder optisch mit der eingebetteten Probe unter dem Mikroskop und ritzen Sie diese Bereichsränder mit einer 1-Zoll-26-Gauge-Nadel auf die Harzprobe ein. Erhitzen Sie dann die Proben auf 95 Grad Celsius, um das Harz weicher zu machen.

Nehmen Sie als Nächstes die warmen Harzproben aus dem Ofen und verwenden Sie eine Rasierklinge, um die interessierenden Bereiche herauszuschneiden. Kleben Sie die Proben auf Acrylglas-Haltestangen des entsprechenden Kalibers und trimmen Sie die gefassten Proben für halb- und ultradünne Schnitte. Verwenden Sie ein Ultramikrotom, um halbdünne 0,7-Mikrometer- und ultradünne 70-Nanometer-Abschnitte zu erfassen, indem Sie die halbdünnen Abschnitte auf Glasträgern und die ultradünnen Abschnitte auf Nickelgittern sammeln.

Färben Sie die halbdünnen Schnitte vier Minuten lang mit 1 % Toluidinblau in PBS, gefolgt von mehreren Waschgängen in entionisiertem Wasser, bevor Sie die Schnitte lichtmikroskopisch untersuchen. Die ultradünnen Schnitte können dann ohne weitere Modifikationen direkt durch Transmissionselektronenmikroskopie bei 180 Kilovolt beurteilt werden.