Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Herz aus dem Zebrafisch zu entfernen. Dies wird erreicht, indem zuerst Zebrafische gesammelt und fixiert werden. Als nächstes wird die Körperhöhle geöffnet, um das Herz sichtbar zu machen.

Dann wird das Herz entnommen und von nicht-kardialem Gewebe gereinigt. Zum Schluss wird das Herz fotografiert. Letztendlich kann die Morphologie des Herzens im Laufe der Zeit durch Mikroskopie, Schnitte und Fotografie gesehen werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie der Schlüssel zum Sezieren ist. Sta sind schwer zu erlernen, da Zebrafische klein sind und das Gewebe in der Farbe nicht deutlich ist und schwer zu identifizieren sein kann, um Zebrafische aus den Larven durch die adulten Stadien zu erzeugen. Führen Sie für diese Experimente Einzelbirnen- oder Gruppenpaarungen mit erwachsenen Fischen durch.

Reinigen Sie die Embryonen und lagern Sie sie in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator. Fünf Tage nach der Befruchtung trennen Sie die Fische in Tanks mit einer Dichte von 10 bis 15 Fischen und setzen Sie sie in die Fischanlage. Nehmen Sie den Fisch im entsprechenden Alter aus dem Aquarium und legen Sie ihn zur Betäubung in 0,2%Trica ein.

Legen Sie den betäubten Fisch für 15 Minuten in Eiswasser, um ihn einzuschläfern. In der Zwischenzeit 4% para-Formaldehyd oder PFA in einem XPBS in eine Schüssel geben. Inkubieren Sie den gesammelten Fisch in der 4%igen PFA für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Petrischale, die mit Perfil umwickelt ist.

Dadurch bleibt der Fisch flach und das Sezieren nach der Fixierung wird deutlich erleichtert. Zweimal in PBS mit 0,1 % Spülen Tween oder PBT Fisch kann in PBT bei vier Grad Celsius bis zu 10 Tage aufbewahrt werden. Legen Sie einen einzelnen Fisch in eine Petrischale, die zur Hälfte mit frischem PBS gefüllt ist, und legen Sie ihn auf die rechte Seite.

Messen Sie die Länge des Fisches von der Schnauze bis zum Schwanzansatz, ohne die Schwanzflossen mit einem digitalen Millimeter-Messschieber. Dies ist die Standardlänge oder Sl. Weisen Sie jedem Fisch eine Zahlen-Buchstaben-Kombination zu, damit ein einzelner Fisch und das resultierende präparierte Herz für eine spätere Analyse verfolgt werden können.

Geben Sie alle Daten, einschließlich aller Messungen, in eine Tabelle ein und organisieren Sie sie anhand dieser Beschriftungen, bevor Sie sie zerlegen. Etikettieren Sie PCR-Röhrchenstreifen mit der zugewiesenen Sendungsverfolgungsnummer und füllen Sie die Röhrchen mit PVT oder einer anderen geeigneten Lösung für die weitere Analyse. Richten Sie die Bauchlage des Fisches in einer Petrischale nach oben aus, während Sie den Körper mit einer Pinzette stabilisieren und den Kopf zwischen Augen und Kiemen halten, wenn Fische kleiner als 12 Millimeter in der Standardlänge sind.

Mit einer scharfen Pinzette oder einer Mikronadel in einem Stifthalter. Entferne die Brustmuskeln und Flossen aus dem Körper, um das Herz freizulegen. Durch die ständige Bewegung der Pinzette während der Dissektion können Strömungen in der PPT entstehen, die den Fisch bewegen.

Dies ist vor allem bei kleineren Fischen problematisch. Daher muss eine Mikronadel verwendet werden, um Brustmuskeln und Flosse zu entfernen und die Körperhöhle zu öffnen. Ziehe mit der Pinzette das Herz vorsichtig aus dem Hohlraum unter dem Vorhof hervor.

Wenn der Fisch einen fluoreszierenden Herzmarker enthält, verwenden Sie für die Dissektion ein Fluoreszenzskop und überprüfen Sie, ob das Herz durch Fluoreszenz entfernt wurde. Sobald das Herz aus der Höhle entfernt wurde, verwenden Sie die Pinzette, um das Herz zu halten, und eine Mikronadel, um überschüssiges nicht-kardiales Gewebe und die Epikardauskleidung von der Außenseite des Herzens zu entfernen. Für Fische mit einer Länge von mehr als 12 Millimetern.

Machen Sie mit einer Mikroschere mit Federgriff drei Schnitte. Machen Sie zunächst einen Querschnitt durch die Kiemen. Zweitens, machen Sie einen weiteren Querschnitt am vorderen Bauch.

Und drittens, machen Sie einen sagittalen Schnitt auf der Bauchseite, der beide Querschnitte verbindet. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette die Brustmuskeln und Flossen vom Körper, um die Körperhöhle zu öffnen und das silbrige Gewebe des Perikards freizulegen. Entfernen Sie dieses Perikardgewebe und das Herz wird sichtbar.

Schneiden Sie mit der Mikroschere die Arterie durch, die mit der Arteriose bulbus verbunden ist, die sich oberhalb des Herzens befindet. Sobald diese Arterie durchtrennt ist, platzieren Sie die Spitzen der Pinzette unter dem Vorhof und schöpfen Sie mit der Pinzette das Herz aus der Höhle. Wenn es zusätzliches Gewebe gibt, das mit dem Herzen kommt, ist das in Ordnung, da es später entfernt werden kann.

Bei einigen Fischen ist es alternativ möglich, das Herz zu entfernen, indem man den Bulbus vorsichtig herauszieht, und der Rest des Herzens folgt. Seien Sie vorsichtig mit der Position des Vorhofs, wenn Sie die alternative Technik verwenden, da er leicht beschädigt werden kann. Wenn es zusätzliches Gewebe gibt, das mit dem Herzen kommt, ist das in Ordnung und kann danach entfernt werden.

Sobald das Herz aus der Kavität entfernt wurde, verwenden Sie die beiden Zangen, um das Herz zu halten und das überschüssige Gewebe zu entfernen, oder eine Pinzette, um das Herz zu halten, und eine Mikronadel, um überschüssiges nicht-kardiales Gewebe zu entfernen. Um das Zebrafischherz zu fotografieren, bereiten Sie eine 23 Gramm pro Liter Nähr-Agar-Petrischale vor und bedecken Sie den erstarrten Agar mit PBS. Verwenden Sie die Pinzette, um eine Vertiefung in den Agar zu bohren, die es dem Herzen ermöglicht, in die richtige Ausrichtung zu passen.

Entfernen Sie das Herz aus dem PCR-Röhrchen, indem Sie die Spitze des Bulbus festhalten. Mit der Pinzette fest. Lege das Herz in die Agarschale.

Richten Sie das Herz im Agar aus, um es zu fotografieren. Die Probe kann nach jedem Bild in alle möglichen Ausrichtungen gedreht werden. Verwenden Sie Overhead, Licht und kurze Belichtungszeiten, um die Herzen zu fotografieren.

Nehmen Sie die Lichtqualität anhand der Belichtung nach Bedarf an, um das beste Foto zu erhalten. Ein Beispiel für ein gut präpariertes, sauberes Herz ist hier zu sehen. Jedes Herz weist einige Unterschiede in der Gesamtmorphologie auf, aber das Herz sollte nach seiner Entwicklung vollständig sein und einen intakten Ventrikelvorhof und eine knollige Arteriose enthalten.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Herzentwicklung von Zebrafischen, um die Herzreifung in verschiedenen Stadien der Zebrafischentwicklung zu erforschen.