Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die elektrophysiologische Aktivität von kultivierten Zellen über einen planaren Patch-Clamp-Chip zu erfassen. Dies wird durch Sterilisieren, Grundieren und Testen der Patch-Clamp-Chips erreicht, um das Wachstum der Zellkultur und die anschließende Überwachung ihrer elektrophysiologischen Aktivität zu ermöglichen. Nach dem Testen können die Chips gelagert werden, bis sie in einem zellbiologischen Labor wieder grundiert werden.

In einem nächsten Schritt werden Neuronen aus Gliedmaßen und Staus extrahiert und auf die Chips kultiviert. Abschließend werden die Chips mit einem Patch-Clamp-Verstärker verbunden, um die elektrophysiologische Aktivität der Zellen zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber den bestehenden Planer-Patch-Clamp-Chips besteht darin, dass sie für die Verwendung mit Neuronen geeignet ist, die eine Kultur etablieren und die Abfrage der synaptisch kommunizierenden Kommunikation in Neuronalen ermöglichen.

Diese Methode und der Ansatz ermöglichen ein besseres Verständnis der Ionenkanalfunktionen von erregbaren Zellen, die in ein neuronales Netzwerk eingebettet sind, sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen. Die Implikationen dieser Methode erstrecken sich auf die Pharmakologie, wo sie zur Durchführung von Wirkstoffscreenings auf Ionenkanäle und Rezeptorproteine mit mittlerem Durchsatz und hohem Informationsgehalt verwendet werden kann. Wir haben uns entschieden, diese Methode mit Schneckenneuronen zu demonstrieren, da diese Neuronen leicht positioniert und kultiviert werden können.

Und weil diese Neuronen das Netzwerk in der Kultur reformieren werden, eignen sie sich hervorragend als Mod-Studie zur Transformation. Noch wichtiger ist, dass diese Chips auch in anderen Zellsystemen wie Herz- und Krebszellen eingesetzt werden können. Die größte Herausforderung bei der Verwendung von planaren Patch-Clamp-Chips besteht darin, Chips mit sauberen Öffnungen, Beschichtungs- und Kultivierungszellen zu erhalten.

Unplugged Chips wären kontraproduktiv, daher werden alle Chips getestet, bevor sie verwendet werden. Der kritischste Punkt der elektrophysiologischen Beurteilung kommt nach der Kultivierung der Zellen. Es besteht in der Ausbildung des Giga-Siegels zwischen der Zellmembran und den billigen oberen beiden Rändern.

Alle plantaren Patch-Clamp-Chips, die zu diesem Zeitpunkt hergestellt werden, verwenden isolierte Zellen in Suspension und verlassen sich auf Sog, um Zellen zur Öffnung zu ziehen und eine Giga-Dichtung zu bilden. GigE-Bildung. Der Einsatz unserer Chips erfolgt spontan.

Während die Neuronen eine Kultur sind und nicht auf Saugkraft angewiesen sind, werde ich den Schritt der Chip-Sterilisation und des Screenings demonstrieren. Tanya wird die Beladung in einem zellbiologischen Labor erklären, Colin wird die Zellvorbereitung und -beschichtung veranschaulichen. Zum Schluss wird Marcia zeigen, dass unsere Aufnahmen gemacht wurden. Um diesen Vorgang zu beginnen, sterilisieren Sie die Chips in einem herischen basischen Plasmareiniger mit 0,1 bis 0,3 Millibar Restluftdruck für 15 Minuten bei einer maximalen Leistung von 18 Watt.

Durch die Plasmabehandlung wird der Chip auch hydrophil, was das Priming erleichtert. Setzen Sie anschließend die Glasröhren mit einem sterilen elastischen Laborsilikonschlauch ein, drei Zoll an einem Ende und einen Zoll am anderen Ende. Füllen Sie dann die Röhrchen mit steriler Standard-Phosphatpufferlösung und stellen Sie sicher, dass keine Blase eingeschlossen wird.

Clippen Sie den langen Silikonschlauch ab, während Sie das PBS vom kurzen Ende aus mit einer Atmosphäre unter Druck setzen. Lassen Sie dann den Druck im Fluidikkanal ab. Füllen Sie danach die Durchstechflasche mit einer Spritze mit PBS.

Tauchen Sie eine Silber-, Silberchlorid-Elektrode in das Fläschchen und eine Gegenelektrode in das kurze Rohr. Verwenden Sie ein Impedanzmessgerät, um zu bestätigen, dass der Zugangswiderstand zwischen 300 Kiloohm und drei Megaohm liegt und die Shunt-Kapazität zwischen 10 Pico-Ferriday und 25 Pico-Ferriday liegt. Spülen Sie anschließend den Fluidikkanal mit sterilem entionisiertem Wasser.

Leeren Sie das obere Fläschchen und wiederholen Sie den Spülvorgang zweimal. Tauchen Sie anschließend die Verpackung, um sie mit den Röhrchen zu splittern, 30 Minuten lang in frisches, steriles entionisiertes Wasser. Laden Sie dann andere Chips in einen sterilen Behälter, der mit sterilem entionisiertem Wasser gefüllt ist.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Chips hydrophil bleiben und vor Kontamination geschützt sind. Öffnen Sie einen Chipbehälter unter einer HEPA-gefilterten Laminar-Flow-Haube und entfernen Sie die Chips mit dem oberen Fläschchen nach unten, um eine Kontamination durch Verpackungsreste zu vermeiden, die auf der Wasseroberfläche schwimmen. Um Rückstände von der Chipoberfläche zu entfernen, spülen Sie das obere Fläschchen zweimal mit gefiltertem sterilem deionisiertem Wasser aus. Verbinden Sie ein Ende des elastischen Schlauchs, der mit dem Fluidikkanal verbunden ist, mit einer Druckspritze mit sterilem, gefiltertem deionisiertem Wasser.

Bei diesem System wird das Wasser in der Spritze durch einen Druckluftbehälter unter Druck gesetzt, der auf eine Atmosphäre eingestellt ist, um sicherzustellen, dass die Sterilitätsluft vor dem Eintritt in die Spritze gefiltert wird. Dieses System ist außerdem mit zwei Ein-Aus-Ventilen ausgestattet, die bei Bedarf eine Druckregelung ermöglichen. Klemmen Sie das Ausgangsende der Fluidik mit einem Hämostaten fest.

Öffnen Sie anschließend das Drucklufttankventil, um die Lösung unter Druck zu setzen. Öffnen Sie dann den Hämostaten am Ausgang der Fluidik, um den Chip mit frischem sterilem deionisiertem Wasser zu spülen. Klemmen Sie das Ausgangsende der Fluidik mit einem Blutstiller fest, um das Wasser durch die Öffnung nach oben zu drücken.

Um ein Abfließen von Wasser zu vermeiden, klemmen Sie den Eingang der Fluidik mit dem Hämostaten und schließen Sie die Ein-Aus-Ventile. Lösen Sie dann das Eingangsende des Schlauchs von der Spritze. Verstopfen Sie beide Enden des Schlauchs und entfernen Sie die Hämostaten.

Füllen Sie das obere Fläschchen mit dem gefilterten sterilen deionisierten Wasser. Setzen Sie als Nächstes den Deckel einer 35 Millimeter sterilen Schale auf den Boden einer 100 Millimeter sterilen Schale. Platzieren Sie anschließend einen Chip auf dem 35-Millimeter-Deckel und decken Sie ihn mit einem 100-Millimeter-Schalendeckel ab.

Um sicherzustellen, dass die Membran und die Öffnung der Chips frei von Schmutz oder Luftblasen sind, werden die Chips abgebildet. Wenn Schmutz oder Luftblasen vorhanden sind. Der Fluidikkanal und das obere Fläschchen werden wiederholt mit sterilem Wasser gewaschen.

Wenn die Ablagerungen oder Luftblasen nicht entfernt werden können, wird der Chip entsorgt. Sobald die Späne abgebildet sind, bringen Sie die Späne zurück zur Laminar-Flow-Haube. Ziehen Sie beide Enden des Schlauchs ab.

Befestigen Sie ein Ende des Schlauchs an einer Druckspritze mit physiologischen Medien und klemmen Sie das Ausgangsende des Schlauchs mit dem Blutstiller fest, um die unterirdische Flüssigkeit mit physiologischen Medien zu spülen. Öffnen Sie die Ein-Aus-Ventile und entfernen Sie den Hämostaten vom Ausgangsende des Schlauchs, um das physiologische Medium durch die Blendenklemme nach oben zu drücken, das Ausgangsende des Schlauchs mit der Hämostatenklemme, das Eingangsende des Schlauchs mit dem Hämostaten und schließen Sie die Ein-Aus-Ventile. Entfernen Sie anschließend das Eingangsende des Schlauchs von der Spritze und verschließen Sie beide Enden des Schlauchs mit Glasstopfen.

Entfernen Sie dann die Hämostatika. Entfernen Sie anschließend Wasser aus der oberen Durchstechflasche. Füllen Sie das obere Fläschchen mit gefiltertem sterilem Medium.

Legen Sie den Chip wieder in die 100-Millimeter-Schale. Legen Sie danach den Boden der 35-Millimeter-Schale in die 100-Millimeter-Schale und füllen Sie sie mit gefiltertem, sterilem deionisiertem Wasser, um die Feuchtigkeit anzureichern. Decken Sie dann die Schüssel bis zum Zeitpunkt des Anrichtens ab.

Um diesen Vorgang zu beginnen, entfernen Sie die äußere Schale von zwei bis drei Monate alten Li-Sacks mit einer stumpfen Pinzette. Dann betäuben Sie die Tiere in Limba-Kochsalzlösung mit 10% Listerin in einer laminaren Luftstromhaube. Stecke die Schnecken in eine mit Limba-Kochsalzlösung gefüllte Cell Guard-Schale und entferne das gesamte Gehirn.

Behandeln Sie anschließend die isolierten Gehirne in definierten Medien 18 Minuten lang mit dem Trypsin-Enzym. Behandeln Sie sie danach in definierten Medien und Trypsin-Inhibitoren. Stecken Sie das Gehirn 15 Minuten lang mit einer feinen Pinzette und einer Präparierschere an eine kleine Zellschutzschale, die mit hochosmolaritätsdefinierten Medien gefüllt ist.

Entfernen Sie die äußere und innere Hülle der interessierenden Ganglien und legen Sie die Neuronen frei. Als nächstes befestigen Sie eine feuerpolierte Glaspipette, die mit einem stark osmolaritätsdefinierten Medium gefüllt ist, an einer Mikrospritze, die sanft in der Nähe der interessierenden Zelle saugt, bis das Neuron det vom Gehirn anheftet und in der Pipette suspendiert ist. Nachdem Sie das Medium in der Fluidik des Neurochips auf eine geeignete Aufzeichnungslösung umgestellt haben, kippen Sie die Glaspipette in ein Kulturfläschchen und belichten Sie das Neuron vorsichtig auf der Öffnung des Chips.

Lassen Sie die Zellen mindestens zwei Stunden lang ungestört bei Raumtemperatur ruhen, um ihre Anheftung an die Chipoberfläche, die die Apertur umgibt, zu fördern. Ersetzen Sie die Lösung in der Kulturschale durch die geeignete Aufzeichnungslösung Für die Stabilität. Kleben Sie den Chip auf einen Objektträger und legen Sie ihn unter ein Mikroskop, um die Chips mit dem Verstärker zu verbinden.

Schneiden Sie das lange Ende des Schlauchs ab und führen Sie den silbernen Draht ein, der mit dem Kopftisch verbunden ist. Legen Sie dann die Referenzelektrode in die Chipkulturschale. Der Chip ist nun bereit für die Aufnahme.

Hier zeigt ein Beispiel für die Spannungsreaktionen eines linken Pedals dorsal ein Neuron auf abgestufte Reihen von intrazellulären Stromimpulsen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die elektrophysiologische Aktivität von kultivierten Zellen mit einem planaren Patch-Clamp-Chip aufzeichnen können. Denken Sie daran, dass wir im ersten Schritt Chips screenen, um sicherzustellen, dass nicht verwendete Zellen eine verstopfte Ture Biologie Benutzer beginnen mit dem Ladeschritt und finden in der Regel noch ein paar Blockchips für jede Charge.

Diese neue Methode stellt einen wichtigen Durchbruch bei der Entwicklung einer billigen Technologie dar, die die Abfrage von in vitro neuronalen Netzen mit einem noch nie dagewesenen Auflösungsniveau ermöglicht. Diese Technologie kann zu fortschrittlichen Assays für die Identifizierung therapeutischer Ziele, die Arzneimittelentwicklung und die diagnostische Bewertung führen. Die Weiterentwicklung dieser Technologie wird Gesundheitsforschern neue Möglichkeiten bieten, neuartige Therapien für neurologische Erkrankungen oder Störungen zu erforschen.

Sein Potenzial erstreckt sich auf Herzzellen, Krebs und andere Zellen, die elektrogene oder Eigenschaften haben.