Name: Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Lernen Sie die Züchtung und Elektrophysiologie von Neuronen auf NRCC Patch-Clamp-Chips. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung ionenkanalvermittelter Aktivität in neuronalen Netzwerken für pharmakologische Screening-Verfahren.

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Die Autoren möchten sich Alexei Bogdanov für die Herstellung von Patch-Clamp-Chips an der CPFC und Hue Tran, Ping Zhao und Matthew Shiu für die Unterstützung bei der Montage zu bestätigen. Naweed Syed wurde von einem kanadischen Institute of Health Research (CIHR) Zuschuss unterstützt. Collin Luk ist der Empfänger von NSERC und Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) Stipendien.

1. Chipherstellung Der Prozess in 6 Ergebnisse in einer 3 um dicken freistehenden Film, einem niedrigen Widerstand 1 MOhm-Zugang und eine glattflächige trichterförmige Öffnung, die eine intime Dichtung mit der Zelle 9 erleichtert beschrieben, siehe Abbildung 2. Die Chips vereinzelt werden und verklebt Plexiglas Pakete mit der Öffnung in Richtung eines Lochs Verbinden des Chips mit einem unterirdischen Kanal. Das Kleben wird in einer Weise, die Shunt-Kapazität minimiert auf eine nominale 17 pF verzichtet. Pakete werden mit zwei 1,5 mm Durchmesser und 6 mm langen Glasröhrchen als fluidische Anschlüsse (Abbildung 3) ausgerüstet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="2"> Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von einem fokussierten Ionenstrahl Abschnitt eines NRCC Patch-Clamp-Chip zeigt eine glatte Oberfläche und Siliziumdioxid Trichterform, die intimen Kontakte Zelle begünstigt, und eine flache Öffnung, dass nur einen geringen Zugang WiderstandsthermometerE. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="2"> Abbildung 3. Ein Chip wird am unteren Rand der Kultur Fläschchen in einem Plexiglas-Paket mit unterirdischen Fluidik und Glasröhren eingebaut geklebt. 2. Sterilisation, Grundieren und Prüfung Die folgenden Schritte sollten in einem Biologie Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um eine Verunreinigung oder Verstopfung der Öffnung zu vermeiden. <ul type="disc"><li> Sterilisieren Chips in einem basischen Harrick Plasma Reiniger (www.harrickplasma.com) mit einem 0,1 bis 0,3 mbar Restdruck für 15 Min. bei einer maximalen Leistung von 18 W. Andere Luftplasma können verwendet werden mit vergleichbaren Leistungsdichte (24 mW / cm 3) und wobei das Produkt der Leistungsdichte und die Zeitkonstante. Die Plasma-Behandlung macht auch die Chips hydrophil, was erleichtert die Grundierung. </li><li> Fit Glasröhren mit sterilem Silastic Laboratory Silikonschlauch, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96.115 bis 08), 3inch auf einer Seite, 1 cm auf der anderen Seite. </li><li> Füllen Sie Fluidik durch die Rohre mit sterilfiltriert Standard-Phosphatpuffer (PBS) darauf achten, keine Blase gefangen ist. </li><li> Befestigen Sie den langen Silikonschlauch, während unter Druck setzen des PBS von der kurzen Seite bei 1 atm. Ein Pool von PBS sickert durch die Öffnung sichtbar sein in der Ampulle. Stecken Sie den Druck liefert der PBS und nehmen Sie den kurzen Silikonschlauch von diesem Angebot. </li><li> Füllen Fläschchen mit gefilterter, PBS mit einer Spritze. </li><li> Tauchen eine Ag / Ag: Cl-Elektrode in der kurzen Röhre und eine Gegenelektrode in der Ampulle. Eine Impedanz-Meter wird verwendet, um zu bestätigen, dass der Zugang Widerstand ist zwischen 300kohm und 3Mohm und der Shunt-Kapazität liegt zwischen 10pF und 25pF. Ein Chip mit einem geringeren Widerstand ist wahrscheinlich ein Leck haben, und eine höhere Kapazität gilt als nicht für den Einsatz, da sie nicht erfassen kann, die schnellste Dynamik der Zelle Elektrophysiologie 6. Ein Chip mit einer geringeren Kapazitätoder höher wird als Widerstand angeschlossen, obwohl es könnte einfach sein, dass eine Blase in der Öffnung eingeschlossen ist. Einige Chips sind nach 1H erneut getestet und die richtige elektrochemische Impedanz haben. </li><li> Spülen Sie das Fluidik-Kanal mit sterilem, deionisiertem Wasser; leeren Sie den Top-Fläschchen und spülen Sie mit der gleichen, zweimal. </li><li> Tauchen Sie den verpackten Chip mit Röhren in frischem sterilem, deionisiertem Wasser für 30 Minuten laden Sie dann mit anderen Chips in einem sterilen Behälter mit sterilem, deionisiertem Wasser gefüllt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Späne hydrophilen und vor Verunreinigungen geschützt bleiben. </li></ul> 3. Chips Vorbereitung in der Zellbiologie-Labor Die folgenden Schritte in einem HEPA-Filter Laminarströmungshaube unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, müssen alle Lösungen in diesem Verfahren verwendet gefiltert vor der Anwendung mit Hilfe eines 0,22 &amp;mgr; m-Filter sterilisiert werden. <ul type="disc"><li> Öffnen Sie ein Chip-Container unter einem HEPA-Filter Laminarströmungshaube und entfernen Sie Späne von container dem Gesicht nach unten zu vermeiden Schöpfen möglich schwimmende Verunreinigungen in Top-Fläschchen. </li><li> Spülen Sie oben auf der Chip 2x Fläschchen mit frisch gefiltert sterilem, deionisiertem Wasser, um das restliche Schmutz von der Chip-Oberfläche zu entfernen. </li><li> Saugen Sie sterilem, deionisiertem Wasser aus der Spitze Fläschchen. </li><li> Ein Ende des Silasticschlauch an dem fluidischen Kanal auf einem unter Druck stehenden Spritze mit sterilfiltriert entionisiertem Wasser. In unserem System sind Spritzen mit Lösung gefüllt unter Druck durch Anschluss an einen Druckluftbehälter eingestellt 20psi. Um die Sterilität zu gewährleisten, wird die Luft filtriert (0,22 um Filter) vor dem Eintritt in die Spritze und unserem System hat auch einen Ein / Aus-Ventil, das uns zu stoppen oder Druck bei Bedarf ermöglicht. </li><li> Verwendung einer Klemme, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs. </li><li> Öffnen des Ein / Aus-Ventile, um die Lösung unter Druck zu setzen. </li><li> Um die subterranen fluidischen des Chips mit frischem sterilem, deionisiertem Wasser gespült, Ausspannen das Ausgangsende des Schlauchs. </li><li> Umce das Wasser durch die Öffnung, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs mit einer Klemme. </li><li> Um Wasserableitung zu vermeiden, klemmen Sie die Input-und Output Enden der Schläuche mit einem Hämostaten und schließen Sie den Ein / Aus-Ventile. </li><li> Trennen Sie die Eingabe Ende des Schlauches aus der Spritze. </li><li> Legen Sie Glasstopfen in beide Enden des Schlauches und entfernen Sie die Hämostaten. </li><li> Füllen Sie oben Fläschchen mit Filter steriled deionisiertem Wasser. </li><li> Setzen Sie den Deckel eines 35 mm sterile Schale in die Basis eines 100 mm sterile Schale </li><li> Ort Chip auf der Oberseite des Deckels 35 mm und Deckel mit 100 mm-Schale Deckel. </li><li> Bild-Chips, um sicherzustellen, dass die Membran und die Blende der Chips frei von Schmutz und / oder Luftblasen sind. In unserem Labor haben wir eine aufrechte Mikroskop und ein 20x-Objektiv mit großem Arbeitsabstand zu verwenden. </li><li> Wenn Schutt und / oder Luftblasen vorhanden sind, wiederholt spülen Fluidikkanal und Top-Fläschchen. Wenn die Ablagerungen und / oder Luftblasen nicht entfernt werden kann der Chip wird verworfen. </li><li> Sobald die Chips sindabgebildet werden, um Laminarströmungshaube zurück und ziehen Sie beide Enden des Schlauchs. </li><li> Ein Ende des Schlauchs an einem unter Druck stehenden Spritze mit physiologischen Medien. </li><li> Klemme die Ausgabe Ende des Schlauchs mit einer Klemme </li><li> Druckventil öffnen, entfernen Sie die Gefäßklemme vom Ausgang Ende der Fluidik und spülen Sie die Fluidik-Kanal mit physiologischen Medien </li><li> Um die unterirdische fluidischen mit physiologischen Medien Spülen der Ein / Aus-Ventile zu öffnen und die Gefäßklemme aus dem Ausgangsende des Schlauchs. </li><li> Um die physiologischen Medien zwingen aufwärts durch die Öffnung, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs mit einer Klemme. </li><li> Klemme Eingangsende des Schlauchs mit einer Klemme zu schließen und die Ein / Aus-Ventile. </li><li> Entfernen Sie die Eingabe Ende des Schlauches aus der Spritze und stecken Sie beide Enden des Schlauches mit Glas-Stopfen. </li><li> Entfernen Sie die Hämostaten. </li><li> Entfernen Sie das Wasser von oben Fläschchen. </li><li> Füllen Sie die Top-Fläschchen mit Filter sterilisiert physiologischen Medien. </li><li>Platzieren Sie den Chip wieder in die 100 mm Petrischale. </li><li> Legen Sie die Basis einer 35 mm-Schale in die 100 mm-Schale und füllen Sie ihn mit Filter sterilisiert deionisiertem Wasser auf Feuchtigkeit anzureichern. </li><li> Decken Sie die Schüssel, bis es Zeit für die Beschichtung ist </li></ul> 4. Zellaussaatdichten der Schnecke Neuronen Die Patch-Clamp-Chips geeignet sein können für eine Vielzahl von Zubereitungen. Derzeit testen wir unsere Chips mit Säugetieren primären kortikalen Neuronen und erhalten haben, vorläufige Ergebnisse mit Zellen für 14 Tage 7, was bedeutet, dass unsere Sterilisationsprotokoll angemessen ist und zeigt an, dass die Chips sind nicht im langfristigen Kulturen zytotoxischen kultiviert. Für die Zwecke dieses Protokolls wurden Schnecke Neuronen gewählt, weil sie eine einfache, aber gut etabliertes Modell zur neuronalen Elektrophysiologie 11 zu studieren, zu vertreten und es ist mit diesen Zellen, dass wir die wichtigsten Ergebnisse bisher 10 erhalten. Detaillierte Zelle Isolierung und Kultivierung Verfahren habenbeschrieben zuvor 12, 13. <ul type="disc"><li> Entfernen Sie die äußere Schale von 2 bis 3 Monate alt Lymnaea stagnalis mit stumpfen Pinzette und Anesthetize Tiere in Lymnaea Kochsalzlösung, die 10% Listerine. Alle nachfolgenden Schritte durchgeführt aseptisch in einer Haube mit laminarer Strömung mit sterilisiertem Dissektion und-lösungen bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen physiologischen Medien in den Fluidik mit dem entsprechenden Recording-Lösung mit einer Eppendorf-Pipette. Im Falle von Neuronen Lymnaea die Lösung (in mM): 50 KCl, 5 MgCl 2, 5 Ethylenbis (oxyethylennitrilo) tetraessigsäure (EGTA) und 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES; pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Stecken Sie die Schnecken in eine Schüssel mit Sylgard Lymnaea Kochsalzlösung gefüllt und entfernen gesamte Gehirn wie zuvor 13 beschrieben </li><li> Behandeln Sie das Isolated Gehirn in definierten Medien (DM) mit Trypsin-Enzym (0,2% Lösung, Sigma, Katalog-Nr T-9201) für 18 Minuten durch Behandlung in DM und Trypsin-Inhibitor (Sigma, Sojabohne, Katalog-Nr T-9003) für 15 Minuten. </li><li> Stecken Sie die Köpfe in eine kleine Schüssel mit Sylgard hohe Osmolarität definierten Medien gefüllt (HODM - DM mit Glucose zugegeben, 750 &amp;mgr; l 1 M Glucose-Lösung zu 20 ml DM). </li><li> Mit einer feinen Pinzette und Schere Dissektion, entfernen Sie die äußere und die innere Hülle der Ganglien des Interesses, das Aussetzen der Neuronen. </li><li> Mit Hilfe eines feuerpolierte Glaspipette mit HODM gefüllt und an einer Mikrospritze gelten sanfte Saugwirkung in der Nähe der Zelle von Interesse (linkes Pedal dorsalen 1), bis das Neuron löst aus dem Gehirn und wird in der Pipette suspendiert. </li><li> Die Glaspipette wird dann bewegt, und tauchte in einzelne Neurochips wo sanfte Vertreibung aus der Mikroliterspritze ermöglicht die Neuronen zu sanft geschoben werden aus der Pipette und auf der Oberseite der einzelnen Patch-Löcher auf den Chips.</li><li> Willkommen Zellen zu sitzen für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur ungestört ihre Befestigung an dem Chip die Öffnung umgebenden Fläche zu präsentieren. </li></ul> 5. Elektrophysiologischen Ableitungen Um die Chips an den Verstärker anschließen (in unserem Fall ein Multiclamp 700B Verstärker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Ersetzen Sie die Lösung in der unterirdischen fluidischen und in der Chip-Fläschchen mit den entsprechenden Recording-Lösungen. Bei Lymnaea Neuronen, die oberen Kulturkammern mit Lymnaea Kochsalzlösung gefüllt (in mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl 2, MgCl 2 und 1,5), gepuffert auf pH 7,9 mit HEPES 14. </li><li> Für Stabilität, Leim der Chip auf einen Objektträger und legen Sie sie unter dem Mikroskop. </li><li> Um den Chip an den Verstärker (in unserem Fall ein Multiclamp 700B Verstärker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) verbinden, schneiden Sie das eine Ende des Schlauchs und legen Sie eine Silver Draht ist mit dem Kopf-Stufe verbunden ist. </li><li> Legen Sie die Referenz-Elektrode in der oberen Ampulle des Chips. </li><li> Der Chip ist nun bereit für die Aufnahme. </li><li> Tragen Sie eine 5 mV Schritt mit dem Verstärker zu messen Gesamtwiderstand (R t) und bestimmen Sie die Konfiguration der Neuronen: Cell-Attached-(R t&gt; 1 G), Whole-Cell-(Rt = 50-100 MOhm sowie kapazitive Transienten, indikative der Blasensprung über der Öffnung); oder ohne Dichtung (R t &lt;5 MW). In der letzten Reihe von Experimenten 10, 58% Prozent der Zellen mit hohem Widerstand Dichtungen hatte und von denen, zeigten 80% der Zellen erregbaren Reaktionen. </li></ul> 6. Repräsentative Ergebnisse <ul type="disc"><li> Anwenden depolarisierende Stromimpulse (20 pA TZ) mit dem Neuron (in diesem Fall LPeD1). </li><li> Halten Sie das Neuron bei Vm Nähe seiner Ruhepotential (~ - 60 mV). </li><li> Beachten Sie die Antworten auf diese depolarisierenden Pulsen. Überschwingen Aktionspotentiale solltebeobachtet werden, wenn das Neuron ist lebensfähig werden. </li><li> 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis die im Detail in 14, 15 wird diskutiert. </li></ul><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Spannungsantworten (oben) von einem Neuron zum LPeD1 abgestufte Reihe von intrazellulären Stromimpulse (unten). 60mV - Die Stromimpulse wurden bei Vm = angewendet. Fehlerbehebung <ul type="disc"><li> Vor der Beschichtung, um festzustellen, ob Bild-Chips Membran und Blende frei von Schmutz und geeignet für die Beschichtung sind. Wir verwenden ein aufrechtes Mikroskop und ein 20x-Objektiv mit großem Arbeitsabstand. In unserer letzten Versuchsreihe 1 wurden 67% Prozent der Chips erfolgreich in dieser Weise grundiert. </li><li> Wenn Schutt und / oder Luftblasen sind zu verwerfen Chip und versuchen Sie einen anderen. </li><li> Verschiedene Oberflächenbehandlungen (Plasma) oder Beschichtungen (PDL, PEI usw.) können ausprobiert werden, aber Erfolg kann stark abhängig von Zelltypverwendet. </li><li> Die Zusammensetzung des fluidischen ("Pipette")-Lösung in kritisch für die Bildung der Giga-Dichtung und die ganze Zellen. Passen Lösung unter Beachtung Osmolarität, pH-Wert und ionischen Make-up. </li><li> Für längerfristige Kultur, mit den Medien in mikrofluidischen Kanal beginnen, wechseln Sie dann in Lösung vor Pipette zur Aufnahme über sanfte Schwerkraft-Perfusion (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

<ol><li>Walz, W. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, Springer Protocols. 38(2007).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Behrends, J. C., Fertig, N. Ch. 14: Planar Patch-clamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrends%2C+JC+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, (2007).</li>
<li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li>
<li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li>
<li>National Research Centre of Canada . , Candian Photonics Fabrication Centre. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html">http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html</a> (c1995-2001).</li>
<li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology & Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li>
<li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li>
<li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P. In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyed%2C+NI+%22Modern+techniques+in+neuroscience+research%22">Modern techniques in neuroscience research</a>. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. (1999).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li>
<li>Ong, W. -L., Yobas, L., Ong, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay%3A+gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187(2006).</li>
<li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li>
<li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. omas, Monette, T., Py, R., A, C. K. rantis, Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li>
<li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li>
<li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaketani%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology%3A+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

NKR Patch-Clamp-Chip Verhör-Plattform ist ein potenziell mächtiges Werkzeug für hohen Informationsgehalt Pharma-Assays und in vitro-Modelle von Krankheiten zu untersuchen. Seine Vorteile im Vergleich zu Glas-Pipetten sind eine niedrige Zugriffszeit Widerstand, was ein Vorteil für große Zellen zu untersuchen ist, und trotz einer etwas größeren Kapazität wird in vergleichbarer Dynamik für kleinere Zellen führen. Spontane Zelle Öffnung Dichtungen wurden routinemäßig erhalten, und Ganzzell-Eintrag wurde beobachtet, dass spontane 14 sein. Ein deutlicher Unterschied zwischen den Chips und der Glaspipette Verfahren ist die Tatsache, dass die Sonde ein Teil der Zellkulturschale ist und nicht manuell in Kontakt mit der Zellmembran gebracht. Kultivierung von Zellen, möglicherweise Teil der funktionalen Netzwerke, führt zu mehr biologisch relevanten Modelle als Krankheitsmodelle, und ein anderer Mechanismus zur Sicherung von Hochgeschwindigkeits-Zelle zu untersuchen Dichtungen 16. Jedoch, im Gegensatz zu Zellsuspensionen, Aspiration Cannot verwendet, um eine Zelle an der Sonde zu positionieren. Schnecke Neuronen, wie andere große Zellen, zugänglich sind, um manuelle Positionierung auf der Sonde. Für kleinere Zellen erfordern längere Kultivierungszeiten, haben wir die Notwendigkeit für Manipulationen vermieden und halten eine hohe Wahrscheinlichkeit, eine Dichtung durch Strukturieren Haftung Polypeptide auf der Sonden an Zellen auf der Sonden zu platzieren, und demonstriert die Positionierung von Zellen auf der Sonde 17,18. NKR ist auch die Entwicklung einer Polyimid-Mikrofluidik-Patch-Clamp-Chip 19 mit einer Kapazität vergleichbar mit der Glaspipette. Das ultimative Ziel dieses Projekts ist ein Multiple-Sonden Patch-Clamp-Chip, der die gleichzeitige Überwachung der elektrophysiologischen Aktivität mehrerer Neuronen im Verhalten des Netzwerks bei der Auflösung einzelner Ionenkanäle 14 in Eingriff. Erlaubt Dieses Verfahren ist ein hoher Auflösung komplementäre Methode zur Multi-Elektroden-Arrays 20.

die züchtung und elektrophysiologie von zellen auf nrcc patch-clamp-chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Aufgrund seiner exquisiten Sensibilität und die Fähigkeit zur Überwachung und Steuerung von einzelnen Zellen auf der Ebene der Ionenkanäle, ist Patch-Klemmung der Goldstandard der Elektrophysiologie angewendet, um Krankheitsmodelle und Pharma-Bildschirme gleichermaßen ein. Verfahren beinhaltet üblicherweise leicht Kontaktieren einer Zelle mit einer Glaspipette von einer physiologischen Lösung gefüllt, um einen Patch der Membran unter der Spitze 2 zu isolieren. Eine Elektrode in der Pipette eingeführt erfasst Ionenkanal-Aktivität in der Membranscheibe oder, wenn gebrochen, für die gesamte Zelle. Im letzten Jahrzehnt, Patch-Clamp-Chips wurden als Alternative 3, 4 vorgeschlagen worden: ein aufgehängtes Film trennt die physiologischen Milieu aus dem Kulturmedium, und einer Öffnung in der Folie mikrofabrizierten ersetzt die Spitze der Pipette. Patch-Clamp-Chips haben in automatisierten Systemen integriert und auf den Markt für High-Throughput-Screening-5. Um incrzu erleichtern Durchsatz, umfassen sie die fluidischen Abgabe von Zellen aus der Suspension, deren Anordnung auf der Öffnung durch Absaugen und automatischen Routinen Zelle-zu-Probe-Dichtungen erfassen und in einen ganzen Zellen-Modus. Wir haben uns auf die Herstellung eines Silizium-Patch-Clamp-Chip mit optimierter Impedanz und Form der Öffnung, die die hochwertige Aufzeichnung von Aktionspotentialen in kultivierten Neuronen Schnecke 6 ermöglicht berichtet, vor kurzem haben wir auch Fortschritte bei der Vernehmung von Säugetieren Neuronen 7 berichtet. Unsere Patch-Clamp-Chips mit der kanadischen Photonics Fabrication Centre 8, ein kommerzielles Gießerei hergestellt, und in großen Serien erhältlich. Wir sind gespannt, in Zusammenarbeit mit Elektrophysiologen, um die Nutzung des NKR-Technologie in verschiedenen Modellen zu validieren zu engagieren. Die Chips nach dem allgemeinen Schema in 1 dargestellt werden: der Silizium-Chip ist an der Unterseite eines Plexiglas Kultur überführt und die Rückseite der Öffnung zu einem unterirdischen chann verbundenel mit Röhren an jedem Ende des Pakets angebracht. Die Zellen werden in dem Fläschchen kultiviert und die Zelle am Anfang der Sonde durch eine Messelektrode im channel.The beiden äußeren fluidischen Schnittstellen ermöglichen Lösung Austausch mit minimaler Störung der Zelle eingefügt überwacht, das ist ein Vorteil gegenüber Glaspipetten für intrazelluläre Perfusion. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="1"> Abbildung 1. Prinzip der Messung mit dem NKR Patch-Clamp-Chip Wir beschreiben hier, die Protokolle zu sterilisieren und zu grundieren die Chips, laden Sie sie mit mittel-, Platten sie mit Zellen, und schließlich nutzen sie für elektrophysiologische Ableitungen.

Wir zeigen, wie planaren Patch-Clamp-Chips an der National Research Council von Kanada werden sterilisiert, grundiert, mit Medium geladen, mit Zellen ausplattiert, hergestellt und verwendet für elektrophysiologische Ableitungen.

Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Aufgrund seiner außerordentlichen Empfindlichkeit und der Fähigkeit, einzelne Zellen auf der Ebene von Ionenkanälen zu überwachen und zu steuern, ist das Patch-Clamping der Goldstandard ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die elektrophysiologische Aktivität von kultivierten Zellen mithilfe eines planaren Patch-Clamp-Chips aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem die Patch-Clamp-Chips sterilisiert, präpariert und getestet werden, um das Wachstum von Zellkulturen und die anschließende Überwachung ihrer elektrophysiologischen Aktivität zu ermöglichen. Nach dem Testen können die Chips aufbewahrt werden, bis sie in einem Zellbiologielabor erneut präpariert werden.Im nächsten Schritt werden Neuronen aus Gliedmaßen entnommen, kultiviert und auf die Chips aufgebracht. Abschließend werden die Chips mit einem Patch-Clamp-Verstärker verbunden, um die elektrophysiologische Aktivität der Zellen zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber den bestehenden planaren Patch-Clamp-Chips besteht darin, dass sie für die Verwendung mit Neuronen geeignet ist, die eine Kultur bilden, wodurch die Untersuchung synaptisch kommunizierender, in neuronalen Netzwerken miteinander verbundener Zellen ermöglicht wird.Diese Methode und der gewählte Ansatz ermöglichen ein besseres Verständnis der Ionenkanalfunktionen erregbarer Zellen, die in einem neuronalen Netzwerk unter normalen sowie pathologischen Bedingungen eingebettet sind. Die Bedeutung dieser Methode reicht bis in die Pharmakologie, wo sie zur Durchführung von mittelhochdurchsatzfähigen, informationsreichen Arzneimittelscreenings für Ionenkanäle und Rezeptorproteine genutzt werden kann. Wir haben uns entschieden, diese Methode an Schneckenneuronen zu demonstrieren, da diese Neuronen leicht positioniert und kultiviert werden können.Und da diese Neuronen im Kulturmedium wieder ein Netzwerk bilden, eignen sie sich hervorragend als Modell für Transformationsstudien. Noch wichtiger ist, dass diese Chips auch in anderen Zellsystemen wie Herzmuskel- und Krebszellen verwendet werden können. Die Haupt herausforderung bei der Verwendung planarer Patch-Clamp-Chips besteht darin, Chips mit sauberen Öffnungen sowie eine erfolgreiche Zellplattierung und -kultivierung zu erzielen.Abgenommene Chips wären kontraproduktiv, daher werden alle Chips getestet, bevor sie verwendet werden. Der kritischste Punkt der elektrophysiologischen Beurteilung ergibt sich, sobald die Zellen kultiviert wurden. Er besteht in der Bildung der Giga-Dichtung zwischen der Zellmembran und dem preiswerten oberen Rand.Alle hergestellten plantaren Patch-Clamp-Chips verwendeten isolierte Zellen in Suspension und nutzten eine Saugkraft, um die Zellen zur Öffnung zu ziehen und einen Giga-Seal zu bilden. Die Bildung des Giga-Seals erfolgt bei Verwendung unserer Chips spontan.Während die Neuronenkultur nicht auf Saugung basiert, werde ich den Sterilisationsschritt und die Überprüfung des Chips demonstrieren. Tanya wird das Beladen in einem zellbiologischen Labor erklären, Colin wird die Zellpräparation und das Ausplattieren veranschaulichen. Schließlich wird Marcia zeigen, wie unsere Aufnahmen durchgeführt werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, sterilisieren Sie die Chips in einem Heric-Basic-Plasmareiniger mit einem Restluftdruck von 0,1 bis 0,3 Millibar für 15 Minuten bei der maximalen Leistung von 18 Watt.Die Plasmabehandlung macht den Chip außerdem hydrophil, was das Befüllen erleichtert. Anschließend befestigen Sie die Glasröhrchen mit steriler elastischer Labor-Silikon-Schlauchleitung, drei Zoll an einem Ende und ein Zoll am anderen Ende. Danach füllen Sie die Röhrchen mit steriler Standard-Phosphatpufferlösung, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Blase eingeschlossen wird.Klemmen Sie den langen Silikonschlauch ab, während Sie das PBS von der kurzen Seite bei einem Atmosphärendruck unter Druck setzen. Danach lassen Sie den Druck im fluidischen Kanal ab. Füllen Sie anschließend das Fläschchen mit PBS unter Verwendung einer Spritze. Tauchen Sie eine Silber-Silberchlorid-Elektrode in das Gefäß und eine Gegenelektrode in das kurze Rohr ein. Bestätigen Sie mithilfe eines Impedanzmessgeräts, dass der Zugangswiderstand zwischen 300 Kiloohm und drei Megaohm liegt und die Streukapazität zwischen 10 Pikofarad und 25 Pikofarad beträgt. Spülen Sie anschließend den fluidischen Kanal mit steriler entionisierter Wasser durch.Leeren Sie die obere Vial und wiederholen Sie den Spülvorgang zweimal. Tauchen Sie anschließend das Chip-Paket mit den Röhrchen in frisches, steriles, entionisiertes Wasser für 30 Minuten ein. Danach laden Sie andere Chips in einen sterilen Behälter, der mit sterilem, entionisiertem Wasser gefüllt ist.Dadurch wird sichergestellt, dass die Chips hydrophil bleiben und vor Kontamination geschützt sind. Öffnen Sie einen Chip-Behälter unter einer HEPA-gefilterten laminarer Luftströmungshaube und nehmen Sie die Chips heraus, wobei das obere Gefäß nach unten gerichtet ist, um eine Kontamination durch Verpackungsreste, die auf der Wasseroberfläche schwimmen, zu vermeiden. Um eventuelle Rückstände von der Chip-Oberfläche zu entfernen, spülen Sie das obere Gefäß zweimal mit filtriertem, sterilen, entionisiertem Wasser aus. Verbinden Sie ein Ende des elastischen Schlauchs, der an dem fluidischen Kanal befestigt ist, mit einer Druckspritze, die steriles, filtriertes, entionisiertes Wasser enthält.In diesem System wird das Wasser in der Spritze durch einen Druckluftbehälter, der auf ein Atmosphärendruck eingestellt ist, unter Druck gesetzt, wobei vor dem Eintritt in die Spritze sicherheitshalber die Luft filtriert wird, um Sterilität zu gewährleisten. Das System ist außerdem mit zwei Ein-Aus-Ventilen ausgestattet, die bei Bedarf die Druckregelung ermöglichen. Klemmen Sie das Ausgangsende der Fluidik mit einem Hämostatikum ab.Öffnen Sie als Nächstes das Ventil des Druckluftbehälters, um die Lösung unter Druck zu setzen. Öffnen Sie dann den Hahn am Ausgangsende der Fluidik, um den Chip mit frischem, sterilen, entionisiertem Wasser zu spülen. Klemmen Sie das Ausgangsende der Fluidik mit einem Hahn ab, um das Wasser durch die Öffnung nach oben zu zwingen.Um einen Wasserverlust zu vermeiden, verschließen Sie den Eingang der Fluidik mit der Hämoclip und schließen Sie die Ein-Aus-Ventile. Trennen Sie dann das Eingangsende des Schlauchs von der Spritze. Verschließen Sie beide Enden des Schlauchs und entfernen Sie die Hämoclips.Füllen Sie das obere Gefäß mit dem filtrierten, sterilen, entionisierten Wasser. Stellen Sie danach den Deckel einer sterilen 35-Millimeter-Schale auf den Boden einer sterilen 100-Millimeter-Schale. Legen Sie anschließend einen Chip auf den 35-Millimeter-Deckel und decken Sie ihn mit dem Deckel einer 100-Millimeter-Schale ab.Um sicherzustellen, dass die Membran und die Öffnung der Chips frei von Rückständen oder Luftblasen sind, werden die Chips abgebildet. Falls Rückstände oder Luftblasen vorhanden sind, werden der fluidische Kanal und das obere Gefäß wiederholt mit steriler Wasser durchgespült.Wenn die Partikel oder Luftblasen nicht entfernt werden können, wird der Chip entsorgt. Sobald die Chips abgebildet wurden, bringen Sie die Chips zurück in die laminare Luftströmungshaube. Ziehen Sie beide Enden der Schläuche ab.Verbinden Sie ein Ende des Schlauchs mit einer Druckspritze, die physiologisches Medium enthält, und klemmen Sie das Ausgangsende des Schlauchs mit dem Hähnchen, um das unterirdische Fluidsystem mit physiologischem Medium zu spülen. Öffnen Sie die Ein-Aus-Ventile und entfernen Sie den Hähnchen vom Ausgangsende des Schlauchs, um das physiologische Medium durch die Öffnung zu drücken. Klemmen Sie anschließend das Ausgangsende des Schlauchs mit dem Hähnchen, das Einlassende des Schlauchs mit dem Hähnchen und schließen Sie die Ein-Aus-Ventile. Danach trennen Sie das Einlassende des Schlauchs von der Spritze und verschließen beide Enden des Schlauchs mit Glasstopfen.Entfernen Sie dann die Hämostaten. Anschließend wird das Wasser aus dem oberen Gefäß abgenommen. Füllen Sie das obere Gefäß mit filtriertem, sterilen Medium.Stellen Sie den Chip zurück in die 100 Millimeter-Dish. Danach setzen Sie den Boden der 35 Millimeter-Dish in die 100 Millimeter-Dish ein und füllen ihn mit filtriertem, sterilem, deionisiertem Wasser, um die Luftfeuchtigkeit anzureichern. Anschließend verschließen Sie die Dish bis zum Zeitpunkt der Ausplattierung.Um dieses Verfahren zu beginnen, entfernen Sie mit einer stumpfen Pinzette die äußere Schale von zwei bis drei Monate alten Li-Sags. Betäuben Sie die Tiere anschließend in Limba-Salzlösung, die 10 % Listerine enthält, in einer laminarer Luftstromhaube. Fixieren Sie die Schnecken in einer Zellkultur-Schale, die mit Limba-Salzlösung gefüllt ist, und entfernen Sie das gesamte Gehirn.Behandeln Sie anschließend die isolierten Gehirne in definiertem Medium 18 Minuten lang mit dem Enzym Trypsin. Danach behandeln Sie sie in definiertem Medium mit Trypsin-Inhibitor. Heften Sie die Gehirne mit einer feinen Pinzette und einer Präzisionsschere 15 Minuten lang in eine kleine Zellkulturschale, die mit einem hochosmolaren definierten Medium gefüllt ist, fest.Entfernen Sie die äußere und innere Hülle der gewünschten Ganglien und legen Sie die Neuronen frei. Befestigen Sie anschließend eine fein geschliffene Glaspipette, die mit einem hochosmolaren definierten Medium gefüllt ist, an einer Mikrospritze und üben Sie vorsichtig Saugkraft nahe der gewünschten Zelle aus, bis das Neuron sich vom Gehirn löst und in der Pipette suspendiert ist. Nachdem das Medium in der Fluidik des Neuro-Chips durch eine geeignete Ableitungslösung ersetzt wurde, führen Sie die Glaspipette in ein Kulturgefäß und bringen Sie das Neuron vorsichtig über der Öffnung des Chips zum Aufliegen.Lassen Sie die Zellen mindestens zwei Stunden lang ungestört bei Raumtemperatur stehen, um deren Anheftung an die Chipoberfläche im Bereich der Öffnung zu fördern. Ersetzen Sie die Lösung in der Kulturschale durch die geeignete Ableitungslösung, um Stabilität zu gewährleisten. Kleben Sie den Chip auf einen Objektträger und platzieren Sie ihn unter einem Mikroskop, um die Chips mit dem Verstärker zu verbinden.Schneiden Sie das lange Ende des Schlauchs ab und führen Sie den mit der Kopfstufe verbundenen silbernen Draht ein. Anschließend platzieren Sie die Referenzelektrode in der Kulturschale mit Chip. Der Chip ist nun bereit für die Aufnahme.Hier wird ein Beispiel der Spannungsantworten eines linken pedalen dorsalen Neurons auf gestufte Reihen intrazellulärer Strompulse gezeigt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die elektrophysiologische Aktivität kultivierter Zellen mit einem planaren Patch-Clamp-Chip aufzeichnet. Beachten Sie, dass wir im ersten Schritt Chips auswählen, um sicherzustellen, dass nicht verwendete Chips zum Aufbringen von Zellen verstopft sind; Ture-Biology-Nutzer beginnen beim Beladeschritt und finden typischerweise pro Charge dennoch einige blockierte Chips.Diese neue Methode stellt einen wichtigen Durchbruch bei der Entwicklung einer kostengünstigen Technologie dar, die die Untersuchung in vitro neuronaler Netzwerke mit bisher unerreichter Auflösung ermöglicht. Diese Technologie kann zu fortschrittlichen Assays für die Identifizierung therapeutischer Zielstrukturen, die Arzneimittelentwicklung und die diagnostische Beurteilung führen. Die weitere Entwicklung dieser Technologie wird Gesundheitsforschern neue Möglichkeiten eröffnen, neuartige Therapien für neurologische Erkrankungen oder Störungen zu erforschen.Sein Potenzial erstreckt sich auf Herzzellen, Krebszellen und andere Zellen mit elektrogenen Eigenschaften.

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