Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Wiederherstellung eines infektiösen Mu-Augen-Neurovirus unter Verwendung von zwei reversen genetischen Systemen. Hallo, ich bin Armando Arias von der Abteilung für Virologie am Imperial College of London. In unserer Gruppe sind wir daran interessiert, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die der Neurovirus-Replikation zugrunde liegen.

Noroviren sind eine der Hauptursachen für Gastroenteritis. Weltweit sind jetmolekulare Verfahren zu ihrer Charakterisierung noch relativ neu. Die Identifizierung neo-antiviraler Ansätze und Einblicke in den Lebenszyklus von Neuroviren waren bisher begrenzt, da sie nicht in der Lage waren, eine produktive Infektion in Zellkultur durchzuführen.

Die kürzliche Isolierung eines antiviralen Medikaments, das in der Lage ist, Mäuse zu infizieren und Zellkulturen zu vermehren, nämlich des Spiegelneurovirus, hat neue Wege für die Erforschung dieser wichtigen Krankheitserreger eröffnet. In diesem Bericht werden wir zwei Strategien aufzeigen, die die Erzeugung von genetisch definierten Neurovirus-Isolaten in Zellkultur ermöglichen. Beide Strategien basieren auf der Erzeugung von viralen Transkripten, die am fünf Primzahlen begrenzt sind.

Die erste beinhaltet die Synthese beim Verschließen von viraler RNA in vitro vor der Transfektion in die Zellen. Der zweite Ansatz beinhaltet die Transkription von MI-Neurofläschchen, CDNA in Zellen, die T sieben RNA-Polymerase exprimieren. Das Protokoll für die Gewinnung von Neuro-Noroviren aus gekappten RNA-Transkripten wird durch lineares Ansteigen eingeleitet.

Das Plasmid, das MV CD NA für mmv eins enthält. Dies geschieht mit dem Restriktionsenzym NHE one. Die DNA wird anschließend in vitro mit Hilfe der T-Sieben-RNA-Polymerase in RNA transkribiert.

Anschließend wird das M-M-V-R-N-A in vitro verschlossen und in Zellen transfiziert, um die Wiederherstellung von infektiösem MMV zu ermöglichen direkte Rückgewinnung von infektiösem MNV unter Verwendung des FAL PX-Virus, das T-sieben-RNA-Polymerase exprimiert für die MMV-Wiederherstellung aus direkt transfizierten cDNA-Klonen, die Zellen werden zunächst mit einem rekombinanten FAL PX-Virus infiziert, das T-sieben-RNA-Polymerase exprimiert. Die FAL-PX-Infektion führt zur Expression von T-sieben-RNA-Polymerase sowie viraler RNA Verdeckelung von Enzymen, die einen Teil der synthetisierten RNA verschließen können. Das M-M-V-C-D-N-A wird dann durch lipidvermittelte Transfektion in die FPV-infizierten Zellen transfiziert. Die T-7-RNA-Polymerase produziert dann das M-M-V-R-N-A, von dem einige dann von der F-P-V-R-N-N-A-Verschließmaschine verschlossen werden können.

Eine Ribo-Zym-Sequenz garantiert, dass jedes RNA-Transkript ein definiertes Ende mit drei Primzahlen enthält. Die gekappten MMV-Transkripte werden dann vor der Replikation in ein Protein übersetzt, was zur Produktion neuer infektiöser Partikel führt. Protokoll für die RNA-Transkription und das Capping zur Wiederherstellung der infektiösen MMV-Synthese von infektiös gedeckelten MMV-Transkripten.

Mischen Sie zunächst die folgenden Reagenzien, Transkription, Puffernukleotide, Wasser und linearisiertes Plasmid, das das M-M-V-C-D-N-A enthält. Fügen Sie dann RNA in und T sieben RNA-Polymerase zum Reaktionsgemisch hinzu. Hierfür stehen viele kommerzielle Kits zur Verfügung, die eine reproduzierbare Methode zur RNA-Synthese bieten.

Die Transkriptionsreaktion wird durchgeführt, indem die Mischung mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Analysieren Sie einen kleinen Alkot dieser Transkriptionsreaktion auf einem nicht denaturierenden Agros-Gel. Reinigen Sie zuerst das Gel-Gerät mit dem Reinigungsmittel und waschen Sie es vor dem Gebrauch mit RNA-freiem Wasser.

Stellen Sie sicher, dass Agros-Gele, die mit RNAs hergestellt werden, frei von Reagenzien sind. M-V-R-N-A läuft mit etwa drei Killerbasen auf einem nicht denaturierenden Agro-Rosen-Gel. Darüber hinaus kann ein Agilent Bioanalyzer verwendet werden, um eine schnelle Methode zur Analyse der RNA-Integrität bereitzustellen.

Die RNA sollte dann aufgereinigt werden, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Es stehen viele Methoden zur Verfügung, aber in diesem Protokoll reinigen wir die RNA durch Lithiumchlorid-Fällung als kostengünstige Alternative und pelletieren die RNA durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, achten Sie darauf, das durchscheinende Pellet nicht zu beschädigen, und waschen Sie es mit 70 % Ethanol.

Resuspendieren Sie das MMV-Transkript in einer RNA-Speicherlösung und stellen Sie sicher, dass es vollständig aufgelöst wird. Das Erhitzen der RNA auf 65 Grad Celsius kann diesen Prozess später unterstützen. Quantifizieren Sie die RNA durch Spektrometrie.

Analysieren Sie die RNA-Integrität, indem Sie ein kleines Aliquot auf ein 1%iges, nicht denaturierendes Agros-Gel auftragen. Wie Sie sehen können, sollte die RNA-Integrität nach der Lithiumchlorid-Fällung gleich bleiben, um die Deckelungseffizienz zu verbessern. Erhitzen Sie ein Aliquot der RNA 10 Minuten lang bei 65 Grad.

Stellen Sie das Rohr sofort auf Eis. Um eine Degradation oder Wiederfaltung zu vermeiden, ist eine Verschließreaktionsmischung wie vom Hersteller empfohlen herzustellen. In der Regel fügen wir etwa 60 Mikrogramm M-N-V-R-N-A zu einer Endreaktion von 100 Mikrolitern hinzu.

Obwohl die Reaktion herunterskaliert werden kann, gründlich gemischt und eine Stunde lang bei 37 Grad inkubiert, reinigen Sie die RNA wie bisher durch Lithiumchlorid-Fällung. Es ist wichtig, die Integrität der RNA noch einmal zu überprüfen, bevor mit der Transfektion fortgefahren wird. Stufenprotokoll für die MMV-Rückgewinnung durch RNA-Elektroporation in Rohzellen. Wiederbelebung.

Suspendieren Sie den Kolben mit den Rohzellen in DMEM. Stellen Sie sicher, dass Sie eine einzellige Suspension bilden. Bestimmen Sie die Konzentration lebensfähiger Zellen in einem Hämozytometer mit Hilfe des Trianblau-Ausschlusses.

Pelletieren Sie die Zellen und releben Sie sie vorsichtig. Suspendieren Sie sie in frischen antibiotikafreien Medien, aliquotieren Sie 8 Millionen Zellen pro Transfektion und pelletieren Sie sie in einer Mikrofuge. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen erneut in 500 Mikrolitern PBS-Zentrifuge, entfernen Sie das PBS, resuspendieren Sie die Zellen bei 130 Mikrolitern Raumtemperatur.

Neon-Reanimationssuspensionslösung. Fügen Sie die entsprechende Menge an gedeckelter RNA hinzu, typischerweise 1,3 Mikrogramm pro 130 Mikroliter Zellen, was einem Mikrogramm RNA pro 6 Millionen Zellen entspricht. Zellen, die mit Transkripten vermischt sind, werden in der 100-Mikroliter-Neon-Transfektionsspitze gesammelt.

dieser Phase sollte sehr darauf geachtet werden, dass keine Blasen entstehen. Dann wird der Elektrobetrieb mit einem einzigen Impuls bei 1700 Volt für 25 Millisekunden durchgeführt. Geben Sie die Zellen in ein Eend-Orph-Röhrchen mit einer mil antibiotikafreiem Medium ab.

Verteilen Sie die Zellen aus dem Röhrchen in unabhängige Vertiefungen, die antibiotikafreies DMEM mit 10 % FCS enthalten, inkubieren Sie die Zellen 24 bis 72 Stunden lang bei 37 Grad. MMV-Regeneration durch RNA, Lippenperfektion in BSR T, sieben Zellen wie zuvor, CAP MMV-Transkripte werden durch MMV, CD, nna-Plasmid, LINEARISIERUNG, T-7-Polymerase, In-vitro-Transkription und In-vitro-Capping-Transkription erzeugt, dann werden Lippen-, und Kappentranskripte in sieben BS-RT-Zellen beeinflusst. Trypsin ist eine Monoschicht aus bsrt sieben Zellen und sät 7,5 mal 10 zu den fünf lebensfähigen Zellen in sechs Well-Plattenschalen.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch drei Mil frisches Medium ohne Antibiotika. Um die maximale Effizienz der Transfektion zu gewährleisten, mischen Sie ein bis zwei Mikrogramm verschlossenes M-M-V-R-N-A mit 100 Mikrolitern Optimum.

Mischen Sie auch vier Mikroliter Lipektomie 2000 mit 100 Mikrolitern Optimum. Kombinieren Sie die Proben, die RNA und Lipektomie enthalten, und mischen Sie sie gründlich, indem Sie sie 15 Mal auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Fügen Sie dann die Transfektionskomplexe, die gekappte MMV-Transkripte enthalten, zu einem günstigen Preis in die Zellmonoschicht ein. Schütteln Sie die Platte in senkrechter Richtung. Inkubieren Sie die Zellen für 24 bis sieben zwei Stunden.

Protokoll für die direkte Rückgewinnung von infektiösem MMV aus CDNA in Zellen, die T-7-RNA-Polymerase exprimieren, wie zuvor beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf der Expression von T-7-RNA-Polymerase und oxx-viralen Capping-Enzymen in Zellen, die mit Hilfe des oxx-Virus infiziert sind. M-N-V-C-D-N-A wird dann unter Kontrolle eines T-Sieben-Promotors in die Zellen transfiziert.

Zuerst wird das Zellkulturmedium entfernt und in jede Vertiefung 700 Mikroliter des F-Pockenvirus gegeben, das in antibiotikafreien Medien verdünnt ist. In der Regel wird eine Infektionsvielfalt von etwa 0,5 PFU pro Zelle verwendet, die Platten senkrecht formen und eine Stunde lang bei 37 Grad inkubieren. Danach. Fügen Sie zwei Mahlzeiten mit antibiotikafreien Medien hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine weitere Stunde bei 37 Grad, um die T-Sieben-RNA-Polymerase-Expression MNV, CG, NNA-Transfektion zu ermöglichen, entfernen Sie das Medium aus den infizierten Zellen und fügen Sie drei Mühlen frisches Medium ohne Antibiotika hinzu.

Bereiten Sie eine Mischung aus einem Mikrogramm M-M-V-C-D-N-A und Lipektomie vor, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab vorbereiten. Halten Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, mischen Sie dann erneut und geben Sie Tropfen Pies in die Zellmonoschicht.

Schütteln Sie die Platte vorsichtig in senkrechter Richtung. Inkubieren Sie die Zellen 24 bis 72 Stunden lang bei 37 Grad, um die Wiederherstellung des infektiösen MMV durch die verschiedenen reversen genetischen Ansätze zu bestätigen, die im Verlauf dieses Videos gezeigt werden: Befreien Sie infektiöses Varion durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen aus den Zellen. Bestimmen Sie die repräsentativen Ergebnisse in jeder Probe mit Standardverfahren wie TCID 50 oder Plaque-Assay.

Die Verfügbarkeit dieser reversen genetischen Systeme zur Untersuchung des mi-Neurovirus hat eine beispiellose Möglichkeit geschaffen, die Rolle viraler Sequenzen bei der Replikation und Pathogenese von Neuroviren im natürlichen Wirt zu untersuchen. Beide reversen genetischen Ansätze, die in diesem Video erläutert werden, sind hocheffizient für die Rückgewinnung von infektiösen Neuro- und Neuroviren und Zellkulturen. Wie in dieser Abbildung gezeigt.

Infektiöses MMV, der Titel übersteigt 10 bis fünf TCID 50 pro Mil werden nach Transfektion von verschlossenen MM V-Transkripten entweder in Rohzellen oder BS RT sieben Zellen wiedergefunden. Die Transfektion von MM V-C-D-N-A in sieben BSRT-Zellen, die zuvor mit Hilfe des Foul-Pops-Virus infiziert wurden, führt zu Virustitern von mehr als 10 bis vier TCID 50 pro Mil. Virale Titer, die durch reverse genetische Ansätze erhalten werden, ähneln denen von Titus, das in Transfect mit RNA gerettet wurde, die aus infektiösen Viren isoliert wurde, was die hohe Effizienz der hier beschriebenen reversen genetischen Systeme unterstreicht.