Name: Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Lernen Sie zwei Reverse-Genetics-Strategien zur Wiedergewinnung infektiösen Murinen Norovirus in Zellkultur. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Norovirus-Replikation und Pathogenese.

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Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Senior Fellowship ausgezeichnet zu Ian Goodfellow, und ein Marie Curie Intra European Fellowship (RP7 European Research Council) ausgezeichnet zu Armando Arias finanziert. Wir möchten Io Hong Cheong, Dr. Rebecca Robey und Dr. Mike Skinner, dass er uns die Erlaubnis, ihre Agilent Bioanalyzer bedienen und hilft mit fließendem RNA-Proben zu danken.

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<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir zwei verschiedene Reverse genetische Ansätze, die die Rückgewinnung von infektiösen MNV in Zellkultur ermöglichen dargestellt. Beide Ansätze wirksam zu umgehen die absolute Voraussetzung für die Verknüpfung kovalent VPg an das 5&#39;-Ende des viralen RNA-Genoms über die Erzeugung der begrenzten MNV Transkripte, die dann von den zellulären Ribosomen erkannt werden. In-vitro-Transkription durch enzymatisch Capping gefolgt ist effizienter die Rückgewinnung von infektiösen MNV als Transkription von infektiösen Plasmide in Zellen, die T7-RNA-Polymerase, bei dem die Transkripte von den FPV Capping Enzyme verschlossen werden kann. Virustiter mit diesen reversen Genetik zurückgewonnen entsprechen denen, die durch Transfektion von viralen VPg-verknüpfte RNA aus infizierten Zellkulturen 17 (5) gereinigt erhalten. Die Transfektion der begrenzten MNV-RNA in permissiven RAW 264.7-Zellen macht eine Virustiter nur 1-log niedriger als Experimente mit der transfection der Gesamt-RNA aus infizierten Zellen mit viralen VPG-linked-RNA (Abbildung 5). Diese Tatsache unterstützt weitere Untersuchungen zu bestimmen, ob die Zugabe eines VPg Molekül an das 5&#39;-Ende der Transkripte von diesen Systemen erzeugten zu einer erhöhten Virusausbeuten die funktionalen Aspekte zugrunde MNV Infektiosität in Zellen zugeordnet VPg untersucht werden kann, führen. Trotzdem betrachten wir dieses System als reversen Genetik umgekehrt eine hocheffiziente ein vergleichbar mit anderen RNA-Viren Genetik Systeme, die derzeit verwendet werden, in dem die In-vitro-transkribierte RNA die Erholung der Titer nur 10-100 niedriger als im wirklichen Infektionen mit Virionen 19, 20 ermöglicht. Insgesamt stellen die aktuellen Methoden einen erheblichen Fortschritt auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Norovirus liefern uns die Werkzeuge, um die funktionelle Rolle von Proteinen und RNA-Motive in konservierten Norovirus Genomen zu untersuchen. Diese Konzepte wurden bereits mit C kombinierttrom Mausmodell zur Verfügung und haben gezeigt, dass MNV von infektiösen cDNA erholt ist in der Lage, tödliche Infektion von&gt; 80% STAT1-/ verursachen - Mäuse in weniger als 10 Tagen 4, 21. Die Nutzung dieses Systems haben wir tragfähige murine Norovirus Mutanten des Kapsidprotein und einer Polypyrimidintrakt bei der Bindung von verschiedenen Host-Faktoren (PTB und PCBP), dass eine etwas abgeschwächte Phänotypen zeigen in vivo 21, 22 beteiligten sich erholt haben. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass Viren die Fähigkeit fehlt, die VF1 Protein aus ORF4 effizient ausdrücken in der Zellkultur zu replizieren, aber wieder haben Virulenz in Mäusen, die mit Bezug auf WT MNV 8 reduziert. Diese Studien ermutigen uns, abgeschwächte Versionen von menschlichen Noroviren auf MNV Studien, die als potenzielle Impfstoffe untersucht werden konnte entwerfen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Lithiumchlorid Fällungslösung </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA-Storage-Lösung </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7-Skript </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Capping-System </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon Transfektionssystem </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon Transfektionssystem Kit </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano-Kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA und Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse-genetics vermittelte wiedergewinnung eines infektiösen murine norovirus

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Menschliche Noroviren sind verantwortlich für die meisten Fälle von menschlichen Gastroenteritis (GE) weltweit und sind immer wiederkehrendes Problem in Umgebungen, in denen nahe stehende Person zu Person Kontakt nicht 1, 2 vermieden werden können. In den letzten Jahren ein Anstieg der Häufigkeit der Ausbrüche in Krankenhäusern wurde berichtet, was zu erheblichen Störungen ihrer operativen Leistungsfähigkeit sowie große wirtschaftliche Verluste. Die Identifizierung von neuen antiviralen Ansätzen wurde aufgrund der Unfähigkeit des menschlichen Noroviren, um eine produktive Infektion in Zellkultur 3 vervollständigen begrenzt. Die kürzliche Isolierung eines murinen Norovirus (MNV), eng mit den menschlichen Norovirus 4, aber die Suchbegriffe in Zellen 5 werden ausgebreitet hat neue Wege zur Untersuchung dieser Pathogene 6, 7 geöffnet. MNV Replikation resultiert in der Synthese der neuen positiven Sinne genomischen und subgenomischen RNA-Moleküle, entspricht die letztere zur letzten third des viralen Genoms (Abbildung 1). MNV enthält vier verschiedene offene Leseraster (ORFs), von denen ORF1 nimmt den größten Teil des Genoms kodiert und sieben nicht-strukturelle Proteine ​​(NS1-7) aus einem Polyprotein-Vorläufer-Freigabe. ORF2 und ORF3 innerhalb des subgenomischen RNA-Region enthalten ist, und codieren die Capsid-Proteine ​​(VP1 und VP2, jeweils) (1). Vor kurzem haben wir diese zusätzliche ORF4 überlappenden ORF2 identifiziert, aber in einem anderen Leseraster ist funktional und kodiert für eine mitochondriale lokalisierte Virulenzfaktor (VF1) 8. Replikation für positive RNA Viren, einschließlich Noroviren, erfolgt im Zytoplasma, was zur Synthese neuer begrenzten RNA-Genome. Um virale Übersetzung zu fördern, zu nutzen Viren unterschiedliche Strategien bei der Einstellung des zellulären Proteinsynthese-Maschinerie 11.09 abzielen. Interessant ist, dass Norovirus-Übersetzung durch die multifunktionale virale Protein-Primer VPg angetriebenkovalent an das 5&#39;-Ende der beiden genomischen und subgenomischen RNAs 12-14 verbunden. Dieser ausgeklügelte Mechanismus der Übersetzung wird wahrscheinlich ein wichtiger Faktor in der geringen Effizienz der viralen Wiederherstellung durch konventionelle Methoden der reversen Genetik sein. Hier berichten wir zwei verschiedene Strategien, die auf die Generierung von murinen Norovirus-1 (im Folgenden als MNV beiliegenden) Transkripte am 5&#39;-Ende verschlossen. Eines der Verfahren umfasst sowohl in vitro Synthese und Begrenzung der viralen RNA, während die zweite Ansatz beinhaltet die Transkription der cDNA MNV in Zellen, die T7-RNA-Polymerase. Die Verfügbarkeit dieser reversen Genetik zum Studium von MNV und einem Tiermodell eine beispiellose Fähigkeit, die Rolle von viralen Sequenzen in Replikation und Pathogenese von 15 bis 17 zu zerlegen ist.

Noroviren sind eine bedeutende Ursache von Gastroenteritis noch molekulare Techniken zu ihrer Charakterisierung sind noch relativ neu. Hier berichten wir über zwei verschiedene Ansätze der reversen Genetik für die effiziente Gewinnung von murinen Norovirus (MNV), das einzige Mitglied dieser Gattung, die in Zellkultur vermehrt werden kann.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Humane Noroviren sind weltweit für die meisten Fälle von humaner Gastroenteritis (GE) verantwortlich und stellen ein wiederkehrendes Problem in Umgebungen dar, in denen enger ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, infektiöses Mu-Eye-Neurovirus unter Verwendung von zwei reversen genetischen Systemen zu gewinnen. Hallo, ich bin Armando Arias von der Abteilung für Virologie am Imperial College London. In unserer Arbeitsgruppe beschäftigen wir uns damit, die molekularen Mechanismen, die der Neurovirusreplikation zugrunde liegen, aufzuklären.Noroviren sind eine Hauptursache für Gastroenteritis. Weltweit sind molekulare Techniken zu ihrer Charakterisierung noch vergleichsweise neu. Die Identifizierung neuer antiviraler Ansätze und Einblicke in den Lebenszyklus von Noroviren waren aufgrund ihrer Unfähigkeit, eine produktive Infektion in Zellkultur abzuschließen, begrenzt.Die kürzliche Isolierung eines antiviralen Mittels, das Mäuse infizieren und sich in Zellkultur vermehren kann, nämlich des Spiegel-Neurovirus, hat neue Möglichkeiten für die Erforschung dieser wichtigen Krankheitserreger eröffnet. In diesem Bericht werden wir zwei Strategien vorstellen, die die Erzeugung genetisch definierter Neuro-Neurovirus-Isolate in der Zellkultur ermöglichen. Beide Strategien basieren auf der Erzeugung viraler Transkripte, die am 5'-Ende kappt sind. Die erste Methode beinhaltet die Synthese der Capping-Reaktion an viraler RNA in vitro vor der Transfektion in Zellen. Der zweite Ansatz umfasst die Transkription von MI-Neurovirus-cDNA innerhalb von Zellen, die T7-RNA-Polymerase exprimieren. Verfahrensübersicht: Das Protokoll zur Isolierung von Neuro-Norovirus aus kappten RNA-Transkripten wird durch lineare Anreicherung eingeleitet.Das Plasmid, das MV CD NA für mmv eins enthält. Dies erfolgt mit dem Restriktionsenzym NHE eins. Die DNA wird anschließend in vitro mittels T-sieben-RNA-Polymerase in RNA transkribiert.Anschließend wird die M-M-V-R-N-A in vitro kappt und in Zellen transfiziert, um die Gewinnung infektiösen MMV zu ermöglichen, d. h. die direkte Isolierung infektiösen MNV mithilfe des FAL-PX-Virus, das T-sieben-RNA-Polymerase exprimiert. Zur MMV-Rekonstitution aus direkt transfizierten cDNA-Klonen werden die Zellen zunächst mit einem rekombinanten FAL-PX-Virus infiziert, das T-sieben-RNA-Polymerase exprimiert. Die FAL-PX-Infektion führt zur Expression der T-sieben-RNA-Polymerase sowie viraler RNA-Kappungsenzyme, die möglicherweise einen Teil der synthetisierten RNA kappt. Die M-M-V-C-D-N-A wird anschließend mittels lipiddomierter Transfektion in die mit FPV infizierten Zellen eingebracht. Die T-sieben-RNA-Polymerase produziert dann die M-M-V-R-N-A, von welcher ein Teil möglicherweise durch die Kappungsapparatur des FPV-RNA-Prozesses kappt wird.Eine Ribozymsequenz gewährleistet, dass jeder RNA-Transkript ein definiertes drei-primes Ende enthält. Die kappten MMV-Transkripte werden anschließend vor der Replikation in Protein übersetzt, was zur Bildung neuer infektiöser Partikel führt. Protokoll für die RNA-Transkription und Kapppung zur Gewinnung infektiöser, kappter MMV-Transkripte zur Synthese infektiöser kappter MMV-Transkripte.Mischen Sie zunächst die folgenden Reagenzien: Transkriptionspuffer, Nukleotide, Wasser und linearisiertes Plasmid, das die M-M-V-C-D-N-A enthält. Anschließend wird RNA und T7-RNA-Polymerase der Reaktionsmischung zugesetzt. Zahlreiche kommerzielle Kits sind für diesen Zweck erhältlich und bieten eine reproduzierbare Methode zur RNA-Synthese.Die Transkriptionsreaktion wird durch Inkubation des Gemischs bei 37 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden durchgeführt. Analysieren Sie eine kleine Probe dieser Transkriptionsreaktion in einem nicht denaturierenden Agarosegel. Reinigen Sie zunächst die Gelelektrophorese-Ausrüstung mit dem Detergens und spülen Sie sie vor der Verwendung mit RNA-freiem Wasser ab.Stellen Sie sicher, dass Agarosegele mit RNA-freien Reagenzien hergestellt werden. M-V-R-N-A läuft auf einem nicht denaturierenden Agarosegel bei etwa drei Kilobasen. Zusätzlich kann ein Agilent Bioanalyzer als schnelle Methode zur Analyse der RNA-Integrität verwendet werden.Die RNA sollte anschließend gereinigt werden, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Es sind viele Methoden verfügbar; in diesem Protokoll reinigen wir die RNA jedoch mittels Lithiumchlorid-Fällung als kostengünstige Alternative, bei der die RNA durch Zentrifugation mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten pelletiert wird. Entfernen Sie das Überstandsvolumen, wobei darauf geachtet werden muss, das durchscheinende Pellet nicht aufzuwirbeln, und waschen Sie es mit 70 %igem Ethanol.Suspendieren Sie den MMV-Transkript in einer RNA-Lagerungslösung und stellen Sie sicher, dass er vollständig gelöst ist. Das Erwärmen der RNA auf 65 Grad C kann diesen Prozess später erleichtern. Quantifizieren Sie die RNA mittels Spektrometrie.Analysieren Sie die RNA-Integrität, indem Sie ein kleines Aliquot auf einem 1 %igen nicht-denaturierenden Agarosegel laufen lassen. Wie Sie sehen können, sollte die RNA-Integrität nach der Fällung mit Lithiumchlorid unverändert bleiben, um die Capping-Effizienz zu verbessern. Erhitzen Sie ein Aliquot der RNA 10 Minuten lang auf 65 Grad.Stellen Sie das Röhrchen sofort auf Eis. Um einen Abbau oder eine erneute Faltung zu vermeiden, bereiten Sie eine Kappungs-Reaktionsmischung gemäß den Herstellerangaben vor. Üblicherweise geben wir etwa 60 Mikrogramm M-N-V-R-N-A zu einer endgültigen Reaktionsvolumen von 100 Mikrolitern hinzu.Obwohl die Reaktion herunterskaliert werden kann, gründlich mischen und eine Stunde bei 37 Grad inkubieren, die RNA wie zuvor durch Lithiumchlorid-Fällung aufreinigen. Es ist unerlässlich, die Integrität der RNA erneut zu überprüfen, bevor mit der Transfektion fortgefahren wird. Schritt-für-Schritt-Protokoll zur MMV-Rekonstitution durch RNA-Elektroporation in Raw-Zellen. Resus.Suspendieren Sie den Kolben mit rohen Zellen in DMEM. Stellen Sie sicher, dass eine Einzelzell-Suspension vorliegt. Bestimmen Sie die Konzentration vitaler Zellen mithilfe eines Hämozytometers unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens.Die Zellen pelletieren und vorsichtig resuspendieren. In frischem, antibiotikafreiem Medium suspendieren, jeweils 8 Millionen Zellen pro Transfektion, und in einer Mikrozentrifuge pelletieren. Das Medium abnehmen und die Zellen mit 500 µL PBS waschen, erneut zentrifugieren, den PBS abnehmen und die Zellen in 130 µL Raumtemperatur-Puffer resuspendieren.Lösung für die Neon-Reanimations-Suspension. Geben Sie die geeignete Menge an kap-gekoppelter RNA hinzu, typischerweise 1,3 Mikrogramm pro 130 Mikroliter Zellen, was einem Mikrogramm RNA pro 6 Millionen Zellen entspricht. Die mit Transkripten gemischten Zellen werden in der 100-Mikroliter-Neon-Transfektionspipettenspitze gesammelt.Es ist äußerste Sorgfalt erforderlich, um an dieser Stelle keine Blasen einzuführen. Anschließend elektroporieren Sie mit einem einzelnen Puls bei 1700 Volt für 25 Millisekunden. Geben Sie die Zellen in ein Eppendorf-Röhrchen, das ein Milliliter antibiotikafreies Medium enthält.Verteilen Sie die Zellen aus dem Reagenzglas auf separate Vertiefungen, die DMEM ohne Antibiotikum mit 10 % FCS enthalten, und inkubieren Sie die Zellen 24 bis 72 Stunden bei 37 °C. Die MMV-Rekonstitution erfolgt durch RNA-Lipofektion in BSR T7-Zellen wie zuvor beschrieben. CAP-MMV-Transkripte werden durch LINEARISIERUNG des MMV-cDNA-Plasmids und anschließende In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase sowie In-vitro-Kappung erzeugt; die Transkripte werden anschließend mittels Lipofektion in BSR T7-Zellen überführt. Trypsinieren Sie eine Zellschicht aus BSR T7-Zellen und säen Sie 7,5 × 10⁵ vitale Zellen in 6-Loch-Platten aus.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und ersetzen Sie es durch drei Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika. Um die maximale Transfektionseffizienz sicherzustellen, mischen Sie ein bis zwei Mikrogramm kappte M-M-V-R-N-A mit 100 Mikrolitern OptiMEM.Mischen Sie außerdem vier Mikroliter Lipectomy 2000 mit 100 Mikrolitern Optimum. Kombinieren Sie die Proben, die RNA und Lipectomy enthalten, und mischen Sie sie durch 15-maliges Auf- und Abpipettieren gründlich. Lassen Sie das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Gebe dann die Transfektionskomplexe, die kappte MMV-Transkripte enthalten, tropfenweise auf die Zellmonolayer. Schütteln Sie die Platte in senkrecht zueinander stehenden Richtungen. Inkubieren Sie die Zellen 24 bis siebenundzwanzig Stunden.Protokoll zur direkten Gewinnung infektiösen MMV aus cDNA in Zellen, die T7-RNA-Polymerase exprimieren, wie zuvor beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf der Expression der T7-RNA-Polymerase und der oxx-viralen Kappungsenzyme in Zellen, die durch einen Helfervirus vom Typ oxx infiziert wurden. M-N-V-C-D-N-A unter Kontrolle eines T7-Promotors wird anschließend in die Zellen transfiziert.Entfernen Sie zunächst das Zellkulturmedium und geben Sie in jede Vertiefung 700 Mikroliter F-Pockenvirus, das in antibiotikafreiem Medium verdünnt ist. Üblicherweise wird eine Multiplizität der Infektion von etwa 0,5 PFU pro Zelle verwendet, stellen Sie die Platten senkrecht und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad. Danach fügen Sie zwei Portionen antibiotikafreies Medium hinzu und inkubieren die Zellen weitere eine Stunde bei 37 Grad, um die Expression der T7-RNA-Polymerase zu ermöglichen. Nach der MNV-cgRNA-Transfektion entfernen Sie das Medium der infizierten Zellen und geben drei Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika hinzu.Stellen Sie eine Mischung aus einem Mikrogramm M-M-V-C-D-N-A und Lipectomie wie im vorherigen Abschnitt erläutert her. Mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Stellen Sie das Gefäß 20 Minuten bei Raumtemperatur, mischen Sie erneut und geben Sie Tropfen für Tropfen auf die Zellmonolage.Schütteln Sie die Platte vorsichtig in senkrechten Richtungen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad für 24 bis 72 Stunden, um die Freisetzung infektiöser MMV durch die verschiedenen in diesem Video gezeigten Reverse-Genetik-Ansätze zu bestätigen, indem Sie die Freisetzung infektiöser Varianten aus Zellen durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen bewirken. Bestimmen Sie in jeder Probe mithilfe standardisierter Verfahren wie TCID 50 oder Plaque-Assay repräsentative Ergebnisse.Die Verfügbarkeit dieser reversen genetischen Systeme zur Untersuchung von mi-Neurovirus hat eine beispiellose Möglichkeit geschaffen, die Rolle viraler Sequenzen bei der Replikation und Pathogenese von Neuroviren im natürlichen Wirt zu untersuchen. Beide in diesem Video erläuterten Ansätze der reversen Genetik sind äußerst effizient für die Gewinnung infektiöser Neuro- und Neuroviren in Zellkultur. Wie in dieser Abbildung dargestellt.Infektiöses MMV, der Titel übersteigt 10 hoch fünf TCID50 pro Milliliter, wird nach der Transfektion kapzierter MMV-Transkripte in entweder RAW-Zellen oder BSRT7-Zellen gewonnen. Die Transfektion von MMV-cDNA in BSRT7-Zellen, die zuvor mit Hilfe von Fowl Pox-Virus infiziert wurden, führt zu viraleren Titerwerten, die 10 hoch vier TCID50 pro Milliliter überschreiten. Die mittels Reverse-Genetik-Ansätzen erzielten Virustiter liegen in der Größenordnung derer, die durch Transfektion mit RNA gewonnen wurden, die aus infektiösem Virus isoliert war, was die hohe Effizienz der hier beschriebenen reverse-genetischen Systeme unterstreicht.

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein Ein-Schritt-RT-PCR-Assay zum Nachweis und zur Genogruppe Identifizierung von Norovirus Isolate von Kindern der Stuhl, die Primer und TaqMan-Sonden spezifisch für die offenen Leserahmen 1 (ORF1)-ORF2 Übergangsregion, die am stärksten konservierte Region des Norovirus Genom verwendet beschrieben. Eine nicht-kommerzielle, kostengünstige RNA-Extraktion-Methode wird ausführlich beschrieben.

Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Die reverse Genetik für die Rift Valley-Fieber-Virus MP-12 Impfstamm ist ein nützliches Werkzeug für die Schaffung zusätzlicher MP-12-Mutanten mit erhöhter Dämpfung und Immunogenität. Wir beschreiben das Protokoll zu erzeugen und zu charakterisieren NSs Mutanten.

Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Quelle: Leuthold, M. M., et al. Herstellung von humanen Norovirus-hervorstehenden Domänen in E. coli für die Röntgenkristallographie. J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video zeigt die Aufreinigung der rekombinanten humanen Norovirus-P-Domäne mittels Größenausschlusschromatographie und hebt die Trennung des Zielproteins von Verunreinigungen mit höherem und niedrigerem Molekulargewicht auf der Grundlage der unterschiedlichen Porenzugänglichkeit hervor. Der Prozess wird durch UV-Absorption überwacht und...

Aufreinigung von aus Bakterien gewonnenen rekombinanten P-Domänenproteinen des humanen Norovirus

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Hier stellen wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwassern mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR vor. Die mittlere Virusrückgewinnung aus dem Grundwasser mit diesem standardisierten Verfahren der EPA-Methode 1615 betrug 20 % für Polioviren und 30 % für murine Noroviren.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

Routinemäßige Nachweismethoden nutzen virale Genom Verstärkung sind durch ihre Unfähigkeit, infektiöse von nicht-infektiöse Partikel unterscheiden begrenzt. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle nach alternativen Methoden zur Diskriminierung von ansteckenden Norovirus Teilchen mit Aptamer Bindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissions-Elektronenmikroskopie Unterstützung bieten.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Die Generierung rekombinanter Rotaviren aus Plasmid-DNA ist ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Rotavirus-Replikation und Pathogenese sowie für die Entwicklung von Rotavirus-Expressionsvektoren und Impfstoffen. Hierin beschreiben wir einen vereinfachten Reverse-Genetik-Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, einschließlich Stämmen, die fluoreszierende Reporterproteine exdrücken.

Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken

Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Lernen Sie zwei Reverse-Genetics-Strategien zur Wiedergewinnung infektiösen Murinen Norovirus in Zellkultur. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Norovirus-Replikation und Pathogenese.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

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