Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Geschwindigkeiten von DNA-Reparatur und zellulären nukleären Extrakten in Echtzeit mithilfe von molekularen Sonden zu messen, die fluoreszieren, sobald sie repariert wurden. Molekulare Sonden für die basenexzisionsreparatur bestehen aus Desoxy-Oligonukleotiden in einer Stamm-Schleife-Struktur, die eine einzelne Basenverletzung enthält, mit sechs Carboxyfluorescein-Gruppen, die an den 5'-Enden und Dabcyl an den 3'-Enden konjugiert sind, wenn die Struktur gefaltet ist. Die FAM-Gruppe wird dabei durch Dabcyl auf nichtfluorescente Weise über Förster-Resonanzenergietransfer unterdrückt.

Um die DNA-Reparaturaktivität zu bewerten, werden Sonden mit zellulären Kernextrakten inkubiert, die Reparaturenzyme enthalten. DNA-Glykosylasen erkennen und entfernen die DNA-Läsion in der Sonde. Die resultierenden ABA-Stellen sind Substrate für die AP-Endonuklease 1 (APE1). Nach Erkennung spaltet APE1 das DNA-Backbone an der ABA-Stelle, wodurch die DNA, die die sechs FAM enthält, sich frei von der Haarnadel lösen kann.

Die Trennung vom Quencher führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die proportional zum Ausmaß der DNA-Reparatur ist und in Echtzeit mit einer quantitativen Echtzeit-PCR-Maschine bewertet werden kann. Die Fähigkeit zur Reparatur von DNA-Schäden ist für jede Zelle und jeden Organismus von entscheidender Bedeutung. Unter der Vielzahl zellulärer DNA-Reparaturwege zielt die Basenexzisionsreparatur auf beschädigte Basen ab, die durch oxidative oder chemische Noxen entstehen können. Die Aufklärung der Rolle einzelner zellulärer Komponenten, die die Basenexzisionsreparatur beeinflussen könnten, gehört zu den Hauptzielen unserer Laboruntersuchungen.

Daher besteht in unserem Labor ein Interesse daran, die DNA-Reparaturaktivität genau und empfindlich zu messen. Dieser Assay kann solche Daten liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der 32PN-Markierung und Analyse mittels Gelelektrophorese besteht darin, dass unsere Methode keine radioaktiv markierten Substrate verwendet, die Reparaturraten in Echtzeit messen kann und über einen sehr großen dynamischen Bereich verfügt.

Außerdem kann dieser Ansatz verschiedene fluoreszierende Farbstoffe und/oder Basenschäden nutzen, um die Substratspezifität zu bestimmen. Wir konnten zeigen, dass dieser Nachweis in unterschiedlichen Ansätzen hochgradig quantitativ und sehr empfindlich ist. Dieser molekulare Leuchtfarben-Assay zum Basenexzisionsreparaturmechanismus eignet sich für kinetische Analysen.

Die hohe Empfindlichkeit und Spezifität des Assays ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Basenexzisionsreparatur und ist daher nützlich für die Untersuchung von Reparaturinhibitoren oder deren Validierung. Außerdem lässt er sich anpassen, um die Reparaturaktivität in Zellen sowie in Geweben und Tumorzelllysaten für funktionelle Biomarker-Messungen zu bestimmen. Berücksichtigen Sie bei der Konstruktion molekularer Sonden, die für diesen Assay verwendet werden sollen, die folgenden DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 43 Basen, wie hier gezeigt.

Arbeiten Sie gut. Die DNA-Sequenz ist nicht eindeutig, muss jedoch die Ausbildung einer Haarnadelstruktur ermöglichen. Wenn wie hier gezeigt geknickt, wird die Spezifität durch Einfügen spezifischer Basenläsionen wie Uracil oder Tetrahydrofuran erreicht.

An Position X, sechs Basen vom Fünf-Prim-Ende entfernt, sollte der GC-Gehalt mindestens 32 % betragen, und eine GC-Basis sollte nicht am Fünf-Prim-Ende platziert werden. Sechs Carboxyfluorescein oder sechs FAM sollten an das Fünf-Prim-Ende gekoppelt werden, und das Drei-Prim-Ende sollte mit DabcyL modifiziert sein. Dies dient als Substrat für die DNA-Reparaturproteine, um die Bindung und Aktivität der Glykosylase freizusetzen.

Die Position der Läsion wurde so gewählt, dass ausreichend Abstand zur Haarnadelstruktur und zum Ende der DNA gegeben ist. Die Länge des Stiels oder der Haarnadel-Duplex sollte mindestens 15 Basenpaare betragen. Als empfohlene Schleifenlänge gelten 13 Basen.

Der Kontroll-Molekular-Beacon sollte mit dem experimentellen Molekular-Beacon identisch sein, abgesehen davon, dass er keine DNA-Läsion enthält. Daher sollte er nicht von DNA-Reparaturenzymen erkannt werden. Sobald die Molekular-Beacons vorliegen, sollte eine Qualitätsbewertung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Beacs erst beim Erhitzen fluoreszieren.

Und um die optimale Schmelztemperatur zu bestimmen, sollten alle Schritte während des Extraktionsverfahrens auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Um die Proteinstabilität sicherzustellen, bereiten Sie das Experiment vor, indem Sie alles vorkühlen. Zwei Ein-Liter-Bechergläser pro Probe, Dialysepuffer, Dialysekammern, Mikrozentrifuge, Röhrchen, Spritzen und Nadeln.

Etikettieren Sie 15-Milliliter-Konustuben und stellen Sie sie auf Eis. Saugen Sie das Wachstumsmedium von den Zellen ab und waschen Sie sie anschließend zweimal mit je 7,5 Milliliter kaltem PBS. Geben Sie nach dem zweiten Waschschritt fünf Milliliter kaltes PBS pro Petrischale hinzu und lösen Sie die Zellen mithilfe eines Zellabhebers von der Platte.

Überführen Sie die Zellen in ein gekühltes kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 500 × g und 4 °C für fünf Minuten. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand und schätzen das gepackte Zellvolumen ab, indem Sie es mit bekannten Flüssigkeitsvolumina in ähnlichen Röhrchen vergleichen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen weitere eine Minute und entfernen Sie dann das verbleibende PBS mit einer Pipette.

Suspendieren Sie das Zellpellet in 150 Mikroliter Nuke-Buster-Extraktionsreagenz 1 pro 50 Mikroliter gepacktes Zellvolumen. Überführen Sie die resuspendierten Zellen anschließend in ein vorab gekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie 15 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit. Nach dem Wirbeln inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis, wirbeln dann erneut 15 Sekunden lang und zentrifugieren anschließend fünf Minuten bei 13.000 × g und 4 °C.

Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und verwerfen, der die zytoplasmatische Fraktion enthält. Den Pellet in einer Mischung aus einem Mikroliter resuspendiertem 100× Proteaseinhibitorcocktail, einem Mikroliter 100 Millimolar DTT und 75 Mikrolitern Nuke Buster-Extraktionsreagenz zwei pro 50 Mikroliter gepacktem Zellvolumen resuspendieren.

Vortexen Sie die Zellen 15 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit. Inkubieren Sie fünf Minuten auf Eis und vortexen Sie erneut 15 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 13.000 × g und 4 °C. Überführen Sie nach der Zentrifugation mittels einer Spritze den Überstand, der die nukleären Proteine enthält, in eine Dialysekassette mit einer Molekulargewichts-Trenngrenze von 7.000.

Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter einer einmolaren DTT-Lösung zu 500 Milliliter vorab gekühltem Dialysepuffer hinzu und dialysieren Sie das Lysat 90 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren. Nach 90 Minuten überführen Sie die Dialyseskassette in einen zweiten Becher, der 0,5 Liter vorab gekühlten Dialysepuffer mit DTT enthält, und führen eine weitere Dialyse 90 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren durch. Nach der Dialyse kann sich der Extrakt aufgrund hoher Protein-Konzentrationen kristallisiert haben.

Als Nächstes eine neue Spritze in einen anderen Port als denjenigen einführen, der zum Einspritzen der Kassette verwendet wurde, und die dialysierte nukleäre Proteiniösung aus der Dialysekassette auffangen. Beim Entnehmen der dialysierten nukleären Proteiniösung versuchen, trüb aussehende Kristalle mit aufzunehmen. Die Probe auf Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen, jeweils 20 Mikroliter, schnell in Trockeneis einfrieren und anschließend bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie benötigt wird.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und führen Sie die Qualitätskontrolle wie in dem begleitenden Dokument beschrieben durch. Um den Molekular-Beacon-Assay durchzuführen, tauen Sie die Zelllysate auf und verdünnen sie auf zwei Mikrogramm pro Mikroliter Protein mit basischem Base-Excision-Repair-Reaktionspuffer, der ein Millimolar DTT enthält; verdünnen Sie die Molekular-Beacons auf 200 Mikromolar mit basischem Base-Excision-Repair-Reaktionspuffer. Da die quantitative Echtzeit-PCR-Maschine typischerweise nicht als Fluorimeter verwendet wird, ändern Sie die Laufmethode an der quantitativen Echtzeit-PCR-Maschine so ab, dass Daten alle 20 Sekunden bei 37 Grad Celsius über mindestens 180 Zyklen hinweg gesammelt werden.

Dann alle 20 Sekunden über 15 Zyklen bei maximaler Fluoreszenz des molekularen Sondenmittels, um Daten zur Normalisierung zu erhalten. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 25 Mikroliter ein. Richten Sie anschließend das Plattendesign am Gerät mithilfe der Applied Biosystems-Software ein, wobei die Standardkurve als Versuchstyp ausgewählt wird, und vervollständigen Sie die Plattenanordnung.

Ein Beispiel ist in dieser Tabelle dargestellt, die auch im beigefügten Dokument gefunden werden kann. Fügen Sie nichts hinzu zu der als Standardkurve ausgewählten Vertiefung. Stellen Sie den Basis-Exzisionsreparatur-Reaktionspuffer, DTT, Zelllysat in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Mikroliter und alle in dem Experiment verwendeten molekularen Sonden auf Eis.

Fügen Sie dann das DTT der Basal-Pufferlösung für die Excisionsreparatur hinzu, um eine Endkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Pipettieren Sie 15 Mikroliter der Basal-Pufferlösung für die Excisionsreparatur mit DTT in jedes Brunnen einer kompatiblen optischen Q-R-T-P-C-R-Platte auf Eis. Danach pipettieren Sie gemäß dem Plattenlayout die Sonden in die entsprechenden Brunnen.

Jede Kombination aus Lysat und molekularem Sondenreagenz oder Kontrolle sollte verdreifacht analysiert werden. Schließlich jeweils fünf Mikroliter des verdünnten nukleären Lysats pro Well in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Es ist wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien des molekularen Sondenreagenzsystems kalt zu lagern und die Lysate erst als letzten Schritt in die Platte zu pipettieren.

Denken Sie daran, dass die Lysate aktive Proteine enthalten, die sofort mit der Reparatur der molekularen Sonden beginnen, sobald diese in das Reaktionsgemisch pipettiert werden. Daher ist es sehr wichtig, alle Reagenzien kalt zu halten, um die vor Beginn der Messungen stattfindende Reparatur der Sonden so gering wie möglich zu halten. Nachdem alles hinzugefügt wurde, verschließen Sie die Platte mit einer optischen Haftfolie und mischen Sie vorsichtig durch leichtes Antippen der Platte.

Führen Sie anschließend einen kurzen Zentrifugenschritt von zehn Sekunden durch, um die Lösungen am Boden der Röhrchen oder der Platte zu sammeln. Danach setzen Sie die Platte in die quantitative Echtzeit-PCR-Maschine ein und starten den Nachweis. Nach Abschluss des Vorgangs exportieren Sie die Rohdaten vorzugsweise im Excel-Format und befolgen die Anweisungen im beigefügten Dokument, um die Daten zu analysieren, sobald die erforderlichen Berechnungen durchgeführt wurden. Tragen Sie die normalisierten Fluoreszenzdaten als Prozent freies FAM über der Zeit in Sekunden in ein Streudiagramm mit den entsprechenden Fehlerbalken ein, um die DNA-Reparaturaktivität und die Qualität der nukleären Extrakte aus den LN 4 28-Zellen sowie einer MPG-Überexpression-Zelllinie, bezeichnet als LN 4 28 MPG, zu bewerten. Der in diesem Video beschriebene Nachweis wurde unter Verwendung eines molekularen Sondenprobes durchgeführt, der das APE1-Substrat Tetra-Furan enthält, als positiver Kontrolle.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, weisen beide Zelllinien eine starke APE1-Aktivität auf, was durch die steile Steigung angezeigt wird, sowie eine DNA-Glykosylase-Aktivität, die spezifisch für die Entfernung des MPG-Substrats ist. Hypoxanthin (angegeben als HX) wurde in nukleären Lysaten beider Zelllinien gemessen. Jedes Lysat wurde entweder mit einem molekularen Sondenkontrollsystem für die Basenexzisionreparatur oder mit einer molekularen Sonden-HX-Sonde für die Basenexzisionreparatur analysiert; für die Kontroll-Sonde ist LN 4 28 in grün dargestellt und LN 4 28 MPG für die HX-Sonde in lila.

LN 4 28 ist in blau dargestellt und LN 4 28 MPG in orange. Die Ergebnisse werden als A mittlere Fluoreszenzeinheiten und B normalisierte Fluoreszenz angegeben. Ein zeitabhängiger Anstieg der Fluoreszenz, der auf HX-Reparatur hinweist, trat in jeder Zelle auf.

Lysat wurde wie erwartet mit dem HX-Molekular-Beacon inkubiert. Die durch die orangefarbene Spur gekennzeichnete Zelllinie LN 4 28 MPG wies eine deutlich höhere Reparaturrate auf, was durch die schnellere Anreicherung von Fluoreszenz angezeigt wurde, im Vergleich zur ursprünglichen Zelllinie LN 4 28, die nur minimale Mengen an MPG-Protein besitzt. Somit kann die Reparaturrate spezifischer DNA-Schäden durch spezifische Reparaturproteine in Echtzeit aus Zelllysaten gemessen werden, mit minimalen Hintergrundraten an unspezifischer DNA-Spaltung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre molekularen Sonden entwerfen und Echtzeit-DNA-Reparaturraten unter Verwendung entweder gereinigter Proteine oder Zelllysate messen können. Bei der Analyse ist es unerlässlich, den dynamischen Bereich und Hintergrundwerte zu bewerten; dies erreichen Sie durch die Einbeziehung von Kontrollreaktionen, beispielsweise mit oder ohne positive und negative Kontrollsonden. Angesichts der Variabilität von Brunnen zu Brunnen ist es sinnvoll, die Daten in den einzelnen Brunnen auf die Eingangswerte zu normalisieren.

Sie werden durch den feineren Schritt bei der Schmelztemperatur bestimmt. Dies sowie die Verwendung weiterer Farbstoffe wie eines Rock-Farbstoffs berücksichtigen die inhärente Variabilität von Pipettierfehlern oder Unterschieden in Detektoren. Mit dieser Technik konnten wir den Einfluss einzelner Komponenten der basenexzisionsreparaturbedingten Reparatur auf die gesamte Reparaturaktivität und -kapazität aufklären.

Es ist empfindlich genug, um geringfügige Veränderungen sichtbar zu machen, die mit herkömmlichen Methoden nicht nachweisbar gewesen wären.