Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Raten der DNA-Reparatur und der Zellkernextrakte in Echtzeit mit Hilfe von molekularen Leuchtfeuern zu messen, die nach der Reparatur fluoreszieren. Molekulare Leuchtfeuer für die Basisexzisionsreparatur bestehen aus Desoxy-Oligonukleotiden in einer Stammschleifenstruktur, die eine einzelne Basenläsion mit sechs Kurven-Oxyfluorescein-Einheiten enthält, die an die fünf Primzahlen konjugiert sind, und Dil Moti, die an die drei Primzahlen konjugiert sind, wenn sie gefaltet sind. Die sechs Fam moty werden durch Dab Sil auf nicht fluoreszierende Weise über den Forester-Resonanz-Energietransfer gelöscht.

Um die DNA-Reparaturaktivität zu beurteilen, werden Beacons mit Zellkernextrakten inkubiert, die Reparaturenzyme enthalten. DNA-Glykosylat wird erkannt und entfernt die DNA-Läsion im Leuchtfeuer. Die resultierenden ABA-Stellen sind Substrate für AP-Endonuklease eins oder ape eins. Bei der Erkennung spaltet APE eins das DNA-Rückgrat an der ABA-Stelle, wodurch die DNA, die die sechs fam enthält, frei von der Haarnadel dissoziieren kann.

Die Ablösung vom Quencher führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenz, die proportional zum Grad der DNA-Reparatur ist und in Echtzeit mit einem quantitativen Echtzeit-PCR-Gerät beurteilt werden kann. Die Fähigkeit, DNA-Schäden zu reparieren, ist für jede Zelle und jeden Organismus von entscheidender Bedeutung. Unter der Vielzahl von zellulären DNA-Reparaturwegen, Basenexzisionsreparaturzielen, beschädigten Basen, die aus oxidativen oder chemischen Beleidigungen resultieren können, ist die Aufklärung der Rolle einzelner zellulärer Elemente, die die Basenexzisionsreparatur beeinflussen könnten, eines der Hauptziele unserer Laborstudien.

Daher ist die genaue und empfindliche Messung der DNA-Reparaturaktivität in unserem Labor zu einem Interesse geworden. Dieser Assay kann solche Daten liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der 32-PN-Markierung und der Analyse durch Gelelektrophorese besteht darin, dass unsere Technik keine radioaktiv markierten Substrate verwendet, die Reparaturraten in Echtzeit messen kann und einen sehr großen Dynamikbereich hat.

Darüber hinaus kann dieser Ansatz mehrere verschiedene Fluor-Fours und/oder Basenläsionen verwenden, um die Substratspezifität zu bestimmen. Wir haben gezeigt, dass dieser Assay sehr quantitativ und in verschiedenen Umgebungen sehr sensitiv ist. Dieser molekulare Beacon-Assay zur Basenexzisionsreparatur ist für die kinetische Analyse geeignet.

Die hohe Sensitivität und Spezifität des Assays ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Basenexzisionsreparatur und ist daher nützlich für das Screening oder die Validierung von Reparaturinhibitoren. Darüber hinaus ist es anpassungsfähig für die Messung der Reparaturaktivität und von Gewebe- und Tumorzelllysaten für funktionelle Biomarker-Messungen. Bei der Entwicklung molekularer Beacons, die für diesen Assay verwendet werden, sollten Sie die folgenden DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 43 Basen berücksichtigen, wie hier gezeigt.

Funktioniert gut. Die DNA-Sequenz ist nicht eindeutig, sondern muss die Bildung einer Haarnadelstruktur ermöglichen. Bei einem Kniefall, wie hier gezeigt, wird die Spezifität durch Insertion spezifischer Basenläsionen wie Uracil oder Tetrahydrofurin erreicht.

An Position X sechs Basen von den fünf Primzahlen entfernt sollte der GC-Gehalt mindestens 32 % betragen und eine GB-Basis sollte nicht am Ende der fünf Primzahlen platziert werden. Sechs Carboxyfluorescein oder sechs fam sollten an das fünf Primzahlen konjugiert werden, und die drei Primzahlen sollten mit Dab Sil modifiziert werden. Dies wird das Substrat für die DNA-Reparaturproteine sein, um die Bindung und Aktivität der Glykosylfreisetzungen sicherzustellen.

Die Position der Läsion wurde so gewählt, dass genügend Platz von der Haarnadelstruktur und dem Ende der DNA entfernt ist. Die Länge des Schaft- oder Haarnadel-Duplex sollte mindestens 15 Basenpaare betragen. Die empfohlene Schlaufenlänge beträgt 13 Basen.

Die molekulare Kontrollbake sollte mit der experimentellen molekularen Bake identisch sein, mit der Ausnahme, dass sie keine DNA-Läsion enthält. Es sollte daher von DNA-Reparaturenzymen nicht erkannt werden. Sobald die molekularen Beacons in der Hand sind, sollte eine Qualitätsbewertung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Beacons nach dem Erhitzen nicht fluoreszieren.

Und um die optimale Schmelztemperatur zu bestimmen, sollten alle Schritte während des Extraktionsprozesses auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Um die Proteinstabilität zu gewährleisten, bereiten Sie sich auf das Experiment vor, indem Sie es vorkühlen. Zwei Ein-Liter-Becher pro Probe, Dialysepuffer-Dialysekammern, Mikrozentrifuge, Röhrchen, Spritzen und Nadeln.

Beschriften Sie konische 15-Milliliter-Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. Saugen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen ab und waschen Sie sie dann zweimal mit 7,5 Millilitern kaltem PBS Nach der zweiten Wäsche. Geben Sie fünf Milliliter kaltes PBS in jede Schale und kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber von der Platte.

Übertragen Sie die Zellen in ein gekühltes konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei 500 mal G bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand und schätzen Sie das gepackte Zellvolumen, indem Sie es mit bekannten Flüssigkeitsvolumina in ähnlichen Röhrchen vergleichen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für eine weitere Minute und entfernen Sie dann das restliche PBS mit einer Pipettenreanimation.

Suspendieren Sie das Zellpellet in 150 Mikrolitern Nuke-Buster-Extraktionsreagenz, eines pro 50 Mikroliter gepackten Zellvolumens. Dann werden die resuspendierten Zellen in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben und 15 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit vortext. Nach dem Vortexen inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis, dann weitere 15 Sekunden lang vortexen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 13.000 Mal G.

Nach dem Schleudern wird der Überstand, der die zytoplasmatische Fraktion enthält, entfernt und verworfen. Bei der Resus-Suspension wird das Pellet in einer Mischung aus einem Mikroliter Resus-suspendiertem 100-fach-Proteaseinhibitor-Cocktail, einem Mikroliter 100 millimolar DTT und 75 Mikrolitern Nuke-Buster-Extraktion suspendiert. Reagenz zwei pro 50 Mikroliter gepacktes Zellvolumen.

Die Zellen des Vortex 15 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit. Inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie erneut 15 Sekunden lang bei einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 13.000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern wird eine Spritze verwendet, um den Überstand, der die Kernproteine enthält, auf eine Dialysekassette mit einem Grenzwert von 7.000 Molekulargewicht zu übertragen.

Anschließend werden 500 Mikroliter eines molaren DTT zu 500 Millilitern vorgekühltem Dialysepuffer gegeben und das Lysat 90 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren dialysiert. Nach 90 Minuten wird die Dialysekassette in ein zweites Becherglas mit 0,5 Litern vorgekühltem Dialysepuffer mit DTT umgefüllt und dialysiert. Das Lysat für 90 Minuten bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren nach der Dialyse, der Extrakt kann aufgrund der hohen Proteinkonzentrationen kristallisiert sein.

Führen Sie anschließend eine neue Spritze in einen anderen Anschluss ein als den, der zum Injizieren der Kassette verwendet wurde, und sammeln Sie die dialysierte Kernproteinlösung aus der Dialysekassette. Versuchen Sie, trüb aussehende Kristalle einzubeziehen, wenn Sie die dialysierte Kernproteinlösung entfernen. Aliquotieren Sie die Probe in Mikrozentrifugenröhrchen von jeweils 20 Mikrolitern, frieren Sie sie schnell auf Trockeneis ein und lagern Sie sie dann bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und führen Sie die Qualitätskontrolle durch, wie im Begleitdokument beschrieben. Um den molekularen Beacon-Assay durchzuführen, tauen Sie die Zelllysate auf und verdünnen Sie sie auf zwei Mikrogramm pro Mikroliter Protein mit einem basischen Cision-Reparaturreaktionspuffer, der ein Millimolar DTT enthält, verdünnen Sie die molekularen Beacons auf 200 Mikromolar mit basischem Exzisionsreparaturreaktionspuffer. Da das quantitative Echtzeit-PCR-Gerät in der Regel nicht als Fluorimeter verwendet wird, ändern Sie die Laufmethode auf dem quantitativen Echtzeit-PCR-Gerät so, dass alle 20 Sekunden bei 37 Grad Celsius für mindestens 180 Zyklen Daten gesammelt werden.

Dann alle 20 Sekunden für 15 Zyklen bei maximaler Fluoreszenz des molekularen Leuchtfeuers, um Daten für die Normalisierung zu erhalten. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 25 Mikroliter ein. Richten Sie dann das Plattendesign auf dem Gerät mit der angewandten Biosystemsoftware ein, wobei die Standardkurve als Experimenttyp ausgewählt wurde, und vervollständigen Sie das Plattenlayout.

Ein Beispiel ist in dieser Tabelle dargestellt, die auch im Begleitdokument zu finden ist. Fügen Sie der als Standardkurve ausgewählten Well-Kurve nichts hinzu. Den basischen Exzisionsreparaturreaktionspuffer DTT-Zelllysat in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Mikroliter und alle im Experiment verwendeten molekularen Leuchtfeuer auf Eis legen.

Geben Sie dann das DTT in den basischen Exzisionsreparaturreaktionspuffer bis zu einer Endkonzentration von einer Millimolarpipette. 15 Mikroliter des basischen Exzisionsreparaturreaktionspuffers mit DTT in jede Vertiefung einer kompatiblen optischen Q-R-T-P-C-R-Platte auf Eis geben. Pipettieren Sie anschließend die Beacons gemäß dem Plattenlayout in die entsprechenden Wells.

Jede Kombination aus Lysat und molekularem Beacon oder Kontrolle sollte in dreifacher Ausfertigung untersucht werden. Zum Schluss pipettieren Sie fünf Mikroliter des verdünnten Kernlysats pro Vertiefung in die entsprechenden Vertiefungen. Es ist wichtig, daran zu denken, alle molekularen Beacon-Reagenzien kalt zu halten und die Lysate als letzten Schritt in die Platte zu pipettieren.

Denken Sie daran, dass die Lysate aktive Proteine enthalten und mit der Reparatur der molekularen Leuchtfeuer beginnen, sobald sie in das Reaktionsgemisch pipettiert werden. Daher ist es sehr wichtig, alle Reagenzien kalt zu halten, um den Umfang der Beacon-Reparatur zu minimieren, die vor Beginn der Messungen auftritt. Sobald alles hinzugefügt wurde, verschließen Sie die Platte mit optischer Klebefolie und mischen Sie sie durch leichtes Klopfen auf die Platte.

Führen Sie dann eine schnelle zehnsekündige Drehung mit einer Zentrifuge durch, um Lösungen am Boden der Röhrchen oder der Platte nach dem Schleudern zu sammeln, setzen Sie die Platte in das quantitative Echtzeit-PCR-Gerät ein und beginnen Sie den Assay nach Fertigstellung, exportieren Sie die Rohdaten, vorzugsweise im Excel-Format, und befolgen Sie die Anweisungen im Begleitdokument, um die Daten zu analysieren, sobald die erforderlichen Berechnungen durchgeführt wurden. Die normierten Fluoreszenzdaten werden als prozentuale freie fam über die Zeit in Sekunden in einem Streudiagramm mit entsprechenden Fehlern dargestellt, um die DNA-Reparaturaktivität und die Qualität von Kernextrakten aus den LN 4 28-Zellen und einer MPG-Überexpressionszelllinie, die als LN 4 28 MPG bezeichnet wird, zu bewerten. Der in diesem Video beschriebene Assay wurde unter Verwendung eines molekularen Beacons durchgeführt, das das APE-Substrat Tetrafurin als Positivkontrolle enthielt.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, weisen beide Zelllinien eine robuste APE-Eins-Aktivität auf, wie durch die steile Steigung, die DNA-Glykosat-Aktivität, die spezifisch für die Entfernung des MPG-Substrats ist, angezeigt wird. Hypohypoxanthin, angegeben als HX, wurde in Kernlysaten beider Zelllinien gemessen. Jedes Lysat wurde entweder mit einem molekularen Beacon für die Basisexzisionsreparatur oder einem molekularen Beacon für die Basenexzisionsreparatur analysiert. Für das Kontrollbeacon ist LN 4 28 grün und LN 4 28 MPG violett für das Hypo-Beacon dargestellt.

LN 4 28 wird in Blau und LN 4 28 MPG in Orange angezeigt. Die Ergebnisse werden als A als mittlere Fluoreszenzeinheiten und B als normierte Fluoreszenz angegeben. Ein zeitabhängiger Anstieg der Fluoreszenz, der auf eine HX-Reparatur hinweist, trat in jeder Zelle auf.

Das Lysat inkubierte wie erwartet mit dem HX-Molekularbeacon. Die durch die orangefarbene Spur angezeigte LN 4 28 MPG-Zelllinie wies eine viel höhere Reparaturrate auf, was durch die schnellere Akkumulation der Fluoreszenz angezeigt wird, als die elterliche LN 4 28-Zelllinie, die ein minimales MPG-Protein aufweist. Auf diese Weise kann die Reparaturrate für spezifische DNA-Läsionen durch spezifische Reparaturproteine aus Zellextrakten in Echtzeit mit minimalen Hintergrundwerten für unspezifische DNA-Spaltung gemessen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre molekularen Beacons entwerfen und die DNA-Reparaturraten in Echtzeit mit aufgereinigten Proteinen oder Zelllysaten messen können. In Bezug auf die Analyse ist es wichtig, den Dynamikbereich und die Hintergrundwerte zu bewerten, indem Kontrollreaktionen wie mit oder ohne die positiven und negativen Kontrollbaken einbezogen werden. Unter Berücksichtigung der Variabilität von Bohrung zu Bohrung ist es sinnvoll, die Daten in den einzelnen Vertiefungen auf die Eingabewerte zu normalisieren.

Diese werden durch den feineren Schritt bei der Schmelztemperatur bestimmt. Dies und die Einbeziehung anderer Farbstoffe wie eines Rock-Würfels wird die Variabilität berücksichtigen, die Pipettierfehlern oder Unterschieden in einem Detektor innewohnt. Diese Technik ermöglichte es uns, den Einfluss einzelner Exzisionsreparaturkomponenten auf die gesamte Reparaturaktivität und -kapazität aufzuklären.

Es ist empfindlich genug, um kleine Veränderungen zu demaskieren, die mit herkömmlichen Methoden nicht erkennbar gewesen wären.