Name: Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Methode zur Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten mit läsionsspezifischen Molecular Beacons. Diese Technik ermöglicht die kinetische Untersuchung von DNA-Reparaturmechanismen.

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Zu RWS Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Pittsburgh-Stiftung und der National Institutes of Health (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] unterstützt. Die Unterstützung für die UPCI Lentivirale Fazilität wurde zu RWS durch die Cancer Center Support Stipendium der National Institutes of Health [P30 CA047904]. Unterstützung wurde auch von der University of Pittsburgh Abteilung für Pharmakologie und Chemische Biologie an DS zur Verfügung gestellt. Unterstützung wurde auch durch ESTRO zu Lebenslauf zur Verfügung gestellt.

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<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
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<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS ist ein wissenschaftlicher Berater Trevigen, Inc. Die übrigen Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte.

Es gibt über 600 Zitate mit dem Begriff &quot;Molecular Beacon&quot; zur Detektion und Quantifizierung zahlreiche Moleküle und enzymatische Aktivitäten, einschließlich Helikaseaktivität 6, DNA-Polymerase-Aktivität 7,8, DNA-Ligase Aktivität 9, Telomerase-Aktivität 10, 11 DNA-Photolyase Aktivität und DNA / RNA-Hybride 12, unter vielen anderen. Neben der Verwendung von Molecular Beacons für die Messung der DNA-Reparatur oben genannten Aktivitäten, haben wir und andere ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fischer </td><td> P217-500 </td><td> Molekulare Klasse </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Fischer </td><td> BP229-1 </td><td> Molekulare Klasse </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Fischer </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Salz </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 &amp;mgr; m-Filter </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyseprodukten </td><td> Durchstechen </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Fischer </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Nadel </td><td> Fischer </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fischer </td><td> 05-408-129 </td><td> Schwarz </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon Tubes </td><td> Fischer </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein Assay Farbstoff re-Konzentrat </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, echtzeit-analyse der base excision repair aktivität in zelllysaten verwendung läsionsspezifischen molecular beacons

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung von DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten im Zellkern-Lysaten mit Basenexzisionsreparatur (BER) Molecular Beacons. Das Substrat (Beacon) aus einem Deoxyoligonukleotid enthaltend eine einzelne Base Läsion mit einem 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) konjugiert an die 5&#39;-Ende und ein DABCYL-Rest konjugiert an das 3&#39;-Ende des Oligonukleotids umfaßt. Die BER Molecular Beacon ist 43 Basen Länge und die Sequenz wurde entwickelt, um die Bildung einer Stamm-Schleifen-Struktur mit 13 Nukleotiden in der Schleife und 15 Basenpaaren in dem Schaft 1,2 zu präsentieren. In dieser Konfiguration geklappt und der 6-FAM-Einheit durch Dabcyl in einem nicht-fluoreszierenden Weise über Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4 abgeschreckt. Die Läsion ist so, dass die folgenden Basis-Läsion Entfernung und Strangbruch die restlichen 5 Basis-Oligonukleotid mit der 6-FAM-Rest vom Stamm gelöst wird positioniert. Lassen Sie einRunde Ablösung von den Quencher (Dabcyl) führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die im Verhältnis zu der Ebene der DNA-Reparatur. Durch das Sammeln mehrerer liest der Fluoreszenz-Werte, ist eine Echtzeit-Bewertung von BER-Aktivität möglich. Der Einsatz von Standard quantitative Echtzeit-PCR-Instrumente erlaubt die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben. Das Design dieser BER Molecular Beacons mit einer einzigen Basisstation Läsion, zugänglich ist, um kinetische Analysen, Quantifizierung und BER-Inhibitor Validierung und anpassbar ist für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität in Gewebe und Tumor Zelllysaten oder mit gereinigten Proteinen. Die Analyse der BER-Aktivität in Tumorlysaten oder Gewebe saugt Verwendung dieser Molecular Beacons kann für funktionelle Biomarker Messungen. Ferner stellt die Analyse von BER-Aktivität mit gereinigten Proteinen mit diesen quantitativen Assay eine schnelle, High-Throughput-Verfahren zur Identifizierung und Validierung von BER-Inhibitoren.

Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung der DNA-Glykosylase- und AP-Endonuklease-Aktivitäten in Kernlysaten von Zellen unter Verwendung von Basen...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Geschwindigkeiten von DNA-Reparatur und zellulären nukleären Extrakten in Echtzeit mithilfe von molekularen Sonden zu messen, die fluoreszieren, sobald sie repariert wurden. Molekulare Sonden für die basenexzisionsreparatur bestehen aus Desoxy-Oligonukleotiden in einer Stamm-Schleife-Struktur, die eine einzelne Basenverletzung enthält, mit sechs Carboxyfluorescein-Gruppen, die an den 5'-Enden und Dabcyl an den 3'-Enden konjugiert sind, wenn die Struktur gefaltet ist. Die FAM-Gruppe wird dabei durch Dabcyl auf nichtfluorescente Weise über Förster-Resonanzenergietransfer unterdrückt.Um die DNA-Reparaturaktivität zu bewerten, werden Sonden mit zellulären Kernextrakten inkubiert, die Reparaturenzyme enthalten. DNA-Glykosylasen erkennen und entfernen die DNA-Läsion in der Sonde. Die resultierenden ABA-Stellen sind Substrate für die AP-Endonuklease 1 (APE1). Nach Erkennung spaltet APE1 das DNA-Backbone an der ABA-Stelle, wodurch die DNA, die die sechs FAM enthält, sich frei von der Haarnadel lösen kann.Die Trennung vom Quencher führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die proportional zum Ausmaß der DNA-Reparatur ist und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier wird die Untersuchung verschiedener Ansätze zur Erkennung von DNA-Läsionen mittels Einzelmolekül-AFM-Bildgebung am Beispiel des Nukleotid-Exzisions-Reparatursystems demonstriert. Es werden die Abläufe der DNA- und Proteinprobenvorbereitung sowie experimentelle sowie analytische Details für die AFM-Experimente beschrieben.

Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Reparatur von definierten DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmid DNA zu quantifizieren. Lesioned Plasmide sind in Säugetieren Empfängerzelle Linien und niedermolekularen Gewicht geerntet mehrere Zeit Punkte nach Transfektion transfiziert. DNA Reparatur Kinetik werden quantifiziert, gefolgt von qPCR Strang-spezifische Primer-Erweiterung verwenden.

Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

Eine nicht beschriftet, nicht-Radio-Isotopen Methode zur DNA-Polymerase Korrekturlesen und eine DNA-Reparatur-Assay wurde mithilfe von hochauflösenden MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine Einzel-Nukleotid-Erweiterung-Strategie entwickelt. Der Test erwies sich als zu sehr spezifischen, einfache, schnelle und einfach durchzuführen, für das Korrekturlesen und reparieren kürzer als 9-Nukleotide patches.

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Hier wird das sgRNA/CAS9-Endonuklease- und Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll vorgestellt, das verwendet werden kann, um die Mutationen zu identifizieren, die mit der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind.

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

Lernen Sie eine quantitative Methode zur Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten mit läsionsspezifischen Molecular Beacons. Diese Technik ermöglicht die kinetische Untersuchung von DNA-Reparaturmechanismen.

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons (Video) | JoVE Journal

Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

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