Name: Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie DNA-Doppelstrangbruch-Reparaturaktivität mit lumineszenzbasierten Reporter-Assays quantitativ messen. Diese Hochdurchsatzmethoden unterstützen die Arzneimittelforschung in der Onkologie.

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Alle Arbeiten wurden von Artios Pharma Ltd. finanziert. Abbildung 1 und Abbildung 3 wurden mit Biorender.com erstellt.

Quantifizierung der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Nanoluciferase-Reporter-Assays

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism%2C+cellular+functions+and+cancer+roles+of+polymerase-theta-mediated+DNA+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).</li>
<li>Ceccaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous-recombination-deficient+tumours+are+dependent+on+Pol%CE%B8-mediated+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair.</a> Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).</li>
<li>van de Kooij, B., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+reporter+constructs+to+monitor+pathway-specific+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks.</a> Front Genet. 12, 809832(2021).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).</li>
<li>Rajendra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((titratable+and+high-throughput+reporter+assays+to+measure+DNA+double+strand+break+repair+activity+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells.</a> Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Wyatt, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+polymerase+%CE%B8-mediated+end+joining+in+the+repair+of+chromosome+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks.</a> Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).</li>
<li>Wood, R. D., Doublié, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+protection+by+DNA+polymerase+%CE%B8%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome protection by DNA polymerase θ.</a> Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).</li>
<li>Belan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((POLQ+seals+post-replicative+ssDNA+gaps+to+maintain+genome+stability+in+BRCA-deficient+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells.</a> Mol Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).</li>
<li>Zatreanu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pol%CE%B8+inhibitors+elicit+BRCA-gene+synthetic+lethality+and+target+PARP+inhibitor+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance.</a> Nat Commun. 12 (1), 3636(2021).</li>
<li>Stockley, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-based+optimization+of+small-molecule+in+vitro+and+in+vivo+probes+for+human+DNA+polymerase+theta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta.</a> J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+the+BRCA2-RAD51+interaction+modulates+RAD51+assembly+and+potentiates+DNA+damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death.</a> Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847 (2021).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230 (2021).</li>
</ol>

D.G., E.R., B.M., A.G., S.J.B., G.C.M.S. und H.M.R.R. sind alle Mitarbeiter und Aktionäre von Artios Pharma Ltd. G.C.M.S. ist ein Aktionär von AstraZeneca PLC. S.J.B. ist Gründer, Wissenschaftler und Aktionär von Artios Pharma Ltd. Für einige der in dieser Studie vorgestellten Reporter (WO 2021/001647) wurde ein Patent angemeldet. Promega ist die Quelle für die NanoLuc-Technologie® und die modifizierten NanoLuc-Polynukleotide®. Artios Pharma wurde von Promega autorisiert, die modifizierten NanoLuc-Polynukleotide® herzustellen.

Hier haben wir Protokolle für die Generierung und Implementierung einer Reihe von extrachromosomalen Lumineszenz-basierten Reportern zur Messung der zellulären Kompetenz der vier wichtigsten DSBR-Signalwege (HR, NHEJ, MMEJ und SSA) beschrieben7. Reportersubstrate können durch transiente Transfektion in Zellen eingeführt und zur Beurteilung der DSBR-Aktivität verwendet werden, indem eine empfindliche und robuste plattenbasierte Auslesung der NanoLuc-Lumineszenz verwendet wird, die bei Interaktion mit verwandten zellulären DSBR-Signalwegen rekonstituiert wird.
Mehrere Stufen der Generierung von Reportersubstraten, der Transfektion der Substrate in Zellen und der Dateninterpretation sind entscheidend für die erfolgreiche Durchführung dieser Assays. Obwohl zur Erzeugung der Reportersubstrate Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet werden, gewährleistet die Visualisierung des Prozesses durch Gelelektrophorese die höchste Qualität und Reinheit der Substrate vor der Transfektion. Da diese Assays auf transienter Transfektion beruhen, gelten für diese Methoden gängige Überlegungen. Dazu gehören die Optimierung der Aussaatdichte, der Transfektionsbedingungen (einschließlich Reagenzien und DNA-Mengen) und die Beurteilung der Eignung für Vorwärts- und Rückwärtstransfektionsformate. Diese Reporter-Assays wurden erfolgreich mit einer Reihe von Elektroporations- und Lipofektionsprotokollen durchgeführt, und die Optionen sollten vor der Durchführung dieser Assays vollständig untersucht werden. Es sollte auch darauf geachtet werden, die NanoLuc- und Firefly-Signale der Komponenten zu untersuchen und nicht nur das Komposit-Reparatursignal, das durch Normalisierung des NanoLuc-Signals (Reportersubstrat) auf das Firefly-Signal (Steuerung) abgeleitet wird. Artefakte können dadurch entstehen, dass das Verhältnis durch Änderungen im Firefly-Signal gesteuert wird. Zum Beispiel sollte die Beurteilung der Hemmung im Dosis-Wirkungs-Modus mit einer hochspezifischen Verbindung das NanoLuc-Signal auf titrierbare Weise unterdrücken, ohne das Firefly-Signal zu stören, das stabil bleiben sollte (Abbildung 4G,H). In Fällen, in denen Firefly-Signale gestört sind, können nützliche Auswirkungen auf die Reparatur jedoch immer noch bestimmt werden, indem ein Dosisfenster identifiziert wird, in dem das Firefly-Signal nicht beeinflusst wird (Abbildung 5).
Im Vergleich zu den am häufigsten verwendeten DSBR-Reporter-Assays haben diese extrachromosomalen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays einige deutliche Vorteile. Da die DSBR-Signalwege hochgradig konserviert sind, können die Assays auch dann über die DSBR-Kompetenz und die Wahl des Signalwegs berichten, selbst wenn die zelluläre Maschinerie zwischen den Zellmodellen variiert. Dies eröffnet die Bewertung von DSBR für jedes Modell, das für den Benutzer von Interesse ist, solange im Voraus optimale transiente Transfektionsbedingungen festgelegt werden.
Die Verwendung von Nanoluciferase als Reportergen bietet auch Vorteile gegenüber fluoreszierenden Optionen, die traditionell in DSBR-Reporterassays verwendet werden. NanoLuc reift schnell und Lumineszenz wird mit einem Platten-Reader8 mit hoher Empfindlichkeit detektiert. In Verbindung mit der Geschwindigkeit der Substratreparatur (da die Reportersubstrate in Zellen mit reparaturbereiten DSB-Enden transfiziert werden) ist dieses Format des DSBR-Reporterassays ideal für die schnelle Abwicklung und quantitative Robustheit, die für das Screening kleiner Moleküle im Rahmen einer industriellen Wirkstoffforschungskaskade erforderlich sind. In der Tat haben wir kürzlich die Implementierung des resektionsunabhängigen MMEJ-Reporterassays in der Entdeckungskaskade beschrieben, die zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren der Polθ-Polymerasedomäne13 verwendet wird.
Es gibt auch Flexibilität bei der Implementierung der Reporter-Assays, um spezifische Fragen zu genetischen und pharmakologischen Störungen von DSBR zu beantworten (Abbildung 3). Zum Beispiel können Zellen vor der Transfektion der Reportersubstrate 48-72 h lang mit siRNA gegen ein Gen von Interesse transfiziert werden. Alternativ können die Auswirkungen einer Genüberexpression auf DSBR-Signalwege getestet werden, indem eine Plasmidtransfektion 24-48 Stunden vor der Transfektion der Reportersubstrate durchgeführt wird. Für pharmakologische Studien beschreibt das vorliegende Protokoll bereits, wie die Verwendung kleiner Moleküle in den Standard-Arbeitsablauf integriert werden kann, aber alternative Formate können Änderungen in den Behandlungsregimen der Verbindung beinhalten, wie z. B. Vorinkubationen oder Auswaschungen.
Die Skalierbarkeit der transienten Transfektion könnte auch groß angelegte Screening-Ansätze unterstützen, bei denen die Batch-Transfektion von Reportersubstraten vor dem Screening durchgeführt wird. Darüber hinaus kann auch die Dauer des Assays von der Transfektion bis zum Auslesen variiert werden. Obwohl die Standarddauern 16-24 Stunden betragen können, können einige Assays in nur 6 Stunden ausgelesen werden7. Bedenken hinsichtlich der Toxizität von kleinen Molekülen oder siRNAs, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen können, sollten bei der Bestimmung der Assay-Dauer ebenfalls berücksichtigt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie skizzierten und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung7 vollständig beschriebenen Assays eine schnelle und robuste Bewertung der zellulären DSBR-Kompetenz ermöglichen. Sie sind hochempfindlich und titraierbar, so dass sie sowohl für genetische als auch für pharmakologische Studien geeignet sind. Entscheidend ist, dass die Reportersubstrate, da sie durch transiente Transfektion in Zellen eingeführt werden können, das Potenzial haben, in jedem transfizierbaren Zellmodell von Interesse verwendet zu werden, anstatt durch stabile Integration auf bestimmte Zelllinien beschränkt zu sein, wie es bei chromosomalen DSBR-Reportern der Fall ist. Eine deutliche Einschränkung dieser extrachromosomalen Reporter-Assays besteht jedoch darin, dass die fehlende Integration in das Genom den physiologischen, chromatinisierten Kontext der DNA-Reparatur und die damit verbundenen regulatorischen Signale und Orchestrierung möglicherweise nicht vollständig rekapituliert15. Zu diesem Zweck ergänzen extrachromosomale Reporter-Assays die bestehenden Methoden der DSBR-Bewertung und erweitern das Instrumentarium an Ressourcen, die sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Wirkstoffforschung geeignet sind.

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen eine besonders toxische Klasse von DNA-Schäden1 dar, aufgrund derer Zellen mehrere DSB-Reparaturwege (DSBR) entwickelt haben, um diese Läsionen zu reparieren. Die vier wichtigsten DSBR-Mechanismen sind die homologe Rekombination (HR), die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), die mikrohomologievermittelte Endverknüpfung (MMEJ) und das Einzelstrangglühen (SSA)2,3. DSBR-Signalwege tragen zur Aufrechterhaltung einer gesunden Gewebeentwicklung und -physiologie bei und schützen vor Krankheiten wie Krebs. Darüber hinaus bergen diese Reparaturmechanismen therapeutisches Potenzial für die Entwicklung von niedermolekularen Modulatoren in der Präzisionsonkologie. Zum Beispiel hat die Ausrichtung auf die DNA-Polymerase θ (Polθ), ein zentrales Enzym im MMEJ-Reparaturweg, aufgrund seiner synthetischen Letalität bei HR-Mangel bei Krebs Interesse geweckt4.
Das Verständnis von DSBR hat daher weitreichende klinische Implikationen, und es werden funktionelle zelluläre Assays benötigt, die in der Lage sind, die Aktivität aller wichtigen DSBR-Signalwege zu messen5. Die Assays müssen sowohl für genetische als auch für pharmakologische Untersuchungen geeignet sein und in allen interessierenden Zellmodellen eingesetzt werden können. Um die Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe zu unterstützen, müssen die Assays hochempfindlich und titraierbar sein, eine schnelle Durchlaufzeit aufweisen und auf Hochdurchsatzformate skalierbar sein, die für das Wirkstoffscreening geeignet sind.
Im Allgemeinen wurde DSBR bisher mit fluoreszenzbasierten Reporter-Assay-Systemen gemessen, die stabil in das Zellgenom integriert waren6. Obwohl die physiologische Rekapitulation des chromosomalen DSBR ein deutlicher Vorteil ist, sind solche Assays auf ein Wirtsmodell beschränkt, in das der Reporter integriert ist, nutzen eine arbeitsintensive Probenvorbereitung und -analyse mittels Durchflusszytometrie und weisen einen begrenzten Durchsatz, eine begrenzte Durchlaufzeit, Robustheit und Empfindlichkeit auf, alles wesentliche Merkmale, die für die Wirkstoffforschung erforderlich sind.
Im Folgenden beschreiben wir eine Reihe von DSBR-Reporter-Assays, die eine Bewertung der vier wichtigsten DSBR-Signalwege ermöglichen. Die Suite der Reporter-Assay-Substrate ist in Abbildung 1 skizziert und in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichungnäher beschrieben 7. Sie sind extrachromosomal und ermöglichen ihre Einführung in Zellen durch einfache vorübergehende Transfektion, und der Einbau eines Nanoluziferase-Reportergens8, das durch die Interaktion mit spezifischen DSBR-Mechanismen rekonstituiert werden muss, erzeugt Sensitivität, Robustheit und Skalierbarkeit. Die folgenden DSBR-Reportersubstratvarianten sind im Protokoll enthalten (Abbildung 1):
Resektionsunabhängiges MMEJ: Dieses lineare Substrat besteht aus einer Kernregion doppelsträngiger DNA (dsDNA) mit einzelsträngigen DNA-Überhängen (ssDNA), die resezierte DNA-Endennachahmen 9. Vier Nukleotid-Mikrohomologien an den Enden der ssDNA-Regionen kodieren für das Startcodon für das Reportergen. Die Reparatur dieses Substrats durch MMEJ stellt den offenen Leserahmen (ORF) des Reportergens wieder her.
Resektionsabhängige MMEJ: Das Exon des N-terminalen Reportergens wird durch ein Segment unterbrochen, das ein Stoppcodon enthält, das von 8 Basenpaaren (bp) Mikrohomologien flankiert wird. Vor der MMEJ-vermittelten Reparatur ist eine nukleolytische Endresektion erforderlich, um das intakte Reportergen wiederherzustellen.
Stumpfer NHEJ: Das Reportergen wird in N- und C-terminale Abschnitte aufgeteilt, wobei letzterer dem Promotor vorgeschaltet ist. Das DSB wird unter Verwendung von EcoRV hergestellt und erfordert eine direkte Ligation (ohne Endverarbeitung) durch NHEJ, damit beide Reportergenteile wieder verbunden und der Reporter-ORF wiederhergestellt werden kann.
Nicht stumpfes NHEJ: Das DSB befindet sich in einem Intron und hat je nach Wahl des Restriktionsenzyms kohäsive oder nicht-kohäsive Enden. Die Reparatur dieses Substrats durch NHEJ erfordert eine Ligation, der eine Endverarbeitung vorausgeht.
Lange Vorlage HR: Das N-terminale Exon des Reportergens wird durch ein DNA-Segment unterbrochen, das Restriktionsstellen enthält, die 22 bp der ursprünglichen Reportergensequenz ersetzen. Um diese Sequenz wiederherzustellen, wird bei der Reparatur durch HR die Homologievorlage mit 2,5 Kilobasen (kb) verwendet, die stromabwärts des C-terminalen Exons platziert sind.
Kurzvorlage HR: Die Restriktionsstelle, die zur Erzeugung des DSB benötigt wird, ersetzt einen Teil der nativen Reportergensequenz und führt ein In-Frame-Stoppcodon ein. Wie die lange Template-Version benötigt auch dieses HR-Substrat das Downstream-Homologie-Template (360 bp) für eine genaue Reparatur und Wiederherstellung des Reporter-ORF.
SSA: Dieses Substrat enthält ein vorzeitiges Stoppcodon, das sich im N-terminalen Exon des Reportergens befindet. Die Entfernung dieses Stoppcodons und die Wiederherstellung der intakten Reportergensequenz erfordert eine Reparatur durch SSA, die eine bidirektionale Langstreckenresektion vor dem Alignment der Homologien beinhaltet.
Zur Erzeugung des DSB können einige der Reportersubstrate mit I-SceI verdaut werden (Abbildung 1). Dadurch wird ein lineares Substrat mit nicht-kohäsiven Enden in den resektionsabhängigen MMEJ-, nicht-stumpfen NHEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Reportern erzeugt, die Tandem-I-Sce I-Stellenin invertierten Orientierungen aufweisen. Im kurzen Template-HR-Reportersubstrat erzeugt der Aufschluss der einzelnen I-Sce I-Stellekohäsive Enden. Die nicht-stumpfen NHEJ-, resektionsabhängigen MMEJ-, Long-Template-HR- und SSA-Plasmide können auch mit HindIII verdaut werden, wodurch komplementäre kohäsive Enden erzeugt werden.
Wir stellen Protokolle für die Generierung der Reporter-Assay-Substrate zur Verfügung und beschreiben, wie die Assays durchgeführt werden können, und liefern Details darüber, wie sie zur Quantifizierung von DSBR verwendet werden können, einschließlich titrierbarer Reaktionen auf kleine Moleküle, der Bewertung der zellulären Potenz, der On-Target-Aktivität und der Selektivität des Signalwegs.

<table><tbody><tr><td>10x FSME-Puffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>20% TBE-Acrylamid Gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6315BOX</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Puffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13321</td><td></td></tr><tr><td>6x Gel Loading Dye, Purple</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>96-well weiße Platte (mit transparentem Boden und Deckel)</td><td>Porvair</td><td>204012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-AG500</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Für die kügelchenbasierte Aufreinigung von DNA</td></tr><tr><td>Antarktische Phosphatase und 10X Puffer</td><td>NEB</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>430-101</td><td>Plate</td></tr><tr><td>Reader Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX1000</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>Kundenspezifische Oligonukleotide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Für resektionsunabhängiges MMEJ-Substrat. Siehe Tabelle 2.</td></tr><tr><td>D300e</td><td>Tecan</td><td>30100152</td><td>DMSO-basierter Compound-Dispenser</td></tr><tr><td>D300e D4+ Kassette</td><td>Tecan</td><td>30097371</td><td>Kassette mit hohem Volumen für D300e Compound-Dispenser</td></tr><tr><td>D300e T8+ Kassette</td><td>Tecan</td><td>30097370</td><td>Kassette mit geringem Volumen für D300e Compound-Dispenser</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid, Zellkulturqualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Vehikel für Compounds, verwendet in Abbildung 4 und Abbildung 5</td></tr><tr><td>DSBR-Meldequellen-Plasmide</td><td>Artios</td><td></td><td>Verfügbar für die akademische Gemeinschaft auf Anfrage&nbsp;</td></tr><tr><td>EcoRV-HF und 10x CutSmart Puffer</td><td>NEB</td><td>R3195M</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3031&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Ultra Low Range DNA-Leiter</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1211</td><td>Niedermolekulare DNA-Leiter</td></tr><tr><td>HEK-293 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Beispiel-Zelllinie, die im Protokoll verwendet wird</td></tr><tr><td>HindIII-HF und 10x CutSmart Puffer</td><td>NEB</td><td>R3104M</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Wasser in Molekularbiologiequalität</td><td>Fisher Scientific</td><td>10275262</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI und 10x Tango Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>ER1771</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>20842.33</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIME Reagenz und Puffer</td><td>PolyPlus</td><td>114-15</td><td>Transfektionsreagenz auf Lipidbasis</td></tr><tr><td>MegaStar 1.6</td><td>VWR</td><td>521-1749</td><td>Zentrifuge für 15 oder 50 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>MEM Eagle</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-08056</td><td>Nährmedium für HEK-293</td></tr><tr><td>Zellen Mikrotiterplatte Schüttler</td><td>Fisherbrand</td><td>15504070</td><td>Mikrotiterplatten-Orbitalschüttler</td></tr><tr><td>MicroStar 17R</td><td>VWR</td><td>521-1647</td><td>Zentrifuge für 1,5 oder 2 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>MultiDrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>5840300</td><td>Reagenziendispenser auf Zell- oder Wasserbasis</td></tr><tr><td>MultiDrop Standard Kassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>24072670</td><td>Kassette für MultiDrop Reagenziendispenser</td></tr><tr><td>NanoDLR Stop & Glo Puffer und Substrat</td><td>Promega</td><td>N1630 oder N1650</td><td>Reporter Luciferase (NanoLuc) Reagenz zum Löschen der Firefly-Lumineszenz und zum Nachweis von NanoLuc-Lumineszenz. Teil des Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System Kits</td></tr><tr><td>ONE-Glo EX Luciferase Assay Puffer und Substrat</td><td>Promega</td><td>N1630 oder N1650</td><td>Control Luciferase (Firefly) Assay Reagenz zum Nachweis von Firefly. Teil des Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System Kits</td></tr><tr><td>PBS (ohne Calcium oder Magnesium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Firefly Plasmid (oder ähnlich)</td><td>Promega</td><td>E1310 (oder gleichwertig)</td><td>Firefly Kontrollplasmid</td></tr><tr><td>pNL1.1 NanoLuc Plasmid (oder ähnlich)</td><td>Promega</td><td>N1091 (oder gleichwertig)</td><td>NanoLuc Kontrollplasmid, zur Anpassung von Geräteeinstellungen/Optimierungsexperimenten</td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb DNA-Leiter</td><td>NEB</td><td>N0552S</td><td>DNA-Leiter mit hohem Molekulargewicht</td></tr><tr><td>Natriumacetat (3 M), pH 5,5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9740</td><td>Zur pH-Einstellung während der Gelextraktion mit dem QIAquick Gel-Extraktionskit</td></tr><tr><td>SYBR Gold (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Zur Visualisierung von ssDNA und dsDNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe (10.000x)</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Nur zur Visualisierung von dsDNA</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase und 10x Ligase-Puffer</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung 0,4</td>%<td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Zur Messung der Viabilität während der Zellzählung</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung; 0,25 % Trypsin und 0,53 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>XhoI und 10x CutSmart Puffer</td><td>NEB</td><td>R0146M</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der reparaturaktivität von dna-doppelstrangbrüchen mit hilfe von hochdurchsatz- und quantitativen lumineszenz-basierten reporter-assays

Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

Die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität und der Zellviabilität. Die DSB-Reparatur (DSBR) in Zellen wird durch mehrere Mechanismen vermittelt: homologe Rekombination (HR), nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung (MMEJ) und Einzelstrang-Annealing (SSA). Zelluläre Assays sind unerlässlich, um die Leistungsfähigkeit und Modulation dieser Signalwege als Reaktion auf verschiedene Reize zu messen.
Hier stellen wir eine Reihe von extrachromosomalen Reporter-Assays vor, die jeweils die Rekonstitution eines Nanoluziferase-Reportergens über einen der vier wichtigsten DSBR-Signalwege in Zellen messen. Nach transienter Transfektion in interessierende Zellen kann die Reparatur von signalwegspezifischen Reportersubstraten in weniger als 24 Stunden durch den Nachweis von Nanoluciferase (NanoLuc) Lumineszenz gemessen werden.
Diese robusten Assays sind quantitativ, sensitiv, titraierbar und eignen sich für ein Hochdurchsatz-Screening-Format. Diese Eigenschaften bieten breite Anwendungen in der DNA-Reparaturforschung und Wirkstoffforschung und ergänzen das derzeit verfügbare Toolkit an zellulären DSBR-Assays.

Die Reparatur jedes Reporter-Assays kann mit dem gleichen Verfahren nachgewiesen und quantifiziert werden. Die korrekte Reparatur eines Substrats durch seinen verwandten Reparaturweg in Zellen rekonstituiert ein intaktes, funktionsfähiges ORF-kodierendes NanoLuc. Dieses Lumineszenzsignal kann mit einem Plattenlesegerät detektiert werden.
Die Co-Transfektion mit einem intakten Plasmid, das für die Firefly-Luziferase kodiert, dient als Transfektionskontrolle. Dieses Steuerelement dient zwei Zwecken. Erstens bietet es einen Standard, auf den das NanoLuc-Signal normalisiert werden kann, da es durch die Modulation von DSBR entweder mit genetischen oder pharmakologischen Mitteln nicht gestört werden sollte. Zweitens kann es einen Hinweis auf zelluläre Störungen außerhalb des Ziels geben, die das Luciferase-Signal beeinflussen, wie z. B. Zellzyklusmodulation, Auswirkungen auf die Transkription/Translation oder allgemeine Toxizität.
Das Verhältnis von NanoLuc zu Firefly dient als Surrogatanzeige der Reparatur. Lumineszenzwerte können exportiert und analysiert werden, indem die beiden Luciferase-Signale aus demselben Well normalisiert werden. Im Falle von Studien zur genetischen Störung (z. B. Vergleich von Wildtyp- und KO- oder Non-Targeting- und Ziel-siRNA) wird die Reparatur in der Regel auf die Elternprobe (Wildtyp-Zellen oder Zellen, die mit Non-Targeting-Kontroll-siRNA behandelt wurden) normalisiert. Im Falle der pharmakologischen Modulation werden die Werte einer mit Verbindungen behandelten Probe auf den Wert normiert, der durch die Vehikelbehandlung erzeugt wird.
Die vollständige Validierung der beschriebenen Reporter-Suite wurde kürzlich veröffentlicht7. Daten, die die Charakterisierung der genetischen und pharmakologischen Modulation von DSBR veranschaulichen, sind in Abbildung 4 dargestellt (adaptiert von 7). Polθ ist der Schlüsselmediator von MMEJ und es wird vorhergesagt, dass der Verlust oder die Hemmung dieses Enzyms spezifisch zelluläres MMEJ abträgt 3,10. Anhand einer Zelllinie, in der POLQ, das für Polθ kodierende Gen, ausgeschaltet wurde11, zeigt der resektionsunabhängige MMEJ-Reporter-Assay, dass MMEJ tatsächlich fast vollständig unterdrückt ist. Die Auswertung der NanoLuc- und Firefly-Lumineszenzsignale zeigt, dass der beobachtete Reparaturdefekt durch eine Verringerung des NanoLuc-Signals (kodiert durch das Reportersubstrat) angetrieben wird, während das Firefly-Signal (Kontrolle) ungestört bleibt (Abbildung 4A-C). Im Gegensatz dazu zeigt die Beurteilung der NHEJ-Kompetenz mit dem NHEJ-Reporter mit stumpfem Ende, dass der POLQ-Knockout die Reparatur des Reportersubstrats nicht hemmt (Abbildung 4D-F). Zusammengenommen unterstützen diese genetischen Daten die spezifische Rolle von Polθ bei der MMEJ-vermittelten Reparatur. Diese Beobachtungen werden pharmakologisch vollständig mit ART558 rekapituliert12,13, einem kürzlich berichteten hochwirksamen und spezifischen Inhibitor der Polymerasedomäne von Polθ (Abbildung 4G), bei dem eine titrierbare Hemmung von MMEJ beobachtet wird, die auf eine spezifische Abnahme des NanoLuc- und nicht des Firefly-Signals zurückzuführen ist (Abbildung 4H). Darüber hinaus gibt es in Übereinstimmung mit genetischen Daten keinen Einfluss auf NHEJ (Abbildung 4I,J). Zusammengenommen zeigen diese Daten, wie diese Reporter verwendet werden können, um die genetische Modulation von DSBR-Signalwegen zu charakterisieren und die zelluläre Potenz und Ziel-/Signalwegspezifität kleiner Moleküle zu zeigen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig04.jpg"> Abbildung 4: Auswirkungen des genetischen Knockouts und der pharmakologischen Hemmung von Polθ auf MMEJ- und NHEJ-Reportersignale. eHAP1 WT- und POLQ(-)- Zellen wurden mit einem Firefly-Kontrollplasmid und mit (A-C) dem resektionsunabhängigen MMEJ-Reporter oder (D-F) NHEJ-Reporter mit stumpfem Ende transfiziert. Der Prozentsatz der MMEJ- oder NHEJ-Reparatur ist das Verhältnis der NanoLuc-Lumineszenz zur Firefly-Lumineszenz, normiert auf die DMSO-behandelte Kontrolle, 24 Stunden nach der Transfektion. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von drei biologischen Replikaten dar, die jeweils durchschnittlich 8 technische Replikate enthalten. HEK-293-Zellen wurden mit einem Firefly-Kontrollplasmid und (G,H) dem resektionsunabhängigen MMEJ-Reporter oder dem (I,J) stumpfen NHEJ-Reporter transfiziert und mit dem Polθ-Polymerase-Inhibitor ART558 behandelt. Der Prozentsatz der Reparatur ist das Verhältnis der NanoLuc-Lumineszenz zur Firefly-Lumineszenz, normiert auf die DMSO-behandelte Kontrolle, 24 Stunden nach der Transfektion. Die prozentuale Hemmung der einzelnen Lumineszenzsignale in (G) und (I) wurde relativ zur DMSO-behandelten Kontrolle berechnet und in (H) bzw. (J) gezeigt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von 2 biologischen Replikaten dar, die jeweils durchschnittlich 4 technische Replikate enthalten. Diese Abbildung wurde von Rajendra et al.7 übernommen. Abkürzungen: NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; WT = Wildtyp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66969/66969fig05.jpg"> Abbildung 5: Hemmung des HR-Reportersignals durch den RAD51-Inhibitor CAM833. (A) HEK-293-Zellen wurden mit dem Long-Template-HR-Reportersubstrat, einem Firefly-Luciferase-Kontrollplasmid, transfiziert und mit dem RAD51-Inhibitor CAM833behandelt 14. Die Lumineszenz von NanoLuc und Firefly wurde 16 h nach der Transfektion gemessen. Der Prozentsatz der HR-Reparatur ist das Verhältnis der NanoLuc-Lumineszenz zur Firefly-Lumineszenz, normiert auf die DMSO-behandelte Kontrolle. Gestrichelte Linien zeigen die prozentuale HR-Hemmung und die CAM833-Konzentration an der Kurve EC50. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von 2 biologischen Replikaten dar, die jeweils durchschnittlich 4 technische Replikate enthalten. (B) Die prozentuale Hemmung der einzelnen Lumineszenzsignale in (A) wurde im Vergleich zur DMSO-behandelten Kontrolle berechnet. Gestrichelte Linien zeigen den prozentualen Anteil der NanoLuc- und Firefly-Hemmung bei 3,33 μM CAM833 (EC50). Die Abnahme des Firefly-Signals bei CAM833-Konzentrationen ≥ 10 μM ist ein Hinweis auf die Toxizität der Verbindung bei hohen Dosen; Eine Reduktion des NanoLuc-Signals wird jedoch bei Konzentrationen beobachtet, bei denen das Firefly-Signal nicht beeinflusst wird, was darauf hindeutet, dass CAM833 eine On-Target-HR-Hemmung induziert. Diese Abbildung wurde von Rajendra et al.7 übernommen. Abkürzungen: NanoLuc = Nanoluciferase; HR = homologe Rekombination. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66969/66969fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Reporter-Substrat</td>
			<td>Quell-Plasmid (Größe in KB, Widerstand)</td>
			<td colspan="3">DSB-Generierung</td>
			<td>Erwartete Größe des endgültigen Reportersubstrats (kb)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Resektionsunabhängige MMEJ</td>
			<td>4.0, Kan</td>
			<td colspan="3">Resektion von 3'-Schwänzen durch Ligatur der Kappen</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Resektionsabhängige MMEJ</td>
			<td>6.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Stumpfer NHEJ</td>
			<td>4.3, Kan</td>
			<td colspan="3">Stumpfe Enden nach Exzision aus dem Plasmid durch EcoRV</td>
			<td>1.7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Nicht stumpfer NHEJ</td>
			<td>6.7, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)</td>
			<td>6.5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Lange Vorlage HR</td>
			<td>9.2, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)</td>
			<td>9.2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Kurzvorlage HR</td>
			<td>9.3, Ampere</td>
			<td colspan="3">I-SceI (zusammenhängend)</td>
			<td>9.3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SSA</td>
			<td>9.5, Kan</td>
			<td colspan="3">I-SceI (nicht kohäsiv), HindIII (kohäsiv)</td>
			<td>9.5</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Reportersubstrat-Plasmide. Abkürzungen: DSB = Doppelstrangbruch; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; HR = homologe Rekombination; SSA = Einzelstrangglühen; Kan = Kanamycin; Amp = Ampicillin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Sequenz (5'-3')</td>
			<td>Lieferant</td>
			<td>Reinigung</td>
			<td>Funktion</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTGTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SEITE</td>
			<td>Linke Kappe, langes Oligonukleotid</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SEITE</td>
			<td>Linke Kappe, kurzes Oligonukleotid</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATCA CAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGG GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SEITE</td>
			<td>Rechte Kappe, langes Oligonukleotid</td>
		</tr><tr><td colspan="3">5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA GCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SEITE</td>
			<td>Rechte Kappe, kurzes Oligonukleotid</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Oligonukleotide für Kappen zur Erzeugung von resektionsunabhängigem MMEJ-Reportersubstrat. Abkürzungen: ssDNA = einzelsträngige DNA; dsDNA = doppelsträngige DNA; MMEJ = Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung; PAGE = Elektrophorese des Polyacrylamid-Gels. Mikrohomologien sind unterstrichen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reporter-Assay</td>
			<td>NanoLuc Reportersubstrat DNA (μg DNA/1x106 Zellen)</td>
			<td>Glühwürmchenkontrolle: Luciferase-Plasmid (μg DNA/1x10,6 Zellen)</td>
		</tr><tr><td>Resektionsunabhängige MMEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Resektionsabhängige MMEJ</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Stumpfer NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Nicht stumpfer NHEJ</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Lange Vorlage HR</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>Kurzvorlage HR</td>
			<td>2</td>
			<td>0.66</td>
		</tr><tr><td>SSA</td>
			<td>1</td>
			<td>0.66</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: DNA-Mengen für die transiente Transfektion von NanoLuc-Reportersubstraten und Firefly-Kontroll-Luciferase-Plasmid (HEK-293, 96-Well-Plattenformat). Abkürzungen: MMEJ = Microhomology-mediated End Joining; NHEJ = nicht-homologe Endverbindung; HR = homologe Rekombination; SSA = Einzelstrangglühen.

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

The repair of DNA double strand breaks (DSBs) is crucial for the maintenance of genome stability and cell viability. DSB repair (DSBR) in cells is ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

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Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

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Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons

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