Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Informationen über die molekularen Messgrößen, die mit der Regulation von Dopamin aus einer einzelnen Gewebeprobe aus den somatodendritischen Regionen des Mittengehirns verbunden sind, zu maximieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine präzise Dissektion durchgeführt wird, um die Substantia nigra vom ventralen tegmentalenen Areal zu trennen. Der zweite Schritt besteht darin, die Gewebeproben zur Analyse von Dopamin mittels HPLC aufzubereiten und das präzipitierte endogene Protein weiter zu verarbeiten, um es zu analysieren.

Anschließend ermöglicht die Aufarbeitung des präzipitierten Proteins hinsichtlich des Gesamtproteingehalts die Bestimmung, welche dopaminregulierenden Proteine oder Proteinphosphorylierungen in Kombination mit der Messung des Dopamingehalts im Gewebe der Probe analysiert werden können. Letztendlich erlauben die Analysen von Dopamin und seinen regulierenden Proteinen in den diskreten Regionen des Mittelhirns mit somatodendritischen Arealen Rückschlüsse auf die molekularen Mechanismen, die mit der Dopaminregulation assoziiert sind.

Die Monoamine beeinflussen viele Verhaltensweisen, und tatsächlich interessieren sich Forscher im Bereich der Sucht, der Biologie und der motorischen Dysfunktion – insbesondere bei Morbus Parkinson – sehr dafür, wie Monoamine wie Dopamin, die wir in meinem Labor untersuchen, die Verhaltensausgänge beeinflussen. Doch die Bedeutung der Untersuchung der Monoamine kann weiter unterstrichen werden, wenn wir verstehen, wie sie auf molekularer Ebene reguliert werden. Der Vorteil unserer Methode besteht darin, dass wir aus einer einzelnen Probe, die aus dem zentralen Nervensystem gewonnen wurde, mehrere Messgrößen aus derselben Probe erhalten können, sodass wir ein vollständiges Profil darüber erhalten, wie molekulare Ereignisse die Dysregulation der Monoamine beeinflussen.

Wir können diese Daten nehmen und sie dann in den Kontext dessen einordnen, wie sich das Verhalten verändern wird. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Bestimmung von Protein und Phosphorylierung Kenntnisse darüber erfordert, wie viel Gesamtprotein je nach den vom Untersucher gewählten Antikörpern für eine genaue Auswertung benötigt wird. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend.

Die Dissektionsmethoden und die Bestimmung von Monoaminen mithilfe der regulatorischen Proteine stellen einen relativ neuen Ansatz zur Analyse der Regulation in vivo dar. Um dieses Verfahren zu beginnen, kühlen Sie die Rattenhirnmatrix, eine Petrischale mit fünf Rasierklingen und einem Skalpell der Größe 11 auf einem Bett aus nassem Eis ab. Kühlen Sie außerdem so viele Röhrchen wie benötigt auf Trockeneis vor.

Danach, nachdem eine Ratte geopfert wurde, das Gehirn entfernen und mit der seitlichen Zerebellarregion in die Kerben der eiskalten Matrix umgedreht einsetzen. Nach einer Minute die kalten Rasierklingen in das gekühlte Gehirn einführen, beginnend etwa zwei Millimeter rostral zum Chiasma opticum zur Analyse des Striatum und Nucleus accumbens. Anschließend die kalten Rasierklingen in jeweils ein Millimeter Abstand weiter einsetzen, bis zur Mitte der Pons; danach die Platzierung der einzelnen Rasierklingen versetzt anordnen, um die Entnahme aus der Matrix zu erleichtern.

Beim Herausziehen der Rasierklingen achten Sie auf den Beginn des Hippocampus, da dieser die beste Orientierungshilfe darstellt, um sicherzustellen, dass die Substantia nigra (SN) und das ventrale tegmentale Areal (VTA) an der Stelle vorhanden sind, an der der Hippocampus das Mittelhirn vollständig umschließt. Schneiden Sie mit der Skalpellklinge Nr. 11 Schnitte, um zuerst die SN vom VTA zu trennen. Entfernen Sie den daraufliegenden Cortex und Hippocampus.

Danach einen vertikalen Schnitt vornehmen, um den pigmentierten Bereich der Substantia nigra (SN) vom ventralen tegmentalen Bereich (VTA) zu trennen, wobei sichergestellt werden muss, dass das Rasiermesser während der Präparation stets mit dem feuchten Eis in Kontakt bleibt. Anschließend einen horizontalen Schnitt an oder nahe der Mittellinie knapp oberhalb des dorsalsten und lateralsten Teils der SN durchführen. Schließlich die Substantia nigra vorsichtig vom übrigen Hirnstamm abtrennen.

Nachdem der SN entfernt wurde, lösen Sie das VTA vorsichtig vom restlichen Mittelhirn. Geben Sie das präparierte Gewebe sofort in vorab gekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie das Gewebe anschließend bei minus 80 Grad Celsius auf, bis es zur Verarbeitung bereit ist.

Homogenisieren Sie das Gewebe bei diesem Verfahren unmittelbar nach der Entnahme vom Trockeneis vorsichtig mit eiskalter 0,1-molarer Perchlorsäure-EDTA-Lösung. Danach lagern Sie die Probe erneut auf Trockeneis. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben bei 12.000 U/min, um ein Sediment zu erhalten.

Den Proteinpellet, der später für Western-Blot-Bestimmungen verwendet werden soll, vorsichtig das Überstand in das HPLC-Gefäß abpipettieren. Die aus der HPLC-Pufferbehandlung stammenden gefrorenen Proteinpellets auf nassem Eis zum Auftauen ablegen und sicherstellen, dass der gesamte Puffer entfernt und archiviert wurde. Für die beidseitige Aufarbeitung des SN 300 Mikroliter 1 % SDS, enthaltend fünf Millimolar Tris und ein Millimolar EDTA, zum Pellet geben und sonifizieren; für die beidseitige Aufarbeitung des VTA reichen 200 Mikroliter 1 % SDS aus.

Als Nächstes die Proben etwa fünf Minuten lang in siedendes Wasser geben, um die Proteindenaturierung abzuschließen. Anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen und sicherstellen, dass die Verschlüsse in diesem Schritt fest verschlossen sind. Danach den BCA-Assay mit einer Proteinstandardkurve im Bereich von zwei bis 40 Mikrogramm Protein verwenden.

Um die Protein­konzentration in den fünf Mikroliter Proben zu bestimmen, verwenden Sie den Medianwert aus einer dreifachen Analyse, um die Proteinmenge anhand der Standard­kurve zu ermitteln. Teilen Sie das Ergebnis durch das Proben­volumen, um die Protein­konzentration zu erhalten. Danach bereiten Sie die Proben mit dem Proben­puffer, der DIO drei Etol zur reduzierenden SDS-Elektrophorese auf einem 10 %igen Acrylamid­gel enthält, gegebenenfalls wie durch die Farbe des Proben­puffers angezeigt vor.

Wechseln Sie zu Gelb und geben Sie Einmolares Tris-Basis pH 8,2 in 10-Mikroliter-Schritten zur Probe hinzu, bis die blaue Farbe sichtbar wird. Um einen korrekten pH-Wert sicherzustellen, trennen Sie die entsprechende Menge an Gesamtprotein mittels SDS-PAGE auf einem 10 %igen Acrylamidgel, anschließend übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern. Stellen Sie den Elektrophoresebehälter auf mindestens 27 Volt ein und lassen Sie die Übertragung über Nacht durchlaufen.

Am nächsten Tag die Membran mindestens 30 Minuten trocknen lassen. Anschließend etwa fünf Minuten mit Poncho S-Lösung anfärben. Danach kräftig mit 0,2 %iger Salzsäurelösung entfärben, bis die einzelnen Proteinbanden deutlich sichtbar sind und die Hintergrundanfärbung entfernt ist.

Danach ein Bild der Poncho-S-Färbung mit ImageJ aufnehmen, um die relativen Proteinmengen in jeder Spur weiter zu quantifizieren und die Ergebnisse von Tyrosinhydroxylase, Dopamintransporter oder vesikulärem Monoamintransporter 2 zu normalisieren. Hier ist die Westernblot-Aufnahme der phosphorylierten Tyrosinhydroxylase an Serin 31 in den Proben der substantia nigra der Ratte. Die kalibrierte Standardkurve für phosphorylierte Tyrosinhydroxylase an Serin 31 reicht von 0,3 Nanogramm bis 2,0 Nanogramm und liegt innerhalb des linearen Nachweisbereichs. Hier ist die Westernblot-Aufnahme der phosphorylierten Tyrosinhydroxylase an Serin 40 in den Proben des ventralen tegmentalen Areals der Ratte.

Die kalibrierte SN 40-phosphorylierte Tyrosinhydroxylase-Standardkurve reicht von 0,2 Nanogramm bis 1,5 Nanogramm und liegt innerhalb des linearen Nachweisbereichs. Die Einhaltung der richtigen Temperatur ist ebenso wichtig wie die Kennzeichnung der Röhrchen. Es ist außerdem wichtig, das Protein zu normalisieren, um die Varianz Ihrer Ergebnisse zu verringern.

Wenn dieses Protokoll sorgfältig befolgt wird, kann es Forschern auf dem Gebiet der motorischen Funktion und des Suchtverhaltens umfangreiche molekulare Messwerte liefern, die die Regulation von Monoaminen und das Gehirn, insbesondere das Dopaminsystem, beeinflussen, worauf es uns ankommt. Diese Messwerte ermöglichen es daher, Verhaltensausgänge äußerst detailliert und gründlich zu analysieren. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Messwerte zur Monoamin-Regulation im Nucleus substantia nigra und im ventralen tegmentalen Areal aus einer einzigen Gewebeprobe maximiert.