Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Information der molekularen Messwerte, die mit der Regulation von Dopamin verbunden sind, aus einer einzigen Gewebedissektion aus den somato dendritischen Regionen des Mittelhirnregens zu maximieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine präzise Dissektion vorgenommen wird, um die substanzielle Nigra vom ventralen Segmentbereich zu trennen. Der zweite Schritt besteht darin, die Gewebe für die Dopaminanalyse mittels HPLC zu verarbeiten und das gefällte endogene Protein für die Analyse weiterzuverarbeiten.

Als nächstes ermöglicht die Verarbeitung des gefällten Proteins für den Gesamtproteingehalt die Bestimmung, welche Dopamin-regulierenden Proteine oder Proteinphosphorylierung in Verbindung mit dem Auslesen des Dopamingewebegehalts in der Probe gemessen werden können. Letztlich geht es um die Analysen von Dopamin und seinen regulierenden Proteinen im diskreten Mittelhirn. Somato-dendritische Regionen lassen Rückschlüsse auf die molekularen Mechanismen der Dopaminregulation zu.

Die Monoamine beeinflussen viele Verhaltensergebnisse, und in der Tat sind Forscher auf dem Gebiet der Sucht, der Biologie und der Bewegungsstörungen, wie insbesondere bei der Parkinson-Krankheit, sehr daran interessiert, wie Monomittel wie Dopamin, die wir in meinem Labor untersuchen, Verhaltensergebnisse beeinflussen. Aber die Bedeutung der Untersuchung der Mono-Mittel kann noch verschönert werden, wenn wir verstehen, wie sie auf molekularer Ebene reguliert werden. Der Vorteil unserer Technik besteht darin, dass wir aus einer einzigen Probe, die aus ZNS-Gewebe gewonnen wurde, mehrere Messwerte aus dieser einen Probe entnehmen können, so dass wir eine vollständige Ablesung davon erhalten, wie molekulare Ereignisse die Dysregulation von Mono-Mittelwerten beeinflussen.

Wir können diese Daten nehmen und sie dann in den Kontext setzen, wie das Verhalten beeinflusst wird. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Bestimmung des Proteins und der Phosphorylierung Kenntnisse darüber erfordern, wie viel Gesamtprotein für eine genaue Ablesung benötigt wird, abhängig von den vom Prüfarzt ausgewählten Antikörpern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Die Dissektionstechniken und die Bestimmung von Monomitteln mit den regulierenden Proteinen ist ein relativ neuer Ansatz zur Analyse der Regulation in vivo. Um dieses Verfahren zu beginnen, kühlen Sie die Nagetiergehirnmatrix, eine Petrischale, die fünf Rasierer und ein Skalpell mit der Nummer 11 enthält, auf einem Bett aus nassem Eis. Kühlen Sie außerdem so viele Röhrchen vor, wie für die Dissektion auf Trockeneis benötigt werden.

Nachdem du eine Ratte geopfert hast, entferne ihr Gehirn und lege das Gehirn auf den Kopf, wobei das laterale Kleinhirn in Kerben in der eiskalten Matrix passt. Führen Sie nach einer Minute die kalten Rasierklingen in das kühle Gehirn ein, beginnend etwa zwei Millimeter, rostral zum Chiasma opticum, für die Analyse des Striatums und des Nucleus accumbens. Führen Sie dann die kalten Rasierklingen jeden Millimeter bis zur Mitte der Teiche ein und staffeln Sie die Platzierung der einzelnen Rasierklingen, um das Entfernen aus der Matrix zu erleichtern.

Wenn Sie die Rasierer herausziehen, achten Sie auf den Anfang des Hippocampus, da dies der beste Anhaltspunkt ist, um das Vorhandensein des SN und des VTA an der Stelle sicherzustellen, an der sich der Hippocampus vollständig um das Mittelhirn wickelt. Nehmen Sie Schnitte mit der Skalpellklinge Nummer 11, um zuerst das SN vom VTA zu zerlegen. Entfernen Sie den darüber liegenden Kortex und Hippocampus.

Machen Sie dann einen vertikalen Schnitt, der den pigmentierten Bereich des SN vom VTA trennt, und stellen Sie sicher, dass der Rasierer während der Dissektion ständigen Kontakt mit dem nassen Eis hat. Machen Sie als Nächstes einen horizontalen Schnitt an oder in der Nähe der Mittellinie, direkt über dem dorsalen und lateralen äußersten Teil des Sn. Zum Schluss kitzeln Sie das SN vom Rest des Hirnstamms weg.

Sobald das SN entfernt wurde, kitzeln Sie das VTA vom Rest des Mittelhirns weg. Legen Sie das präparierte Gewebe sofort in die vorgekühlten Mikrofugenröhrchen. Lagern Sie die Taschentücher dann bei minus 80 Grad Celsius, bis sie bereit für die Verarbeitung sind.

Bei diesem Verfahren wird das Gewebe unmittelbar nach der Entnahme aus dem Trockeneis mit eiskalten 0,1 molaren pro Chlorsäure-EDTA-Lösung schonend homogenisiert. Bewahren Sie die Probe danach wieder auf Trockeneis auf. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben bei 12.000 U/min zum Sedimentieren.

Das Proteinpellet, das für die Bestimmung westlicher Chargen verwendet werden soll, aspiriert anschließend die Überstände in das HPLC-Fläschchen. Legen Sie die noch gefrorenen gefällten Proteinpellets aus der HPLC-Pufferbehandlung zum Auftauen auf das nasse Eis und stellen Sie sicher, dass der gesamte Puffer entfernt und archiviert wurde. Für die bilaterale Verarbeitung des SN werden 300 Mikroliter 1%SDS mit fünf Millimolaren Triss und ein Millimolar EDTA zum Pellet und Ultraschall hinzugefügt, während für die bilaterale Verarbeitung des VTA 200 Mikroliter 1%SDS ausreichen würden.

Legen Sie die Proben anschließend für etwa fünf Minuten in das kochende Wasser, um die Proteindenaturierung abzuschließen. Lassen Sie sie dann auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie sicher, dass die Kappen bei diesem Schritt befestigt sind. Verwenden Sie dann den BCA-Assay mit einem Protein-Standardkurvenbereich von zwei bis 40 Mikrogramm Protein.

Um die Proteinkonzentration in den fünf Mikroliterproben zu bestimmen, verwenden Sie den Medianwert aus einer dreifachen Analyse, um die Proteinmenge gegen die Standardkurve zu bestimmen. Teilen Sie das Ergebnis durch das Probenvolumen für die Proteinkonzentration. Danach werden die Proben mit dem Probenpuffer vorbereitet, der DIO drei etol zur Reduktion der SDS-Elektrophorese auf 10%igem Acrylamidgel enthält, falls erforderlich, wie durch eine Probenpufferfarbe angezeigt.

Wechseln Sie zu gelb, geben Sie eine molare Trisbase pH 8,2 in Schritten von 10 Mikrolitern in die Probe, bis die blaue Farbe sichtbar ist. Um den richtigen pH-Wert zu gewährleisten, lassen Sie die entsprechende Menge des Gesamtproteins mit der SDS-Seite auf 10 % Acrylamidgel laufen und übertragen Sie die Proteine dann auf eine Porengröße von 0,45 Mikrometern. Nitrozellulose, stellen Sie den Hoffer-Tank auf mindestens 27 Volt ein und lassen Sie den Transfer über Nacht erfolgen.

Am nächsten Tag trocknen Sie den Klecks mindestens 30 Minuten lang. Färben Sie es dann etwa fünf Minuten lang mit Poncho S-Lösung. Danach wird es kräftig mit 0,2%iger Salzsäurelösung zurückgehalten, bis sich die einzelnen Proteinbanden eindeutig aufgelöst haben und die Hintergrundfärbung entfernt ist.

Dann erhalten Sie ein Bild der Poncho-S-Färbung unter Verwendung von Bild J, um die relativen Proteinlasten in jeder Spur weiter zu quantifizieren und die Ergebnisse der Tyrosinhydroxylase, des Dopamintransporters oder des vesikulären Monoamintransporters zu normalisieren. Die kalibrierte Standardkurve der syrischen 31-phosphorylierten Tyrosinhydroxylase reicht von 0,3 Nanogramm bis 2,0 Nanogramm und liegt innerhalb des linearen Nachweisbereichs. Hier ist der Western Blot der syrischen 40-phosphorylierten Tyrosinhydroxylase in den ventralen tegmentalen Proben der Ratte.

Die kalibrierte Standardkurve für phosphorylierte Tyrosinhydroxylase SN 40 reicht von 0,2 Nanogramm bis 1,5 Nanogramm und liegt innerhalb des linearen Nachweisbereichs. Die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur ist ebenso wichtig wie die Beschriftung der Röhrchen. Es ist auch wichtig, Protein zu normalisieren, um die Varianz Ihrer Ergebnisse zu verringern.

Wenn dieses Protokoll gründlich befolgt wird, kann es Forschern auf dem Gebiet der Bewegungsfunktion und des Suchtverhaltens umfangreiche molekulare Messwerte liefern, die die Mono-Mean-Regulation und das Gehirn beeinflussen, insbesondere Dopamin, woran wir interessiert sind. Und als Ergebnis können diese Messwerte eine sehr detaillierte, gründliche Analyse dessen liefern, was dies für die Verhaltensergebnisse bedeutet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Messwerte der Monoaminregulation im substantiellen Nigra- und ventralen tegmentalen Bereich durch eine einzige Gewebedissektion maximieren können.