Name: Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Schwimmfrequenz von C. elegans mittels Laserbeugungsanalyse in drei Dimensionen messen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung frei schwimmender Nematoden ohne mikroskopische Einschränkungen.

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Wir danken Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello und Karl Spuhler für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund und der NASA-Auszeichnung # NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) ​​award # 0630388 und NSF unterstützt award # 1058385.

Ein. C. elegans Vorbereitung für Video Analysis <ol><li> Bewegen 10-20 gravid adulte Nematoden an die frische NGM-Agar gefüllte Petrischalen mit einem dünnen, flachen Platindraht Wahl. Die Petrischalen mit der NGM-Agar gefüllt enthalten einen kleinen kreisförmigen Fleck von E. coli (ein Wachstum begrenzte Belastung, OP50, die besten Ergebnisse) für die Nematoden zu essen. Lassen Sie die Nematoden, um Eier für 3-5 Stunden zu legen und entfernen Sie dann die Erwachsenen, wodurch eine kleine, entwicklungspolitisch-synchronisierte Kultur 50-150 Nematoden. Lassen Sie die Nematoden zu frühen Erwachsenenalter durch Inkubation der Petrischalen bei 20 ° C für 4-5 Tage wachsen. Diese Kultur Methoden basieren auf etablierten Verfahren (Stiernagle 2006). 5 </li><li> Am Tag der Videoanalyse, spülen eine Platte von jungen Erwachsenen Nematoden mit 1 ml deionisiertes, destilliertes Wasser, so sammeln 50-150 Würmer aus dem synchronisiert Kultur. Eine Pufferlösung wie M9 oder PBS können ebenfalls verwendet werden. Verwenden Sie eine Mikrozentrifuge die w Spinorms dem Boden des Röhrchens, oder es ihnen ermöglichen, durch Schwerkraft für etwa 15 min absetzen. Entfernen Sie den Großteil des Wassers aus der Tube und ersetzen Sie es mit 1 ml entionisiertem, destilliertem Wasser, um eventuell anhaftende Bakterien aus der Nematoden zu waschen. </li><li> Übertragen Nematoden in Wasser oder Puffer auf eine Quarzküvette mit einer Mikropipette. Es ist wichtig, mit einer geringen Anzahl arbeiten, etwa 5-10 Nematoden insgesamt auf einmal oder sogar weniger, so dass ein Fadenwurm zu einer Zeit ist, die wahrscheinlich vom Laser beleuchtet werden. Wenn die Anzahl von Nematoden auf den Kulturplatten zu groß ist, verdünnt den Würmern in Wasser oder Puffer, bis eine gewünschte Dichte erreicht ist. Es ist auch möglich, einzelne Nematoden zu einem Tropfen Wasser oder Puffer auf einer frischen Agarplatte holen, um sie zu waschen und zu übertragen einzelnen Würmer in die Küvette. In unserer Studie haben wir 1 mm, 2 mm und 5 mm Küvette Größen, die Auswirkungen von physischen Beschränkungen auf Schwimmen Verhalten zu untersuchen. </li></ol> 2. Optischer Aufbau für die Video Analysis <ol><li> Führen Sie ein Setup wie in Abbildung 1 gezeigt, unter Verwendung eines 543 nm (grün) Helium-Neon (HeNe)-Laser, zwei Front-Oberfläche Aluminium Spiegel, einen Küvettenhalter, eine Leinwand, und eine High-Speed-Kamera (Casio High Speed ​​Exilim) Lage der Dreharbeiten bei ~ 240 fps. Die beiden Spiegel verwendet werden, um den Laserstrahl durch die Küvette zu lenken. Unterschiedliche Größen der Küvetten können verwendet werden, abhängig von der Art der Untersuchung sein. Als Beispiel verwendeten wir Küvetten, die 5 mm dick sein, um die Wirkungen von räumlichen Zwängen auf Schwimmen Frequenzen zu erhalten. Der Laserstrahl muss den Anforderungen für Oversampling;. Dh der Organismus nicht mehr als ein Drittel des Laserstrahls zu behindern. Für C. elegans, sollte der Laserstrahl etwa 2 mm im Durchmesser sein, wenn es mit einem Nematoden interagiert. Der Laserstrahl sollte nicht größer als 5 mm im Durchmesser, da das Beugungsmuster wird schwierig zu lokalisieren. Der Abstand von der beugenden Organismus auf dem Bildschirm sollte viel größer alsder Organismus selbst. </li><li> Ort Parafilm über die Oberseite der Küvette und invertieren Sie die Nematoden in die Wassersäule mischen. Setzen Sie die Küvette in einem Küvettenhalter so dass Würmer sind zunächst in der Nähe der Spitze der Küvette. Verwendung der Spiegel, Lenken des Laserstrahls durch die Mitte der Küvette. Weil die Nematoden dichter als Wasser sind, wird sie langsam zu dem Boden der Küvette fallen, während zur gleichen Zeit schwimmen innerhalb der Wassersäule. </li><li> Auf dem Projektionsschirm, Farbe der Fleck entsprechend dem übertragenen Laserstrahls schwarz zu reduzieren Streuung als der Sendestrahl trifft den Projektionsschirm (Abbildung 2). Alternativ setzen eine Öffnung in dem Projektionsschirm, damit der Sendestrahl durch das Sieb passieren. Eliminierung oder Reduzierung Streuung von der Sendestrahl hält den CCD-Arrays der Kamera von sättigenden aufgrund der Sendestrahl. </li><li> Um ein Maß für die Größe des Beugungsmusters erfassen, eine Linie vonetwa 5 cm auf dem Projektionsbildschirm neben der übertragenen Laserstrahlflecks ohne Störung des gebeugten Lichts Bildes. </li><li> Starten Sie die Aufnahme mit der Kamera während der Raum leuchtet auf, so dass die 5 cm Linie auf dem gleichen Material wie die Beugungsbilder ist. Schalten Sie das Raumlicht aus. Rekord Beugungsbilder auf dem Bildschirm mit der Kamera wie Würmer durch den Laserstrahl passieren. </li></ol> 3. Video Data Preparation <ol><li> Installieren Sie Video-Analyse-Programm (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) auf dem Computer. Importieren Sie das Video in Video-Analyse-Programm </li><li> Stellen Sie den Ursprung mit dem übertragenen Laserpunkt zusammenfallen. Stellen Sie die Waage mit dem 5 cm Linie auf die Projektionsfläche. </li><li> Verfolgen der Winkelverschiebung des Beugungsbildes durch jeden Nematoden mit Hilfe der Video-Analyse-Software ausgebildet (Figur 3) </li><li> Um die Angulation findenr Verschiebung, indem sie die arctan (y / x), Kopieren und Einfügen von Daten in eine Tabellenkalkulation (Excel) und fügen Sie 180 Grad oder π für alle negativen Winkeln, um eine kontinuierliche Kurve (Figure. 4) zu produzieren. </li></ol> 4. Real Time Data Acquisition für Instant Beobachtung Schwimmen Frequenzen <ol><li> Mit dem gleichen Setup wie bei der Video-Analyse, legen Sie eine Photodiode (DET10A von Thorlabs) mit einer kleinen Fläche (~ 1 mm 2) aus der Mitte in dem Beugungsmuster direkt vor der Projektionsfläche. </li><li> Schließen Sie die Photodiode zur digitalen Oszilloskop (PicoScope von Pico Technology hergestellt), die an den Computer über USB-Anschluss verbindet. Beachten Sie die Prügel Muster auf dem Computer-Bildschirm. </li><li> Speichern erworbenen Datensätze im ASCII-oder Text-Format. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Importieren Sie die erfassten Daten mit Hilfe von Video-oder die Photodiode in einen Daten-Analyse-Programm in der Lage passende Wellenformen mit Chi-Quadrat-Minimierung. Das Programm dient hier Origin ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Montieren einer Sinuskurve, Bildfehler-Frequenz (4 und 5) zu bestimmen. </li><li> Durchschnittliche Schwimmen Frequenzen aus verschiedenen Proben und bestimmen Varianz. Für diese Studie wurden statistisch analysiert mittels eines Single-Faktor ANOVA, gefolgt von der Bonferroni multiple Vergleiche Tests beobachtet. Ein p-Wert von &lt;0,05 wurde als statistisch signifikant. </li></ol> 6. Modell Beugungsmuster mit Mathematica als Beispiel Hinweis: Beugungsmuster können modelliert mit vielen verschiedenen Rechenwerkzeuge werden. Dieses Verfahren wird für verschiedene Computational Tools wie MatLab, Excel, Origin usw. unterscheiden <ol><li> Image erstellen: Nehmen Sie Bilder von Nematoden auf einem Objektträger mit einem herkömmlichen Mikroskop. </li><li> Binarisieren Bild: Importieren des Wurms image &#39;Worm&#39; into Mathematica, indem Sie das Bild in Mathematica. Wandeln Sie das Bild in ein Schwarz-Weiß-Bild (Binärisierungsverfahren). Dies kann mit der &#39;Binarisieren&#39; Befehl in Mathematica erreicht werden: BlackandWhiteImage = Binarisieren [Worm]. Das Bild kann dann als eine Schwarz-Weiß-Bild angezeigt werden. Alternativ können Sie auch den &quot;EdgeDetect &#39;Befehl, um eine BlackandWhiteImage erstellen: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], wobei die beiden hinteren Ziffern steuern die Grobheit der entstehenden Kanten. </li><li> Wandelt Bilder in eine Matrix aus Nullen und Einsen: Dies kann mit dem &quot;ImageData &#39;Befehl in Mathematica erreicht werden: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Fourier-Transformations-Matrix: Verwenden Sie die &#39;Fourier-Befehl in Mathematica eine Fourier-Transformation der Matrix unter Verwendung der angegebenen FourierParameters: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Platz Elastizitätsmodul der Matrix zu erhalten die Beugung Matrix und verbessert den Bildkontrast: Square die absoluteWert der Matrix und das resultierende Bild anzuzeigen, welches das Beugungsmuster entsprechend dem Originalbild ist. Auch die &#39;Log&#39; Funktion, um den Kontrast des Bildes zu skalieren: ImageContrast = Image [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Resize Bild für einfache Betrachtung: Crop die zentrale Beugungsmuster und die Größe wie gewünscht: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Vergleichen Sie die modellierten Beugungsmuster mit Beugungsmuster von frei schwimmende Würmer erhalten. (Abbildung 6) </li></ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben einen neuartigen Ansatz zur Echtzeit-Messung von Bewegung und einfachen motorischen Verhaltensweisen in mikroskopischen Organismen wie Nematoden, die nicht erfordert den Einsatz von Mikroskopen entwickelt. 8 Dieser methodologische Ansatz könnte auch für das Studium zahlreiche mikroskopische Organismen wie Protisten genutzt werden. Diese Methode wird nur durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts begrenzt. Der Organismus sollte nicht kleiner sein als die Wellenlänge des Lichts. Zusätzlich zu den Kosteneinsparungen und Portabilität der Geräte benötigt wird, ist ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes die Fähigkeit, Verhalten in Echtzeit und in drei Dimensionen zu messen, ohne die engen Grenzen von Bildebenen unter dem Mikroskop. Es ist auch möglich mit dieser Technik Einflüsse der Gravitation oder zahlreiche andere Bedingungen auf Verhalten, das nicht studiert mit Mikroskop-basierten Ansätzen werden können zu prüfen. 9 So können wir ein besseres Verständnis der Mikroorganismen natürlichen Bewegungsapparates beha zu erreichenviors aus der Enge Objektträger Tröpfchen oder spezialisierte mikrofluidischen Kammern (Park et al, 2008) befreit. 10 Das Fehlen von Informationen in einer Phase Beugungsmuster nicht zum direkten Abrufen des Bildes entsprechend der beugenden Objekts da das Fernfeld-Beugungsmuster proportional zum Quadrat des Absolutwerts der Fouriertransformation ist erlauben. Wir werden daher Berechnen Beugungsmuster von Schnecke Bilder, so daß sie mit den Beugungsstrukturen der frei schwimmende Nematoden (Abbildung 6) zugeordnet werden kann. Dieses Verfahren hat für wirklich frei schwimmende C ergab elegans und kann zu jeder mikroskopischen Arten aufgebracht werden, dass Manöver in einem optisch transparenten Umgebung wie Wasser oder viele verschiedene ionische Lösungen. Konventionelle Mikroskope erlauben nur Studien mit einer fokalen Tiefe in der Größenordnung von Mikrometern. 11 Dies ist aufgrund der begrenztenSchärfentiefe beim Fokussieren Licht: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> wo die f-Zahl N hat eine wechselseitige Beziehung mit dem Kreis der Verwirrung (c), so dass ein kurzer Brennweite mit einer großen c verbunden ist. 12,13 Während diese Beugung Methode ist sicherlich kein Ersatz für herkömmliche Mikroskopie ist es in der Lage quantitative Ergebnisse schnell, so dass Arten können sogar in Echtzeit bei niedrigen Kosten manipuliert werden liefern. Die Beugungsmuster kann mit jedem Laserpointer erhältlich. Die Beugungsmuster können zu einem reduzierten zeitlichen Auflösung mit einer normalen Digitalkamera gefilmt werden. Während der Benutzer möglicherweise nicht über ein Mikroskop oder eine Fotodiode ohne weiteres verfügbar sind, können wesentliche Teile dieses Experiments wie das Messen und Auswerten Thrashing Frequenzen Beugungsmuster zu extrem niedrigen Kosten durchgeführt werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 543 nm HeNe Laser </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Jeder Laser im sichtbaren Bereich bei weniger als 5 mW verwendet werden. </td></tr><tr><td> 2 Front Surface Aluminum Spiegel </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim Kamera </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Quarzküvette </td><td> Starna Cells </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Vernier </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Wolfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of frei schwimmen mikroorganismen mittels laserbeugung

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Böden und Gewässer mikroskopisch kleinen Organismen leben und verhalten sich in einem komplexen dreidimensionalen Umgebung. Die meisten Studien über mikroskopischen Organismus Verhalten, im Gegensatz, durchgeführt wurden, mit Mikroskop-basierte Ansätze, die die Bewegung und das Verhalten zu einem schmalen, fast zweidimensionalen Bildfeld zu begrenzen. 1 Wir präsentieren einen neuartigen analytischen Ansatz, die Echtzeit-Analyse der bietet frei schwimmende C. elegans in einer Küvette ohne Abhängigkeit von Mikroskop-basierten Geräten. Dieser Ansatz umfasst die Verfolgung der zeitlichen Periodizität Beugungsmuster durch Richten von Laserlicht durch die Küvette erzeugt. Wir messen Schwingungsfrequenzen für frei schwimmen Nematoden. Die Analyse der Fernfeld-Beugungsmuster zeigt Hinweise auf die Wellenformen der Nematoden. Beugungsordnung ist der Prozess der Biegung um Licht einem Objekt. In diesem Fall Licht gebeugt durch die Organismen. Die Lichtwellen interferieren und können ad bildeniffraction Muster. Ein Fernfeld-oder Fraunhofer, Beugungsmuster gebildet wird, wenn der Bildschirm-to-Objektabstand ist viel größer als der beugenden Objekts. In diesem Fall kann das Beugungsmuster berechnet (Model) werden unter Verwendung einer Fourier-Transformation. 2 C. elegans sind frei lebende Boden lebende Nematoden, die in drei Dimensionen zu navigieren. Sie bewegen sich beide auf einer festen Matrix wie Boden oder Agar in einer sinusförmigen Bewegungsapparates Muster genannt kriechen und in einer Flüssigkeit in einem anderen Muster als Schwimmen. 3 Die Rollen gespielt von sensorischen Informationen mechanosensorischen, chemosensorischen und thermosensory Zellen, die plastischen Veränderungen regieren Bewegungsapparates vorgesehen Muster und schaltet in den Mustern sind erst am Anfang geklärt werden. 4 Wir einen optischen Ansatz zu beschreiben, messen Nematoden Fortbewegung in drei Dimensionen, die nicht erfordert ein Mikroskop und wird es uns ermöglichen zu beginnen, um die Komplexität von Nematoden Fortbewegung unter verschiedenen co erkundennditions.

<html> Als Beispiel untersuchten wir C. elegans in einer Quarzküvette 1 cm breit, 5 mm dicke und 4 cm hoch Küvette. Abtasten eines einzigen Wurm mit Video-Analyse, ist die durchschnittliche Schwimmen Frequenz von Video-Analyse in einem 5 mm dicken Küvette erhalten etwa 2,5 Hz (Abbildung 4). Ebenso Abtasten eines einzigen Wurm mit dem Echtzeit-Datenerfassung Methode erhalten wir einen Swimming Frequenz von etwa 2,7 Hz (Abbildung 5), mit dem digitalen Oszilloskop (PicoScope). Dieser Vorgang kann für viele Würmer wiederholt werden. Eine detaillierte Studie der frei schwimmende Würmer ergab einen durchschnittlichen Schwimmen Frequenz von 2,37 Hz in einem 5 mm Küvette. 6 Wie erwartet, ist das Schwimmen höheren Frequenz als bei einer kriechenden Schnecke (~ 0,8 Hz). 3 Mit dieser Beugung Methode, die durchschnittliche Schwimmen Frequenzen eines C. elegans, die auf einen Objektträger eingeschlossen ist, wurde festgestellt, dass die zuvor publizierte Wert von 2 Hz übereinstimmen. 1,7 ve_content &quot;&gt; folgenden Prozeduren 3.) und dann 6.) erlaubt für die Modellierung des Schwimmens Beugungsmuster mit Hilfe von Schnecken Bilder mit einem herkömmlichen Mikroskop erhalten. Die modellierten Beugungsmuster verwendet werden, um ein Bad Zyklus der C. elegans simulieren ( Abbildung 6). Ein erfolgreiches Modell besteht aus physikalisch Machbaren aufeinander schwimmen Mustern passend zu den Swimming-Frequenzen. Die Schnecke sollte in der gleichen Form am Ende des baden-Zyklus sein, wie es am Anfang des baden-Zyklus war. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein grüner HeNe-Laser wurde verwendet, um eine dynamische Beugungsmuster mit Live-C erstellen elegans. Dieses Beugungsmuster wurde bei 240 fps gefilmt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dra<html> Flügel ein schwarzer Punkt erhöht die Absorption des transmittierten Strahls. Sättigung der Kamera durch Streulicht reduziert wird und das Beugungsmuster sichtbar wird. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Abbildung 3. Screen shot der Video-Analyse-Software (Logger Pro) mit einem Wurm Beugungsmuster, das wird verfolgt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Abbildung 4. Video-Daten entsprechend dem Schwimm-Zyklus eines Nematoden in einem 5 mm Küvette. Die Kurvenanpassung zeigt einen Swimming Frequenz von ~ 2,5 Hz. &quot;/&gt; Abbildung 5. Echtzeitdaten entsprechend dem Schwimm-Zyklus eines Nematoden in einem 5 mm Küvette. Die Kurvenanpassung zeigt einen Swimming Frequenz von ~ 2,7 Hz. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die obere Zeile repräsentiert die tatsächliche Beugungsmuster ist und mit den modellierten Beugungsmuster in der unteren Reihe abgestimmt. Die modellierten Beugungsmuster wurden mit Würmern auf einem Objektträger (mittlere Reihe).

Mikroskopische Organismen wie die frei schwimmenden Nematoden<em&gt; C. elegans</em&gt; Leben und verhalten sich in einem komplexen dreidimensionalen Umgebung. Wir berichten über einen neuartigen Ansatz, der Analyse bietet<em&gt; C. elegans</em&gt; Mit Beugungsmuster. Dieser Ansatz umfasst die Verfolgung der zeitlichen Periodizität Beugungsmuster durch Richten von Laserlicht durch eine Küvette erzeugt.

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Mikroskopische Boden- und Wasserorganismen leben und verhalten sich in einer komplexen dreidimensionalen Umgebung. Die meisten Studien zum Verhalten mikroskopischer Organismen in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Schlagfrequenzen frei schwimmender mikroskopischer Organismen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe mikroskopischer Würmer vorbereitet wird. Anschließend wird der optische Aufbau vorbereitet.Dann wird das Beugungsmuster aufgezeichnet, das durch die lebenden Organismen verursacht wird. Schließlich werden die aufgezeichneten Daten analysiert, um die Schwimmfrequenzen zu bestimmen. Letztendlich dient die Beugungsanalyse dazu, Veränderungen in den Fortbewegungsmustern ungefesselter Würmer aufzuzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der traditionellen Mikroskopie besteht darin, dass Schwimmverhalten beobachtet werden kann, während die Art sich frei in einem dreidimensionalen Raum bewegt. Obwohl diese Methode Einblicke in das freie Schwimmen von C. elegans ermöglicht, kann sie auch auf andere durchsichtige, kleine und mikroskopische Organismen angewendet werden, die unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt sind. Um C. elegans für die Videoanalyse vorzubereiten, beginnen Sie damit, mit einem abgeflachten Platindraht 10 bis 20 GR adulte Nematoden auf frisches NGM zu übertragen.Mit Agar gefüllte Petrischalen, die kleine runde Stellen mit E. coli enthalten. Die Nematoden drei bis fünf Stunden lang Eier legen lassen und anschließend die erwachsenen Tiere entfernen. So entsteht eine kleine, entwicklungsynchronisierte Kultur aus 50 bis 150 Nematoden. Um die Nematoden bis zum frühen Erwachsenenstadium heranzuziehen, die Petrischalen vier bis fünf Tage bei 20 Grad Celsius inkubieren.Am Tag der Videoanalyse ein Milliliter deionisiertes destilliertes Wasser verwenden, um eine Platte mit jungen adulten Nematoden abzuspülen, um so 50 bis 150 Würmer aus der synchronisierten Kultur zu gewinnen. Die Würmer mithilfe einer Mikrozentrifuge auf den Boden des Röhrchens zentrifugieren oder etwa 15 Minuten lang durch Schwerkraft sedimentieren lassen. Anschließend den Großteil des Wassers vom Röhrchen entfernen und durch ein Milliliter deionisiertes destilliertes Wasser ersetzen, um anhaftende Bakterien von den Nematoden abzuwaschen.Übertragen Sie mit einer Mikropipette fünf bis 10 Nematoden in Wasser auf eine Quarzküvette. Bauen Sie den optischen Aufbau wie hier gezeigt auf, unter Verwendung eines 543 Nanometer Helium-Neon-Lasers, zweier Aluminiumspiegel mit vorderer Reflexionsoberfläche zur Lenkung des Laserstrahls durch die Küvette, eines Küvettenhalters, eines Projektionsschirms und einer Hochgeschwindigkeitskamera, die in der Lage ist, mit etwa 240 Bildern pro Sekunde zu filmen. Bedecken Sie anschließend die Öffnung der Küvette mit einem Stück Parafilm und drehen Sie sie um, um die Nematoden in der Wassersäule zu vermischen.Platzieren Sie die Röhre in einem Röhrenhalter, sodass sich die Würmer anfangs nahe dem oberen Ende der Röhre befinden. Lenken Sie mithilfe der Spiegel den Laserstrahl durch die Mitte der Röhre. Da die Nematoden dichter als Wasser sind, sinken sie langsam zum unteren Ende der Röhre, während sie in der Wassersäule schwimmen. Färben Sie auf dem Projektionsbildschirm den Bereich, der dem transmittierten Laserstrahl entspricht, schwarz, um die Streuung zu verringern, wenn der transmittierte Strahl auf den Bildschirm trifft.Die Streuung des transmittierten Strahls zu eliminieren oder zu reduzieren, verhindert, dass das CCD-Array der Kamera aufgrund des transmittierten Strahls sättigt. Um ein Maß für die Größe des Beugungsmusters aufzuzeichnen, zeichnen Sie eine Linie von etwa fünf Zentimetern Länge auf den Projektionsschirm neben dem Fleck des transmittierten Laserstrahls, ohne das Bild des gebeugten Lichts zu stören. Schalten Sie das Raumlicht aus und nehmen Sie Beugungsbilder auf dem Schirm auf, während die Würmer den Laserstrahl passieren.Um die Videodaten vorzubereiten, installieren Sie das folgende Videoanalyseprogramm und importieren Sie das Video in das Programm. Legen Sie den Ursprung mithilfe der Software so fest, dass er mit dem transmittierten Laserspot übereinstimmt. Verfolgen Sie die Winkelverschiebung des Beugungsbildes, das von jedem Nematoden erzeugt wird.Kopieren und fügen Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation ein und addieren Sie 180 Grad oder PI zu allen negativen Winkeln, um einen kontinuierlichen Graphen zu erzeugen. Verwenden Sie die Videoanalyse-Einrichtung, um eine Fotodiode mit einer kleinen Fläche exzentrisch im Beugungsmuster direkt vor dem Projektionsschirm über einen USB-Anschluss anzubringen.Schließen Sie die Photodiode an das digitale Oszilloskop an, das mit dem Computer verbunden ist. Beobachten Sie die Schlagmuster auf dem Computerschirm. Speichern Sie die Datensätze im ASCII- oder Textformat, um die Daten zu analysieren.Verwenden Sie ein Video oder das Foto, um die Daten in ein Datenanalyseprogramm zu importieren, das in der Lage ist, Wellenformen anzupassen. Passen Sie mithilfe der Chi-Quadrat-Minimierung eine sinusförmige Kurve an, um die Schlagfrequenz zu bestimmen. Mitteln Sie die Schwimmfrequenzen aus verschiedenen Proben und ermitteln Sie die Varianz.Für diese Studie wurden die Daten statistisch mit einem einstufigen Inova unter anschließendem Bon Ferran analysiert. Beim multiplen Vergleichstest wird ein P-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant angesehen, um Beugungsmuster zu modellieren. Beginnen Sie damit, mithilfe eines Mikroskops Bilder aufzunehmen, um ein Bild zu analysieren.Ziehen Sie es in Mathematica hinein. Verwenden Sie den Befehl „binary eyes“, um es in ein Schwarz-Weiß-Bild umzuwandeln. Alternativ verwenden Sie den Befehl „edge detect“, um ein Schwarz-Weiß-Bild zu erzeugen, wobei die beiden nachfolgenden Zahlen die Grobheit der resultierenden Kanten steuern.Danach mithilfe des Befehls „image data“ das Bild in eine Matrix aus Nullen und Einsen umwandeln. Mit dem Befehl „forer“ die Matrix transformieren, anschließend den Absolutwert der Matrix quadrieren und das resultierende Bild betrachten, welches dem Beugungsmuster des ursprünglichen Bildes entspricht. Zusätzlich die Kontraste des Bildes mithilfe der Logarithmusfunktion skalieren.Vergleichen Sie abschließend die modellierten Beugungsmuster mit den Beugungsmustern, die von frei schwimmenden Würmern erhalten wurden. In diesem Beispiel wurden Sea Elegance in einer Quarz-Q-Küvette mit einer Breite von einem Zentimeter, einer Dicke von fünf Millimetern und einer Höhe von vier Zentimetern untersucht. Dabei wurde ein einzelner Wurm mittels Videoanalyse erfasst.Die aus der Videoanalyse gewonnene durchschnittliche Schwimmfrequenz in einem fünf Millimeter dicken Wurm betrug etwa 2,5 Hertz. Ebenso ergab die Erfassung eines einzelnen Wurms mithilfe der Echtzeit-Datenerfassungsmethode und eines digitalen Oszilloskops eine Schwimmfrequenz von etwa 2,7 Hertz. Dieses Verfahren kann für viele Würmer wiederholt werden.Eine detaillierte Untersuchung frei schwimmender Würmer ergab eine durchschnittliche Schwimmfrequenz von 2,37 Hertz in einem fünf Millimeter breiten Vete. Wie erwartet, ist die Schwimmfrequenz höher als die eines kriechenden Wurms. Mithilfe dieser Beugungsmethode wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Schwimmfrequenz einer auf einem Mikroskoppräparat eingeschränkten Sea Elegance dem zuvor veröffentlichten Wert von zwei Hertz entspricht.Nach dem Video. Die in diesem Video demonstrierte Datenaufbereitung und Modellierung von Beugungsmustern ermöglicht die Modellierung von Schwimm-Beugungsmustern. Mithilfe von Wurmbildern, die mit einem herkömmlichen Mikroskop gewonnen wurden, werden die modellierten Beugungsmuster verwendet, um einen Schwimmzyklus von C. elegans zu simulieren.Ein erfolgreiche Modellierung zeichnet sich durch physikalisch realistische Schwimmabläufe aus, die mit den Schwimmfrequenzen übereinstimmen. Der Wurm sollte am Ende eines Schwimmzyklus dieselbe Form aufweisen wie zu Beginn des Zyklus. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie für jeden Wurm in weniger als einer Minute durchgeführt werden, wobei die schnelle Fotodiät verwendet und die Schwimmzyklen auf dem Computerbildschirm beobachtet werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie frei schwimmende Nematoden beurteilt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

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Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion einschließlich Kraft-Schätzungen

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