移植筋前駆細胞を標的とする分子イメージング

この手順の全体的な目的は、レポーター遺伝子アプローチと生物発光イメージングを使用して、筋芽細胞移植の成功を非侵襲的に評価することです。これは、まず、CMVプロモーターの制御下でf Luke、MRFP、およびSR three 90 tkを発現するtri融合報告遺伝子を不死化C two C 12筋芽細胞株に導入することによって達成されます。2番目のステップは、ポーター遺伝子を発現する筋芽細胞の数を定量化することです。

本研究では、蛍光顕微鏡上でMRFP発現細胞をカウントすることにより、トランスフェクション効率を算出します。次に、15マイクロリットル以下の体積の5つの人工細胞を、ジストロフィーMDXマウスの後肢に筋肉内に移植する。UNTトランスフェクションされた細胞をコントロールとして対側後肢に移植し、ベースラインスキャンを行います。

最終工程は、腹腔内投与を行い、ルークが報告した遺伝子基質ルシファーを約20分間の取り込み期間後に注入し、移植された細胞の画像を取得するために第2の生物発光スキャンを行うことである。最終的に、ルシファーの取り込みは、報告遺伝子を発現しない対照細胞では検出可能な生物発光を示さないf Luke発現細胞に特異的に観察されます。この方法は、移植後の細胞の移動や移植後の細胞生存など、軽度の損失移転技術の分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。

この技術の意味は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋肉疾患の治療にまで及びます。なぜなら、移植後、移植後、生着領域を経時的に評価し、治療の成功または失敗を評価することができます。手順を実証するのは、大学院生のケリー腸peと、私たちの研究室の研究技術者であるレベッカ・マクグです、申し訳ありませんが、この細胞株の標準的な手順に従って、10%のウシ胎児血清を含む高グルコースdcos修飾ワシ培地でC 2つのC 12筋芽細胞を培養します。細胞が80%以上コンフルエントになることは、筋細胞の個体数を枯渇させるため、許可しないでください。

トランスフェクション用の細胞を最初に調製するには、HBSSリンス細胞層をトリプシンで短時間覆って、ストックフラスコから細胞を回収します。次に、トリプシンを迅速に吸引し、フラスコを組織培養インキュベーターに5分間置きます。インキュベーション中に、それぞれ9ミリリットルの培地を含む2つのT75フラスコを準備します。

インキュベーション時間が完了したら、フラスコに10ミリリットルの培地を加え、フラスコの底で培地を4〜5回すすぎ、すべての細胞が確実に収集されるようにします。次に、各T75フラスコに、ストックT75フラスコの細胞懸濁液の10分の1を播種します。この手順を初めて試みるときは、MTTアッセイを実施して、細胞の生存と分化に対する細胞標識の影響、および移植前に人工筋芽細胞の生存率を評価します。

細胞が50%のコンフルエンスに達したら、メーカーの指示に従って、Lipofectamine 2000を使用して、36マイクログラムのCMV Tri融合レポーター遺伝子を含む1つのT 75フラスコを4.5ミリリットルの最適容量にトランスフェクションします。さらに、リポ2000のみを使用し、DNAをネガティブコントロールとして最適にしない第2のT 75フラスコの模擬トランスフェクションを実施する。翌日、細胞を摂氏37度で少なくとも20時間トランスフェクションし、トランスフェクション培地を吸引し、倒立蛍光顕微鏡を使用して適切な量の培地と交換します。

明視野と赤色の両方の蛍光画像を撮影して、トランスフェクション効率を計算します。トランスフェクションされた筋芽細胞をトリプシンで回収し、4ミリリットルの完全培地で細胞を懸濁させた後、ヘモサイトメーターを使用して細胞数をカウントします。細胞の100、000の検出可能なLucifer配列を生じるべきである約10%のtransfection効率の生殖不能な1.5ミリリットルのマイクロ管に6つの細胞にピペット10を分ける移植の後で細胞を表現する、最終的な注入容積は15マイクロリットルであるべきである。

チューブ内の容量がこれより大きい場合は、マイクロチューブを2000RPMで1分間遠心分離し、仰臥位をアセートしてから、最大15マイクロリットルの成長量で曲げます。FBSが不足している中程度 2%イソフッ素を使用してマウスに麻酔を誘発した後、麻酔維持のために1.5%イソフッ素に切り替えます。処置中は、マウスを腹臥位に置き、背側後肢の部分から毛を抜き

C 2 つの C 12 筋芽細胞が十分に懸濁されていることを確認してから、細胞懸濁液をインスリン注射器にロードします。細胞を胃筋の外側頭部に30度の角度で直接注入します。トランスフェクションされた筋芽球を右後肢に注入した後、反対側の後肢にUNTトランスフェクションされた筋芽球で手順を繰り返します。

ベースライン生物発光スキャンを実行します。1人でマウスを光学スキャナーのステージにすばやく移し、マウスを腹臥位に置きます。2人目の人が同時に麻酔ラインをつなぎ、マウスが麻酔をかけられたままであることを確認します。

後肢をそっと伸ばし、医療用テープを使用して手足を所定の位置に保持し、注射の両方の領域が見えるようにします。チャンバーを閉じ、スキャナーの内部に光が入らないようにすると、検出されるバックグラウンド信号が増加します。スキャナーは、バイオルミネッセンスイメージングの製造元の指示書に含まれるパラメーターに設定する必要があります。

摘み取られた注入領域の周囲に関心領域を描画し、スキャンを開始して、マウスが麻酔されている間にベースライン画像を取得します。腹腔内。ホタルルシフェラーゼ基質ルシファーのキログラムあたり150ミリグラムを注入します。マウスを清潔なケージに入れ、麻酔から回復させます。

次のスキャンのためにマウスを準備する前に、15分間の取り込み時間を確保します。15分間の視聴期間の後。マウスに麻酔をかけ、以前と同様にスキャナーに移します。

バックグラウンドスキャンと同じ方法で、発光スキャンで2回目を実行します。合計20分間の取り込み時間で最大の信号強度が得られるはずですが、必要に応じてその後のスキャンを実行することもできます。この回路図は、CMV Tri Fusion レポーターの構造を示しています。

左のパネルは、融合レポータープラスミドをトランスフェクトしたC 2つのC 12筋芽細胞の明視野像を示し、右のパネルは、ここで見られる蛍光画像と同じ領域を示しています。筋芽細胞が注入された摘み取られた後肢領域を囲むように、関心領域が描かれます。バックグラウンドスキャンでは生物発光は検出されません。

ルシフェリアンの注射後23分で、筋芽細胞を発現するルシフェラーゼが注入された右後肢から明確な信号が検出されます。見られるように、切除されていない筋芽球を注入した反対側の後肢には生物発光は検出されません。ここでは、ホタルルシフェラーゼ抗体を用いた免疫組織化学により、トランスフェクションされたC two C 12細胞の筋肉内移植が確認されます。

この手順を試行する際には、無菌組織培養技術とその開発後の適切な動物取り扱い方法を使用することを忘れないでください。この技術は、筋肉疾患の分野の研究者が、疾患の前臨床小動物モデルで細胞療法の有効性を現在探求する道を開きました。その後、臨床現場での患者さんのこのビデオを見た後、細胞を移植する方法や、バイオルミネッセンスイメージングを使用して人工的に移植された筋芽細胞を非侵襲的に局在させる方法についてよく理解できるはずです。