Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von Xenopus Nerv-Muskel-Co-Kulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Primärkulturen von synaptisch gekoppelten Spinalneuronen und Muskelzellen aus Xenopus-Embryonen zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Brut in Xenopus induziert wird, indem sowohl männliche als auch weibliche Frösche mit humanem Chorionsäure in Atropin injiziert und befruchtete Eier gesammelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Geleehülle, das Fett und die Membranen von Embryonen im Stadium 22 zu entfernen.

Als nächstes werden Spinalneuronen und Muskeln aus den Embryonen isoliert und die Haut entfernt und verworfen. Der letzte Schritt besteht darin, die isolierten Zellen in Kulturschalen zu füllen und die Bildung funktioneller neuromuskulärer Verbindungen zu ermöglichen. Letztendlich können funktionelle synaptische Verbindungen mit simultanen gepaarten Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen und Muskelzellen in Kultur nachgewiesen werden.

Das Schöne an dieser Technik ist, dass sie eine leicht zugängliche synaptische Vorbereitung für Wirbeltiere liefert. Es kann verwendet werden, um die Freisetzung von Neurotransmittern mit postsynaptischen elektrophysiologischen Aufzeichnungen zu überwachen und gleichzeitig das Auftreten präsynaptischer Ionen zu messen. Darüber hinaus sind die Methoden klar und unkompliziert und erfordern keine spezielle Ausrüstung außer einem Präpariermikroskop, so dass die Kulturen dann bei Raumtemperatur in einem einfachen Kulturmedium gelagert werden können.

Dieses Präparat kann nützlich sein, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der synaptischen Physiologie zu beantworten, einschließlich der Frage, wie präsynaptische, biochemische und biophysikalische Ereignisse mit der Freisetzung von Neurotransmittern gekoppelt sind. Darüber hinaus ist es auch nützlich für die Untersuchung der Neuromodulationssynaptogenese und der synaptischen Plastizität Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die erforderlichen Lösungen gemäß dem beigefügten Manuskript vor. Stelle dann mindestens zwei Mikrodissektionswerkzeuge her, indem du eine Minuchinnadel an das Ende einer Glaspastierpipette klebst.

Lassen Sie mit Sano-Acrylkleber das scharfe Ende des Stifts etwa 0,5 Zentimeter über das Ende der Pipette hinausragen. Zwei Tage vor der Vorbereitung der Kulturen ist ein zuchtbereites XUS-Paar zu identifizieren, indem man eine markante rötliche Krallen-Aika auf dem Weibchen und eine dunkle Pigmentierung auf der ebenen Oberfläche der Vorderpfoten des Männchens beobachtet. Als nächstes netzen Sie jeden Strahl ein und halten ihn mit der Bauchseite nach unten in ein Waschbecken mit dem Netz, damit er entweichen kann.

Injizieren Sie einen Milliliter HCG durch das Netz und subkutan in einen der dorsalen Lymphsäcke, um sicherzustellen, dass die Tiere die neu gelegten und befruchteten Eier nicht zertrampeln. Installieren Sie einen abgeschirmten Boden mit einer Maschenweite von einem halben Zoll, der ein bis zwei Zoll am Boden des Tanks angebracht ist. Setzen Sie dann das Brutpaar zusammen in einen abgedeckten 10-Gallonen-Tank mit Wasser.

Lassen Sie die Frösche 12 bis 48 Stunden ungestört, bis befruchtete Eier auf dem Boden unter dem Sieb zu sehen sind. Nehmen Sie dann die Tiere aus dem Becken, lassen Sie die Eier aber mindestens 24 Stunden länger ungestört. Dieses Froschpaar kann nach sechs Wochen nachgezüchtet werden.

Lösen Sie dann die Embryonen vom Boden des Tanks und geben Sie sie in vier oder fünf 60 x 15 Millimeter große Kulturschalen mit 10 % Kochsalzlösung. Sortieren Sie die Embryonen nach Stadien nach dem Schema der neuen Coupe- und Faber-Embryonen, die glatt aussehen und eine helle, braune und weiße Modellierung aufweisen, wie sie auf der linken Seite ideal sind. Auf der anderen Seite sind Embryonen mit großen schwarzen oder weißen Flecken wie die auf der rechten Seite im Allgemeinen ungesund und unbrauchbar.

In einer Laminar-Flow-Haube werden 360 x 15 Millimeter große sterile Kulturschalen mit 10 % Kochsalzlösung und eine mit CMF etwa zur Hälfte beschriftet und befüllt. Mit einer sterilen Glaspastierpipette fünf bis 10 Embryonen im Stadium 22 bis 24 in eine der Schalen mit 10% Kochsalzlösung mit der Acht eines Stereozoom-Präpariermikroskops in der Haube übertragen, den Geleemantel und die Membran von jedem Embryo mit zwei sterilen Pinzettenpaaren entfernen. Waschen Sie die nackten Embryonen, indem Sie sie nacheinander durch die restlichen zwei Schalen mit 10%iger Kochsalzlösung und schließlich in die Schale mit CMF geben.

Halten Sie dann jeden Embryo sanft, aber fest mit einer Pinzette fest und verwenden Sie das Mikrodissektionswerkzeug, um das Neuralrohr und die zugehörigen Myotome zu entfernen, die sich am hintersten Teil des Tieres befinden. Machen Sie dazu drei Scheiben, eine an beiden Enden der Position des Neuralrohrs und eine dritte direkt ventral davon. Bewegen Sie dann jedes präparierte Neuralrohrmyotom an einen sauberen Teil der Schale, weg von den Dotterkörnchen und anderen Ablagerungen.

Nach etwa 15 Minuten in der MKG heben Sie die pigmentierte Haut mit der Pinzette von dem präparierten Gewebe frei und entsorgen die Haut. Nach weiteren 30 bis 60 Minuten bilden die Zellen einen Sandhaufen, wenn sie sich voneinander lösen. Bei diesem Verfahren wird ein 10-Milliliter-Röhrchen mit Nährmedium aufgetaut, anschließend mit 70 Mikrolitern ITS in 35 Nanogramm pro Milliliter versehen, mit BDNF markiert und die 35 Millimeter sterilen Kulturschalen etwa zur Hälfte mit L 15-Nährmedium gefüllt.

Verwenden Sie für jeden Embryo, den Sie präpariert haben, eine Kulturschale. Um eine Plattierungspipette herzustellen, halten Sie beide Enden einer Glaspastierpipette fest und legen Sie den konischen Teil über eine Flamme. Ziehe dann die Enden bis zu etwa 10 Zentimeter auseinander.

Brechen Sie anschließend das Ende ab, um eine Spitze von ca. 0,2 Millimetern zu erreichen. Saugen Sie anschließend mit der Plattierungspipette den Sandhaufen von einem Embryo auf. Achten Sie darauf, die entnommene Lösungsmenge zu minimieren.

Als nächstes stoßen Sie die Zellen auf den Boden einer Kulturschale aus und verteilen sie in mehreren Linien. Lassen Sie dann die Schalen mit den plattierten Zellen mindestens 15 Minuten lang ungestört, damit die Zellen Zeit haben, sich an der Schale festzusetzen. Nach 12 bis 24 Stunden in Kultur entwickeln plattierte Zellen unterschiedliche morphologische Eigenschaften.

So werden Muskelzellen spindelförmig und Spinalneuronen entwickeln lange Fortsätze. Der funktionelle synaptische Kontakt zwischen Urat, Krampfadern und Muskelzellen kann durch gleichzeitige gepaarte elektrophysiologische Aufzeichnungen bestätigt werden. Bereiten Sie dazu zwei Patch-Elektroden für die Aufzeichnung vor, eine für die präsynaptische Varikosität und eine für die Muskelzelle.

Füllen Sie dann die präsynaptische Elektrode mit Infoterin-haltiger Lösung und die postsynaptische Elektrode mit Kalium-Innenlösung. Ersetzen Sie danach das Medium in der Kulturschale durch NFR. Übertragen Sie es dann in ein inverses Mikroskop, das mit einer Gesichtskontrastoptik ausgestattet ist, pflastern Sie die präsynaptische Varikosität mit der Amphotericin enthaltenden Elektrode und die postsynaptische Muskelzelle mit der anderen Elektrode, um die Funktionalität der Synapse zu bestätigen, depolarisieren Sie die Varikosität mit einem Patch-Clamp-Verstärker und beobachten Sie die gleichzeitigen präsynaptischen und postsynaptischen Ströme.

Diese Abbildung zeigt eine fünffache Leistungsansicht von Zellen und Kultur unmittelbar nach dem Plattieren, und dies ist die gleiche Kultur bei 40-facher Leistung. Hier ist die neuromuskuläre Verbindung in Kultur, die die neuronale Soma-, präsynaptische, Krampfadern- und postsynaptische Muskelzelle zeigt. Hier sind die präsynaptischen und postsynaptischen Ströme dargestellt.

Als Reaktion auf die Anwendung von 10 Millivolt inkrementellen Spannungsschritten, die der präsynaptischen Varikosität von minus 30 Millivolt bis plus 40 Millivolt präsentiert wurden, betrug das Haltepotenzial für beide Zellen minus 70 Millivolt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden abgeschlossen werden. Lebensfähige Zellkulturen können dann innerhalb von nur 24 Stunden gewonnen und mehrere Tage lang aufbewahrt werden. Dieses Präparat wird bereits seit einigen Jahren verwendet und hilft, einige der grundlegenden Eigenschaften der neuromuskulären Übertragung zu erklären.

Wir hoffen, dass dieses Video die Fortsetzung der Entdeckungen ermöglicht, indem es den Ermittlern hilft, sich mit dieser leistungsstarken und einfachen Technik vertraut zu machen.