Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal
14. August 2013
Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, RNA aus chirurgischen Gewebeproben des menschlichen Netzhauts zu isolieren, um eine Transkriptomanalyse bei Netzhautablösung durchzuführen. Mithilfe des Journals werden die für die Sammlung der chirurgischen Probe benötigten Reagenzien und Materialien im Labor vorbereitet und ins Krankenhaus gesandt. Während des chirurgischen Eingriffs wird die Probe entnommen und anschließend ins Labor zurückgebracht.
Die RNA wird anschließend mithilfe eines standardisierten Cäsiumchlorid-Gradientenverfahrens gereinigt, und die Qualität der gereinigten RNA wird bewertet. Letztendlich zeigt die Analyse der mRNA-Expression, dass sowohl Entzündung als auch Photorezeptor-Degeneration an der Netzhautablösung beteiligt sind, was sich in Veränderungen der Expression von Schlüsselgenen widerspiegelt. Bei diesen durch transkriptomische Analyse identifizierten Prozessen liegt der Hauptvorteil der Methode gegenüber bestehenden ORNA-Reinigungsverfahren wie GTIN-Chlor aus der Extraktion, auch bekannt als OLE, darin, dass die resultierende ORNA nicht mit DNA kontaminiert ist.
Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auf Therapien bei Netzhautablösung, da sie technische Möglichkeiten zur Entwicklung neuartiger adjuvanter Therapien bietet. Für jede zu sammelnde Probe verwenden Sie eine RNAs-freie Pipette, um ein steriles Rundbodentestgefäß aus Polyethylen mit fünf Milliliter Inhalt mit 2,4 Milliliter einer sechs Molaren, RNAs-freien Guaninchloridlösung zu füllen. Füllen Sie den oberen Bereich der Röhrchen mit Argongas.
Danach die Kappe schnell fest aufdrücken, um eine dichte Versiegelung zu gewährleisten. Dies verhindert die Oxidation von Guaninchlorid während mehrerer Jahre der Lagerung im chirurgischen Schrank. Anschließend jede der Fünf-Milliliter-Röhrchen in ein 50-Milliliter-steriles Polypropylen-Röhrchen mit kegelförmigem Boden geben.
Nachdem das Gewebe hinzugefügt und die Kappe festgeschraubt wurde, die 50-Milliliter-Röhrchen in einen Polystyrol-Rack stellen. Anschließend den Rack sowie vorbereitete Umschläge zusammen mit den ausgefüllten Versandformularen in einen Karton im Krankenhaus geben. Den Karton aus dem chirurgischen Schrank in den Operationssaal bringen.
Während der Operation geben Sie die Netzhautprobe in ein Röhrchen, das mit Kochsalzlösung gefüllt ist. Verschließen Sie das Röhrchen fest. Mischen Sie das Röhr游戏副本 kurz um.
Stellen Sie danach das Gefäß auf den Blutgefäß-Rocker für 10 Minuten. Füllen Sie das beigefügte Probenformular mit der Patientenidentifikation, dem Operationsdatum und allen weiteren Anmerkungen aus. Anschließend tragen Sie die Identifikationsnummer auf das entsprechende nummerierte 50 Milliliter-Gefäß ein.
Legen Sie dann das Fünf-Milliliter-Gefäß mit der chirurgischen Probe in das 50-Milliliter-Gefäß. Ersetzen Sie das Papiertuch und verschließen Sie das Gefäß. Legen Sie anschließend das 50-Milliliter-Gefäß und das Probeneingabeformular in den entsprechenden gepolsterten Umschlag und verschließen Sie diesen.
Wenn die Probe im Labor eingetroffen ist, wird das Probenmaterial in seinem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit einem Polytron™-Homogenisator auf höchster Stufe während einer Minute homogenisiert, wobei das Röhrchen gleichzeitig auf und ab bewegt wird. Nach der Homogenisierung zur Extraktion der Polysaccharide 270 Mikroliter zweimolarer Kaliumacetat zugeben und das Röhrchen horizontal auf einen Schüttler stellen. Zehn Minuten lang kräftig schütteln und anschließend zehn Minuten bei 6.500 ×g und 20 Grad Celsius zentrifugieren.
Nach dem Zentrifugieren vorsichtig mit einer Pipette die lösliche Fraktion abpipettieren, ohne den Pellet zu stören. Das Überstandsvolumen in ein steriles 14-Milliliter-RNase-freies Gefäß überführen. Danach 5,3 Milliliter 1 %iger Lauryl-Sarkosin in 100 Millimolar Tris und 3,2 Gramm Cäsiumchlorid zum Überstand geben.
Das Sarkosin löst die Membran auf, und das Cäsiumchlorid wird zur Erzeugung eines Gradienten verwendet. Mischen Sie das Gefäß durch Vortexen für eine Minute. Geben Sie 1,8 Milliliter Cäsiumchlorid-EDTA in ein steriles 11-Milliliter-Polymerzentrifugenröhrchen.
Danach die RNA-Lösung mit einer sterilen 10-Milliliter-Pasteurpipette aufrein auf die Cäsiumchlorid-EDTA-Lösung auftragen, indem man sie langsam an der Innenwand des Röhrchens herablaufen lässt. Die Röhrchen in eine Zentrifuge geben. Wenn nötig, zur Auswuchtung ein zweites Röhrchen mit den Puffern ohne Retina verwenden und 24 Stunden bei 225.000 × g und 20 °C zentrifugieren.
Am nächsten Tag. Nach dem Zentrifugieren hat sich eine Lipidschicht an der Oberseite des Röhrchens gebildet. Die DNA befindet sich in der Mitte, und die RNA hat sich am Boden des Röhrchens abgesetzt.
Entfernen Sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette vorsichtig die obere Lipidschicht und verwerfen Sie diese mit einer zweiten sterilen Pasteur-Pipette. Reduzieren Sie die Lösung schrittweise, bis die viskose DNA angesaugt wird. Verwerfen Sie die Lösung und die DNA.
Danach mit einer dritten sterilen Pasteurpipette die verbleibende Lösung entfernen und verwerfen, wobei darauf geachtet wird, den RNA-Pellet nicht aufzuwirbeln. Anschließend mit einem flammenssterilisierten Skalpell den Tubus wie hier gezeigt anschneiden und den oberen Teil entsorgen.
Legen Sie den verbleibenden Teil verkehrt herum auf sterile Mullkompressen. Drehen Sie das Röhrchen um und spülen Sie es vorsichtig mit 160 Mikrolitern Guanidinhydrochlorid mit einer Pipette aus. Lassen Sie das Pellet 10 Minuten trocknen.
Einmal, wenn das Pellet trocken ist, in 150 Mikroliter Tris, E-D-T-A-S-D-S resuspendieren. Fügen Sie anschließend 150 Mikroliter Tris, EDTA und 30 Mikroliter dreimolarer Natriumacetat hinzu und wirbeln Sie es, um die RNA auszufällen. Geben Sie 900 Mikroliter eiskaltes, 100 %iges Ethanol hinzu.
Schwenken Sie das Gefäß und stellen Sie es 30 Minuten lang auf schmelzendes Eis. Zentrifugieren Sie danach das Gefäß 30 Minuten bei 18.000 G und vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren kann ein kleines weißes Pellet sichtbar sein, muss es aber nicht.
Unabhängig davon, ob das Pellet sichtbar ist, das Überstandsvolumen vorsichtig abpipettieren und entsorgen. Anschließend zur Entfernung überschüssiger Salze 500 µL 70 %igen Ethanol bei Raumtemperatur hinzufügen und kurz verwirbeln. Danach die Röhrchen 20 Minuten bei 18.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Nach Wiederholung der 70 %igen Ethanol-Waschung und erneutem Zentrifugieren das verbleibende Ethanol mit einer P-200-Pipette entfernen.
Lassen Sie das Pellet 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Dey getränktem Wasser und mischen Sie es durch kräftiges Vortexen für zwei Minuten. Anschließend stellen Sie die Probe 15 Minuten lang in ein Wasserbad mit 45 Grad Celsius.
Vollständig die RNA resuspendieren. Abschließend die Konzentration der RNA durch Messung der Absorption bei 260 Nanometern bestimmen und die RNA gemäß dem Protokoll durch Gelelektrophorese analysieren. In dem begleitenden Dokument wurde zur Untersuchung des Transkriptoms der Netzhautablösung das Journal-Verfahren verwendet, um RNA aus der Netzhaut von 18 Patienten mit Netzhautablösung und 18 altersangepassten Kontrollen, die aus postmortalen Netzhäuten hergestellt wurden, zu isolieren und zu analysieren.
Die RNA wurde anschließend gereinigt und mittels Gelelektrophorese und rettino Basenanalyse analysiert, wie in diesem Bericht beschrieben. Dargestellt sind hier Radardiagramme, die die Expression des monocytenchemotaktischen Gens MCP-1 (CCL2) widerspiegeln. Der rechte Teil der Abbildung, gekennzeichnet mit RD, entspricht der RNA von Patienten mit Netzhautablösung, während der linke Teil, gekennzeichnet mit N, die RNA der Kontrollpersonen darstellt, wie hier zu sehen ist. Die Netzhautablösung führt zur Hochregulation von CCL2, was durch die hohen C-Werte in den meisten RD-Proben rechts im Vergleich zu den Kontrollproben links angezeigt wird.
Diese Zunahme weist auf eine Entzündung bei Patienten mit Netzhautablösung hin, wie hier zu sehen ist. Die Expression des Stäbchen-Photorezeptor-Transducin-Gens GNAT1 war im Gegensatz zu CCL2 vermindert, die Werte sind für die RD-Proben rechts niedrig, eine Abnahme der Expression des kurzwelligen Konen-Opsins OPN1SW sowie des Homeogenes CRX wurde ebenfalls beobachtet, was auf eine Degeneration der Photorezeptoren sowohl der Stäbchen als auch der Zapfen bei Patienten mit Netzhautablösung hindeutet. Diese Methode kann Einblicke in die Veränderungen der Genexpression nach einer Netzhautablösung liefern. Sie kann zudem auf andere Netzhauterkrankungen in Tiermodellen, wie beispielsweise erbliche Netzhautdegenerationen, angewendet werden.
Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, könnten Schwierigkeiten haben, da sie Kenntnisse in Bezug auf Nukleinsäuren erfordert. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung von RNA nach der Zertifizierung schwierig ist.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Aufreinigung von RNA aus chirurgischen Proben des menschlichen Netzhautgewebes, um das Transkriptom bei Fällen einer Netzhautablösung zu analysieren. Ein standardisiertes Verfahren mit Cäsiumchlorid-Gradient wird verwendet, um die RNA-Qualität für weitere Analysen sicherzustellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Retinale Biologie
- Transkriptomik
Hintergrund
- Die Netzhautablösung kann zu erheblichen Sehverlusten führen.
- Das Verständnis von Genexpressionsänderungen ist entscheidend für die Entwicklung therapeutischer Strategien.
- Die RNA-Qualität ist entscheidend für eine genaue transkriptomische Analyse.
- Bestehende Methoden zur RNA-Reinigung können zu Kontaminationen führen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur RNA-Reinigung aus Netzhautproben.
- Analyse der mRNA-Expression im Zusammenhang mit Netzhautablösung.
- Beurteilung der Beteiligung von Entzündungen und Photorezeptor-Degeneration.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Netzhautproben während der Retinektomie.
- Vorbereitung der Reagenzien und Materialien für die RNA-Extraktion.
- Standardisiertes Cäsiumchlorid-Gradientenverfahren zur RNA-Reinigung.
- Beurteilung der RNA-Qualität für die Microarray-Analyse.
Hauptergebnisse
- Identifizierung wichtiger Genexpressionsänderungen im Zusammenhang mit Netzhautablösung.
- Nachweis von Entzündungen und Photorezeptor-Degeneration in der transkriptomischen Analyse.
- Nachweis, dass die neue Methode eine DNA-Kontamination verhindert.
- Verbesserte RNA-Qualität, geeignet für die Microarray-Analyse.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte RNA-Reinigungsmethode ist wirksam für Netzhautproben.
- Die transkriptomische Analyse liefert Einblicke in die Mechanismen der Netzhautablösung.
- Zukünftige Studien können diese Methode für weitere Forschungen zu Netzhauterkrankungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Netzhautablösung löst gleichzeitige Entzündungen und den Verfall der Photorezeptoren aus und schafft so ein komplexes pathophysiologisches Umfeld, das die Entwicklung therapeutischer Ansätze erschwert. Die jouRNAl-Methode ermöglicht eine hochpräzise transkriptomische Profilierung von operativ entfernten menschlichen Netzhautproben und stellt damit eine skalierbare Quelle für krankheitsrelevantes Gewebe zur Zielstrukturvalidierung bereit. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem molekulare Signaturmuster mit klinischen Phänotypen verknüpft werden, und leitet Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Projekten in der Augenheilkunde-Pipeline an.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch gleichzeitige Detektion entzündlicher und degenerativer Signalwege in menschlichem Netzhautgewebe.
- Operativer Wert: Verwandelt verworfene chirurgische Proben in validierte biologische Systeme und verringert so die Abhängigkeit von Tierversuchen bei der frühen Zielstruktur-Bewertung.
- Predictive Value: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem menschlich stammende Expressionsdaten zu CCL2, GNAT1, OPN1SW und CRX als Biomarker des Fortschreitens der RD bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert DNA-freie RNA, die für Microarray- und RT-PCR-Analysen geeignet ist und somit die Assayspezifität für Genexpressionsnachweise sicherstellt.
- Operativer Wert: Ein standardisiertes Protokoll zur Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation gewährleistet Reproduzierbarkeit über Chargen und Standorte hinweg und ermöglicht skalierbare Screening-Kampagnen.
- Eignung für Assays: Die Qualität der gereinigten RNA wird durch Gelelektrophorese und Absorptionsmessung validiert und unterstützt somit zuverlässige Wirkstoffbewertungen in phänotypischen Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungen und präklinische Forschung, indem menschliche Netzhautpräparate zur Validierung von Befunden in Tiermodellen der erblichen Netzhautdegeneration verwendet werden.
- Biomarker-Korrelation: Identifiziert die Hochregulation von CCL2 und die Herunterregulation von Photorezeptor-Genen als übertragbare Signaturen für das therapeutische Monitoring.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Liefert mechanistische Einblicke in den Fortschritt der Netzhautdegeneration und unterstützt die biomarkerstratifizierte Planung klinischer Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die jouRNAl-Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Identifizierung bis zur präklinischen Validierung und ermöglicht eine Entschärfung von Risiken an menschlichem Gewebe vor der Lead-Optimierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Entzündungs- und Degenerationswegen mittels transkriptomischer Analyse menschlicher Netzhautproben.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative RNA-Daten, die für die hochdurchsatzfähige Genexpressions-Profilierung geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt messbare Endpunkte (z. B. Hochregulierung von CCL2, Herunterregulierung von GNAT1), die einen vergleichenden Abgleich zwischen verschiedenen Krankheitszuständen sowie eine Priorisierung von Zielstrukturen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Daten aus menschlichen Proben mit der präklinischen Forschung, indem vergleichende Analysen in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur RNA-Isolierung aus operativ gewonnenen Geweben, die auf verschiedene Netzhauterkrankungen und therapeutische Bereiche anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Uneindeutigkeiten durch Transkriptomik an menschlichem Gewebe direkt reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch Cäsiumchlorid-Reinigung sicher und verringert so die Variabilität zwischen Chargen in multizentrischen Studien.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem molekulare Belege aus menschlichem Gewebe bereitgestellt werden, wodurch das biologische Risiko in fortgeschrittenen Phasen ophthalmologischer Programme reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf gleichzeitig auftretenden Entzündungs- und Degenerationsmustern in Proben von Patienten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Nukleinsäuren und Techniken der Dichtegradientenzentrifugation.
- Hängt von dem Zugang zu Cäsiumchlorid, Ultrazentrifugen und einer RNase-freien Laborinfrastruktur ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen chirurgischen, pathologischen und molekularbiologischen Einheiten zur Probenverfolgung.
- Die Anpassung an andere Gewebetypen kann eine Optimierung der Homogenisierungs- und Lysisschritte erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die RNA-Ausbeute hängt von der zeitnahen Probenübertragung und der Vermeidung von RNase-Exposition während der chirurgischen Entnahme ab.
