Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Aufreinigung von RNA aus humanen retinalen chirurgischen Proben für die Transkriptomanalyse bei Netzhautablösung. Zu diesem Zweck werden die Reagenzien und Materialien, die für die Entnahme der chirurgischen Probe benötigt werden, im Labor vorbereitet und an das Krankenhaus geschickt. Während des chirurgischen Eingriffs wird die Probe entnommen und an das Labor zurückgegeben.

Anschließend wird die RNA mit einem standardisierten Cäsiumchlorid-Gradientenverfahren aufgereinigt und die Qualität der gereinigten RNA bewertet. Letzten Endes. Die Analyse der mRNA-Expression zeigt, dass sowohl Entzündungen als auch Photorezeptordegenerationen an der Netzhautablösung beteiligt sind, was durch Veränderungen in der Expression von Schlüsselgenen angezeigt wird. Bei diesen Prozessen, die durch transkriptomische Analyse identifiziert werden, besteht der Hauptvorteil der Journal-Reinigung gegenüber bestehenden Orna-Reinigungen wie GTIN-Chlor aus der Extraktion, auch bekannt als Ole, darin, dass das Ergebnis der Orna nicht mit DNA kontaminiert ist.

Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapien der Netzhautablösung, da sie technische Mittel zur Entwicklung neuartiger adjuvanter Therapien bietet. Für jede zu entnehmende Probe wird mit einer RNA-freien Pipette ein fünf Milliliter steriles Polyethylen-Rundbodenröhrchen mit 2,4 Millilitern einer sechs molaren RNAs-freien Guineachloridlösung gefüllt. Verwenden Sie Argongas, um den oberen Teil der Röhrchen zu füllen.

Setzen Sie dann die Kappe schnell fest an, um sicherzustellen, dass sie dicht ist. Dadurch wird die Oxidation von Guinechlorid über mehrere Jahre der Lagerung im Operationsschrank verhindert. Legen Sie anschließend jedes der fünf Milliliter-Röhrchen in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden.

Legen Sie nach dem Hinzufügen von Taschentuch und dem Aufschrauben der Kappe die 50-Milliliter-Röhrchen in ein Styroporgestell. Legen Sie dann das Gestell und die vorbereiteten Umschläge zusammen mit den vorbereiteten Versandformularen in einen Karton im Krankenhaus. Bringen Sie den Karton aus dem OP-Schrank in den Operationssaal.

Legen Sie die Netzhautprobe während der Operation in ein Röhrchen, das mit Menge und Chloridlösung gefüllt ist. Verschließen Sie das Rohr fest. Die Tube kurz mischen.

Legen Sie dann den Schlauch für 10 Minuten auf die Blutröhrchenwippe. Füllen Sie das beigefügte Probenformular mit der Patientenidentifikation, dem Datum der Operation und allen zusätzlichen Bemerkungen aus. Schreiben Sie dann die Identifikationsnummer auf das entsprechende nummerierte 50-Milliliter-Röhrchen.

Legen Sie dann das Fünf-Milliliter-Röhrchen mit der chirurgischen Probe in das 50-Milliliter-Röhrchen. Setze das Papiertuch wieder auf und verschließe die Tube. Legen Sie dann das 50-Milliliter-Röhrchen und das Probenentnahmeformular in den entsprechenden gepolsterten Umschlag und verschließen Sie diesen.

Sobald die Probe im Labor eingegangen ist, homogenisieren Sie die Probe in ihrem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit einem Poly Tron TM Homogenisator eine Minute lang auf der maximalen Einstellung, während Sie das Röhrchen auf und ab bewegen. Sobald die Probe homogenisiert wurde, fügen Sie zur Extraktion der Polysaccharide 270 Mikroliter zweimolares Kaliumacetat hinzu und stellen Sie das Röhrchen in horizontaler Position auf einen Schüttler. 10 Minuten kräftig schütteln, dann 10 Minuten bei 6.500 g bei 20 Grad Celsius zentrifugieren.

Nach dem Schleudern die lösliche Fraktion mit einer Pipette vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören. Übertragen Sie den Überstand in ein steriles 14-Milliliter-RNA-freies Röhrchen. Fügen Sie neben dem Überstand 5,3 Milliliter 1% und Lorbeersarcosin in 100, Millimolar Tri und 3,2 Gramm Cäsiumchlorid hinzu.

Das Sarkosin löst die Membran auf und das Cäsiumchlorid wird verwendet, um einen Gradienten zu erzeugen. Mischen Sie die Tube, indem Sie sie eine Minute lang vortexen. Geben Sie 1,8 Milliliter Cäsiumchlorid EDTA in ein steriles 11-Milliliter-Polymerzentrifugenröhrchen.

Schichten Sie dann mit einer sterilen 10-Milliliter-Pastorpipette die RNA-Lösung auf Cäsiumchlorid-EDTA-Lösung, indem Sie sie an der Innenseite des Röhrchens herunterlaufen lassen. Lege die Röhrchen in eine Zentrifuge. Verwenden Sie bei Bedarf ein zweites Röhrchen mit den Puffern ohne Netzhaut als Waage und drehen Sie es 24 Stunden lang bei 225.000 G bei 20 Grad Celsius.

Am nächsten Tag. Nach dem Schleudern hat sich am oberen Rand des Röhrchens eine Lipidschicht gebildet. Die DNA befindet sich in der Mitte und die RNA wird am Boden des Röhrchens pelletiert.

Verwenden Sie eine sterile Pasterpipette, um die obere Lipidschicht vorsichtig zu entfernen und mit einer zweiten sterilen Pasterpipette zu entsorgen. Die Lösung nach und nach entfernen, bis die viskose DNA aspiriert ist. Entsorge die Lösung und die DNA.

Entfernen Sie dann mit einer dritten sterilen Pastorpipette die restliche Lösung und entsorgen Sie sie. Achten Sie darauf, das RNA-Pellet nicht zu stören. Schneiden Sie nun mit einem flammsterilisierten Skalpell das Röhrchen wie hier gezeigt ab und entsorgen Sie den oberen Teil.

Legen Sie den restlichen Teil kopfüber auf sterile Gaze. Drehen Sie das Röhrchen um und spülen Sie es mit einer Pipette vorsichtig mit 160 Mikrolitern Guinechlorid aus. Lassen Sie das Pellet 10 Minuten trocknen.

Sobald das Pellet trocken ist, wird es in 150 Mikrolitern Tris, E-D-T-A-S-D-S, resuspendiert. Fügen Sie als nächstes 150 Mikroliter Tris, EDTA und 30 Mikroliter dreimolares Natriumacetat hinzu und wirbeln Sie dann vortexen, um die RNA auszufällen. Fügen Sie 900 Mikroliter eiskaltes, 100%iges Ethanol hinzu.

Wirbeln Sie das Rohr vor und legen Sie es 30 Minuten lang auf schmelzendes Eis. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten bei 18.000 G bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern kann ein winziges weißes Kügelchen sichtbar sein oder auch nicht.

Unabhängig davon, ob das Pellet zu sehen ist oder nicht, saugen Sie den Überstand vorsichtig an und entsorgen Sie ihn. Um überschüssiges Salz zu entfernen, fügen Sie dann 500 Mikroliter Raumtemperatur, 70% Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Röhrenzentrifuge ein, die Röhre für 20 Minuten bei 18.000 G bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das Waschen und Schleudern mit 70 % Ethanol wiederholt haben, verwenden Sie eine P 200-Pipette, um restliches Ethanol zu entfernen.

Lassen Sie das Pellet 10 Minuten an der Luft trocknen. Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern aufbereitetem Wasser und mischen Sie es kräftig, indem Sie es zwei Minuten lang vortexen. Legen Sie die Probe dann für 15 Minuten in ein 45 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Um die RNA vollständig zu resuspendieren. Bestimmen Sie abschließend die Konzentration der RNA durch Absorption bei 260 Nanometern und analysieren Sie die RNA durch Gelelektrophorese gemäß dem Protokoll. Im Begleitdokument Zur Untersuchung des Transkriptoms der Netzhautablösung wurde das Journalverfahren verwendet, um retinale RNA von 18 Patienten mit Netzhautablösung und 18 altersangepassten Kontrollen, die mit postmortalen Netzhäuten präpariert wurden, zu gewinnen und zu analysieren.

Die RNA wurde anschließend unter Verwendung von Gelelektrophorese und Rettino-Base gereinigt und analysiert, wie in diesem Bericht beschrieben. Hier sind Radardiagramme gezeigt, die die Expression des Monozyten chemotaktisch M CP ein Gen CCL zwei darstellen. Der rechte Teil der Abbildung mit der Bezeichnung RD entspricht der RNA der Patienten mit Netzhautablösung, während der linke Teil mit der Bezeichnung N RNA der Kontrollen enthält, wie hier zu sehen ist. Die Netzhautablösung führt zu einer Hochregulierung von CCL zwei, was sich an den hohen C-Werten in den meisten RD-Proben auf der rechten Seite im Vergleich zu denen der Kontrollen auf der linken Seite zeigt.

Dieser Anstieg deutet auf eine Entzündung bei den Patienten mit Netzhautablösung hin, wie hier zu sehen ist. Die Expression des Stäbchen-Photorezeptor-transduzierenden Gens GNAT eins war im Gegensatz zu CCL zwei verringert, die Werte sind niedrig für die RD-Proben auf der rechten Seite, eine Abnahme der Expression des Kurzwellen-Zapfens Opsin O PN eins SW, und das Homöo-Gen CRX wurde ebenfalls beobachtet, was auf eine Photorezeptordegeneration sowohl der Stäbchen als auch der Zapfen bei Patienten mit Netzhautablösung hindeutet. Es kann auch auf andere Netzhautpathologien in Tiermodellen angewendet werden, wie z. B. erbliche Netzhautdegenerationen.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, da sie Kenntnisse über Nukleinsäure erfordert. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig ist, die RNA nach der Zertifizierung