Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca ^{2 +} Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den lipophilen Farbstoff FM 1 43 in der Lebendzellbildgebung zu verwenden, um die genaue Kinetik der schlecht funktionierenden Toxinentfernung aus der Plasmamembran zu messen. Dazu wird das Toxin zunächst bei vier Grad Celsius vorgebunden. Der zweite Schritt besteht darin, die Schüssel auf den beheizten Mikroskoptisch zu bringen und eine Brennebene zu finden, in der Zellen sichtbar gemacht werden können.

Fügen Sie anschließend das entsprechende vorgewärmte Medium hinzu und beginnen Sie sofort mit der Bildgebung. Der letzte Schritt besteht darin, die intrazelluläre FM 1 43-Fluoreszenz zu analysieren und zu quantifizieren. Letztendlich kann dieser empfindliche Assay verwendet werden, um den Bedarf an Kalzium, Fingal, Myelin und anderen Faktoren für die Reparatur der Plasmamembran zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Laserwounding besteht darin, dass dieser SLL-Permeationsassay die synchronisierte Bildung von Plasmamembranläsionen ermöglicht, die nach dem Auslösen der Zellisierung sehr gleichmäßig groß sind. Die Live-Zeitraffer-Bildgebung des lipophilen Farbstoffeinstroms ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik der Wiederversiegelung der Plasmamembran auf empfindliche und sehr reproduzierbare Weise. Dieser Assay ist ideal für die Bestimmung der Wirkung verschiedener Wirkstoffe wie Calcium und rekombinanter Wirkstoffe auf die Plasmamembranreparatur, ohne die Variabilität, die mit anderen Methoden der Plasmamembranverletzung verbunden ist.

Um das Verfahren zur transkriptionellen Stilllegung von saurem Sphingomyelin oder einem SM-Samensamen zu beginnen, inkubieren Heela-Zellen in DMEM-Wachstumsmedien auf 35-Millimeter-Glasbodenschalen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator am folgenden Tag, mindestens eine Stunde vor der Zugabe des IRNA-Transfektionsgemisches, aspirieren Sie das Wachstumsmedium und ersetzen es durch zwei Milliliter DMEM-reduziertes Serummedium. Bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator und bereiten Sie vier Röhrchen für die SI-RNA-Oligo-Transfektionsmischung vor. Die angegebene Menge an Reagenz ist pro 35-Millimeter-Schale, die in die Röhrchen A und C transfiziert werden soll, fügen Sie 250 Mikroliter optimales reduziertes Serum und vier Mikroliter Lipektomie-RNAi max. in Röhrchen B hinzu.Fügen Sie 250 Mikroliter Optum-reduziertes Serum und acht Mikroliter oder 160 Pikosolen Kontrollen in Röhrchen D hinzu.Fügen Sie 250 Mikroliter optimal reduziertes Serum und acht Mikroliter oder 160 Pikosolen A-S-M-I-A hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Als nächstes kombinieren Sie die Röhrchen A und B, um den Transfektionskomplex für die Kontrolle S, die Irna und die Röhrchen C und D zu bilden.Für die A SMS irna inkubieren Sie die Reaktionen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten geben Sie jedes Transfektionsreaktionsgemisch langsam tropfenweise in das jeweilige 35-Millimeter-Glas. Die Bodenschalen werden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

24 Stunden nach der Transfektion wird das Medium vorsichtig abgesaugt und durch frisches DMEM-Wachstumsmedium ersetzt, um einen effizienten A SM-Knockdown zu erzielen. Die Schalen sollten vor der Live-Bildgebung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid etwa 31 Stunden lang für insgesamt 55 Stunden inkubiert werden. Die folgenden Reagenzien werden für die Lebendzellmikroskopie, rekombinante PO-bildende Toxin-Streptokokken-, Lysin-O- oder SLO-Lösung in einer Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter in kaltem PBS ohne Calcium und Magnesium benötigt.

Eine 25 Millimolare Stammlösung von FM 1 43 in DMSO-Lösung A, FM 1 43, verdünnt in kaltem DMEM mit Calcium auf eine Endkonzentration von vier Mikromolaren und Lösung B, FM 1 43, verdünnt in kaltem DMEM ohne Calcium und 10 Millimolar EGTA auf eine Endkonzentration von vier Mikromolaren vor der Lebendzellbildgebung. Ein Milliliter Aliquots von Lösung A und Lösung B werden in Mikrozentrifugenröhrchen auf 37 Grad Celsius erwärmt. Bewahren Sie DMEM mit Kalzium und kalziumfreiem DMEM auf Eis auf.

Beginnen Sie mit den Vorbereitungen für die Bildgebung lebender Zellen, indem Sie einen mittelgroßen, flachen Metallbehälter mit zerstoßenem Eis füllen. Drehen Sie es in einen großen Glasbehälter mit Eis und fügen Sie zusätzliches Eis hinzu, sodass nur die Unterseite des Metallbehälters freiliegt. Legen Sie ein nasses Papiertuch auf den freiliegenden Metallboden, um eine gleichmäßige Wärmeübertragung zu ermöglichen.

Legen Sie eine Kontrolle, eine behandelte 35-Millimeter-Glasbodenschale, auf das kalte, nasse Papiertuch, saugen Sie vorsichtig alle Medien ab und waschen Sie sie dreimal mit kaltem, kalziumfreiem DMEM nach dem letzten Waschgang, saugen Sie alle Medien in der Schale ab, um zellassoziiertes FM 1 43 in Zellen ohne SLO-Wunden in Gegenwart von Kalzium abzubilden. Geben Sie 180 Mikroliter kalte Lösung B auf den mittleren Glasdeckglas der 35-Millimeter-Glasbodenschale und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Die Bildgebung von lebenden Zellen erfolgt mit einer rotierenden Scheibe, einem konfokalen Mikroskopiesystem und der entsprechenden Bildgebungssoftware.

Das Mikroskop ist mit einer Klimakammer ausgestattet, um Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxidgehalt aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Schale auf den auf 37 Grad Celsius erhitzten Mikroskoptisch und setzen Sie den Deckel der Klimakammer mit einer numerischen Apertur von 40 x wieder auf. 1.3 Zielsetzung.

Finden Sie das Feld der Zellen, die für den Erfolg des Experiments abgebildet werden sollen. Ein automatisiertes Fokusmodul am Mikroskop zur Korrektur der thermischen Drift während der Bildgebung ist unerlässlich, sofern vorhanden. Schalten Sie Perfect Focus oder ein ähnliches Gerät ein, um die thermische Drift zu korrigieren.

Entfernen Sie nun den Deckel der Klimakammer und geben Sie einen Milliliter vorgewärmte Lösung vorsichtig an die Seite der 35-Millimeter-Schale. Bringen Sie die Abdeckung der Klimakammer wieder an. Die Einstellung der Parameter für die bildgebende Anregung von FM 1 43 erfolgt mit einer 488 Nanometer großen Laserlinie.

Durch die Verwendung eines dichroitischen Filters mit einem Bandpass von 488 Nanometern und Emissionsdiskriminierung wird durch die Verwendung eines 5 27 Emissionsfilters die Laserleistung und die Kameraempfindlichkeit eingestellt, um eine Bildbelichtung von 100 Millisekunden zu erzielen. Nehmen Sie Bilder vier Minuten lang mit einem Bild alle drei Sekunden auf. Das gleiche allgemeine Protokoll wird für die Live-Bildgebung von Zellen unter verschiedenen Versuchsbedingungen mit einigen Modifikationen, wie in dieser Tabelle angegeben, befolgt: Zum Nachweis von FM 1 43 in mit Kontroll-S irna behandelten Zellen ohne SLO-Verwundung in Abwesenheit von Calciumvorwärmung sollte Lösung B an der Seite der 35-Millimeter-Schale zugegeben werden.

Anstelle von Lösung A vor der Bildgebung zur Messung des Einstroms von FM 43 in mit Kontrollen siRNA-behandelte Zellen, die in Gegenwart von Kalzium mit SLO verwundet wurden, wird kalte Lösung B mit SLO auf das mittlere Glasdeckglas der 35-Millimeter-Schale gegeben und fünf Minuten lang auf Eis inkubiert. Geben Sie dann warme Lösung A in das Gericht. Das Überführen der Probe in den warmen Mikroskoptisch löst eine schlechte Transmembranbildung aus, um den Einstrom von FM 1 43 in mit SLO verwundete Kontrollzellen zu messen. In Abwesenheit von Kalzium wird die kalte Lösung B mit SLO auf das mittlere Glasdeckglas der 35-Millimeter-Schale gegeben und fünf Minuten lang auf Eis inkubiert.

Geben Sie dann warme Lösung B in das Gericht. Um die Rolle eines SM bei der Reparatur der Plasmamembran zu bestimmen, verwenden Sie ein mit SM irna behandelte Zellen für alle Bedingungen. Um schließlich die Rolle extrazellulärer rekombinanter Bingomyeline auf die Kinetik der Plasmamembranreparatur zu bestimmen, wird Bingomyelin entweder zu warmer Lösung A oder Lösung B hinzugefügt und dann den Zellen zugesetzt.

Bei der Bildgebung lebender Zellen in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter nach der Aufnahme von Filmen wird die intrazelluläre Fluoreszenzintensität von FM 1 43 gemessen. Zeichnen Sie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware einen interessierenden Bereich in der zytosolischen Region jeder Zelle im Feld und wenden Sie die Softwaretools an, um die mittlere Fluoreszenzintensität von FM 1 43 zu bestimmen. Wählen Sie in allen Frames des Videos die zu quantifizierende Probenaufnahme aus der Liste der Bildsequenzen auf der rechten Seite aus, doppelklicken Sie auf das Stempelwerkzeug, um das Setup aufzurufen. Dialogfeld ROI-Stempel.

Für die Intensitätsanalyse ist es am besten, einen Ellipsenstempel auszuwählen. Die Größe der Ellipse muss empirisch in Abhängigkeit von der Größe und Form der Zelle bestimmt werden. Für die meisten Gewebekulturzellen ist jedoch eine Ellipse von vier mal vier Mikrometern geeignet.

Es ist wichtig, für jede Bildsequenz, die während der gesamten Quantifizierung analysiert werden soll, den gleichen ROI zu verwenden. Verschieben Sie als Nächstes den Zeitschieber auf den letzten Zeitpunkt, um mit dem Stempelwerkzeug den Punkt mit maximaler Intensität in der Zelle zu finden. Markieren Sie den ROI jeder Zelle wie abgebildet.

Schieben Sie nun den Zeitschieber zurück auf den Nullzeitpunkt und stellen Sie sicher, dass der ROI für die Dauer der Akquisition innerhalb des gewählten Werts bleibt. Wählen Sie Messungen aus. Um mit der Quantifizierung zu beginnen, ist jetzt ein Dropdown-Menü für Messungen verfügbar. Wählen Sie in diesem Dropdown-Menü die Option Alle Zeitpunkte messen aus.

Klicken Sie erneut auf das Dropdown-Menü "Messungen" und wählen Sie "Messelement durchführen". Es erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie den Daten einen Namen geben können, indem Sie auswählen, okay, ein neues Element mit den Daten wird mit dem gewählten Namen angezeigt. Wiederholen Sie diese Sequenz für alle Erfassungen.

Wählen Sie für die Datenanalyse das gewünschte Datenelement aus der Liste auf der rechten Seite aus, wählen Sie die Registerkarte Analyse aus dem Datenfenster aus, um den Dropdown-Menüpunkt Analyse aufzurufen. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Analyse" den Menüpunkt "Analysieren" aus, und ein Dialogfeld wird angezeigt. Im Feld "Analyse bearbeiten" stehen sechs Einstellungen zur Verfügung.

Erster Satz beschränkt die Analyse zwei auf ROIs. Für das zweite Feld sollte der Mittelwert dieser Daten analysiert hervorgehoben werden. Im Feld Zusammengefasst nach sollte der Wert ausgewählt sein.

Schließlich sollte die Auswahl der R-Zeiten für RO und die Wahl des Namens für die Spalte ausgewählt werden. Nachdem Sie diese Werte festgelegt haben, klicken Sie auf OK, um die Daten in eine Tabelle mit Intensitätswerten pro Zeit umzuwandeln. Für jeden ROI können die Daten auch als Diagramm angezeigt werden. Durch Auswahl der Registerkarte Diagramm im Datenfenster können die Daten nun als tabulatorgetrennte Datei exportiert werden, um in einem grafischen statistischen Analyseprogramm nach Wahl des Benutzers verwendet zu werden. Repräsentative Ergebnisse aus den gezeigten Experimenten werden hier gezeigt.

Einstrom des lipophilen Farbstoffs FM 1 43 wurde vier Minuten lang mit einem Bild pro drei Sekunden abgebildet, und die intrazelluläre Fluoreszenz von FM 1 43 wurde quantifiziert und als facher Anstieg der Fluoreszenzintensität über die Zeit ausgedrückt. Diese erste Grafik zeigt, dass in Abwesenheit von Kalzium sowohl mit IRNA als auch mit A SMS IRNA behandelte Zellen durch SLO durchlässig waren, was darauf hindeutet, dass eine SM-Depletion die Empfindlichkeit gegenüber dem Toxin nicht beeinträchtigt. In jeder Bedingung wurden 18 bis 27 Zellen analysiert, und die Fehlerbalken entsprechen dem Mittelwert plus oder minus SEM.

Die in der nächsten Grafik gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass S-I-R-N-A in Gegenwart von Kalziumzellen, die kontrolliert behandelt wurden, in der Lage waren, ihre Plasmamembran wieder zu verschließen und den Farbstoffeinstrom zu stoppen, während Zellen, die mit einer SMS-Irna behandelt wurden, nicht wieder verschlossen wurden. Darüber hinaus ergänzt die exogene Zugabe niedriger Dosen von Sphingomyelin den Plasmamembrandefekt einer mit SMS irna behandelten Zellen. In jeder Bedingung wurden 18 bis 62 Zellen analysiert, und die Fehlerbalken entsprechen den mittleren plus oder minus SEM-ausgewählten Zeiträumen der analysierten Filme, die in diesen Bildern dargestellt sind.

Interessanterweise wurde eine vollständige Rettung der Fähigkeit einer SM-defizienten Zelle zur Wiederversiegelung nach Exposition gegenüber SLO mit niedrigen Konzentrationen von Flonase fünf und 7,5 Mikroeinheiten pro Milliliter beobachtet. Als die Enzymkonzentration, die dem Medium zugesetzt wurde, zunahm, kam es zu einem allmählichen Verlust der Rettung. Phänotyp-Zellen, die 10 Mikroeinheiten pro Milliliter ausgesetzt waren, blockierten nur teilweise.

Der Zustrom von FM 1 43. Nach der Exposition gegenüber SLO zeigten Zellen, die 50 Mikroeinheiten pro Milliliter ausgesetzt waren, ein starkes Farbstoffeinströmungsmuster, das einen vollständigen Wiederverschließungsdefekt widerspiegelte, ähnlich dem, der in SM-depletierten Zellen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die endozytäre Entfernung von SLO-Poren durch die an der Plasmamembran erzeugten Ceramidspiegel streng reguliert wird.

Durch fcom-Myelin über einem bestimmten Niveau läuft der Prozess nicht normal ab und die Zellen können die Läsionen nicht entfernen. Bemerkenswerterweise rettete die Zugabe von bakterieller s Flonase zu den Zellen perme durch SLO in Abwesenheit von Kalzium auch die Reparatur der Plasmamembran. 18 bis 31 Zellen wurden in jeder Bedingung analysiert, und die Fehlerbalken entsprechen dem mittleren Plus oder Minus SEM, wie er in Zellen beobachtet wird, die dem porenausführenden Toxin nur in Gegenwart von Kalzium ausgesetzt sind.

Niedrige Konzentrationen von Sphingomyelin waren wirksam bei der Blockierung des Einstroms von FM 1 43. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Flonase dem kalziumabhängigen Schritt der Plasmamembranreparatur nachgeschaltet ist. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, aktives Toxin zu haben, das zuvor getestet und titriert wurde, um die richtige Arbeitskonzentration zu bestimmen.

Dies ist wichtig, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen das SLO-Toxin inaktivieren kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Plasmamembran, die Reparierbarkeit von Zellen und die Kultur mit einem auf Live-Sensitive-Image-Bildgebung basierenden Assay testen, der eine präzise Quantifizierung der Kinetik der Wiederversiegelung auf sehr reproduzierbare Weise ermöglicht. Sie lernen auch, wie Sie Zellen während des bildgebenden Verfahrens bestimmte lösliche Wirkstoffe zusetzen und ihre Wirkung auf die Reparatur der Plasmamembran beurteilen.