Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Membranreparaturkapazität sowohl in den tierischen als auch in isolierten Zellen zu beurteilen. Isolierte Skelettmuskelfasern werden gesammelt und mit Medien umgeben, die den Farbstoff FM 1 43 enthalten. Ein UV-Laser wird dann verwendet, um einen Teil der Zellmembran zu bestrahlen und zu beschädigen, um den Eintritt des Farbstoffs in die Zelle zu ermöglichen.

Isolierte Zellen werden mit Plasma-DNA transfiziert, die GFP MG 53 exprimiert und an der Plasmamembran und im Zytosol der Zelle lokalisiert. Die Spitze einer Mikroelektrode wird dann in die C zwei C 12-Membran eingeführt, um eine Beschädigung herbeizuführen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Translokation des GFP MG 53 an die Verletzungsstelle zeigen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da Übungen erforderlich sind, um die Techniken der Mikroelektrodenpenetration und der Isolierung von Muskelfasern zu beherrschen. Das Verfahren wird von Dr. Lin, unserem Laborleiter, Dr. Wazu, einem Postdoc-Stipendiaten Matt Orange, einem Doktoranden, und Dr. Shaza, einem wissenschaftlichen Assistenzprofessor in unserer Abteilung, demonstriert. Legen Sie zunächst ein Tablett oder eine blaue Laborunterlage unter das Laufband, um Abfall von den Tieren während des Versuchs zu sammeln.

Legen Sie als Nächstes den Winkel der Laufbandoberfläche fest. Einige Laufbänder verfügen über eine integrierte Vorrichtung zum Einstellen der Steigung, während andere erfordern, dass das Laufband auf andere Weise angehoben wird. In der Regel wird eine ebene Fläche oder ein Winkel zwischen sieben und 15 Grad bergab oder bergauf verwendet.

Akklimatisieren Sie die Mäuse, indem Sie sie bei ausgeschaltetem Stromnetz und eingeschaltetem Riemenantriebsmotor auf das Laufband legen, sich aber nach der Eingewöhnungsphase 15 Minuten lang nicht bewegen, und schalten Sie das motivierende Stromnetz ein. Starten Sie das Laufband mit einer Anfangsgeschwindigkeit von etwa fünf Metern pro Minute. Mit einer Erhöhung der Geschwindigkeit um ein bis zwei Meter pro Minute pro Minute können Sie dem Tier eine Aufwärmphase von fünf Minuten gönnen.

Wiederholen Sie diese Aufwärmphase jeden Tag für drei bis 10 Tage, um die Konformität während des Tests zu erhöhen. Um eine akute Erschöpfungsübung durchzuführen. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit des Laufbandes im Laufe der Zeit, bis eine maximale Geschwindigkeit erreicht ist, und überwachen Sie auf Anzeichen von Erschöpfung.

Ein Tier gilt als erschöpft, wenn es mehr als die Hälfte der Zeit außerhalb des Laufbandes oder fünf aufeinanderfolgende Sekunden in der Startaufstellung verbringt. Entfernen Sie die erschöpfte Maus und notieren Sie die Gesamtlaufzeit. Ausdauertraining.

Laufende Protokolle beginnen mit dem gleichen Aufwärmverfahren. Allerdings ist die maximale Drehzahl in der Regel geringer und die Laufzeiten können recht lang sein. Bringen Sie die Mäuse nach dem Test in ihren Heimkäfig zurück und reinigen Sie das Laufband mit 70 % Ethanol.

Isolieren Sie die oberflächliche Schicht des Musculus flexor digitorum brevis vom Fuß für die weitere Analyse. Schneiden Sie zuerst die Haut der Sohle an der Mittellinie ab und achten Sie darauf, den darunter liegenden Muskel nicht zu beschädigen. Machen Sie als Nächstes horizontale Schnitte und entfernen Sie die Haut.

Identifizieren Sie die flache weiße Sehne des FDB-Muskels, die mit dem Fersenbein verbunden ist. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Sehne in der Nähe der Befestigungsstelle zu trennen und dann zu durchtrennen. Ziehe die Sehne sanft nach oben, während du sämtliches Bindegewebe wegschneidest.

Lokalisieren Sie, wo sich die distalen Sehnen in die einzelnen Zehen verzweigen. Schneiden Sie die Sehnen dort durch, wo sie mit der tieferen Muskelschicht verbunden sind, und entfernen Sie das FDB. Legen Sie das FDB-Muskelbündel in einen Milliliter Kollagenaselösung und erwärmen Sie es auf 37 Grad Celsius.

Kleben Sie das Röhrchen horizontal auf einen 37 Grad Celsius heißen Orbitalschüttler und schütteln Sie es 65 Minuten lang bei 200 U/min. Eine ausreichende Verdauung ist durch ein ängstliches Aussehen und eine blasse Farbe gekennzeichnet. Schneiden Sie das Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab, damit das verdaute Bündel passieren kann.

Übertragen Sie das Bündel einfach in ein Zentrifugenröhrchen mit etwa 600 Mikrolitern 2,5. Calcium-Tyro. Drehen Sie den Schlauch vorsichtig um, um die losen Fasern aus dem Bündel zu schütteln.

Schneiden Sie anschließend das Ende einer 30-Mikroliter-Pipettenspitze so ab, dass der Durchmesser nur geringfügig kleiner als das Muskelbündel ist. Ziehe das Bündel mit dieser Spitze in die Pipette und schiebe es dann zurück in die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Großteil der Fasern vom Bündel getrennt ist.

Mischen Sie die dissoziierten Fasern, indem Sie den Schlauch vorsichtig drehen. Nehmen Sie die gewünschte Menge heraus und lassen Sie sie auf eine Delta-T-Schale mit Glasboden fallen. Lagern Sie die restlichen Fasern etwa sechs Stunden lang bei vier Grad Celsius für die Verwendung und zusätzliche Studien.

Lassen Sie das Gericht fünf Minuten lang ungestört stehen. Dadurch können die Fasern am Glasboden der Schale haften. Stellen Sie die Glasbodenschale auf ein konfokales Mikroskop, das mit einem UV-Laser ausgestattet ist.

Beobachten Sie die Fasern unter Phasenmikroskopie bei mehr als 100-facher Vergrößerung, um zu überprüfen, ob ein normales Streifenmuster und eine gerade stabartige Form vorhanden sind. FM 1 43 oder FM 4 64 Styro-Perineum-Stanzen werden der Lösung bis zu einer Endkonzentration von 2,5 μmolar zugegeben. Richten Sie die Faser in einem 45-Grad-Winkel von links oben nach rechts unten aus, um Schäden zu verursachen.

Bestrahlen Sie einen fünf mal fünf Pixel großen Bereich der Plasmamembran. Unter Verwendung eines UV-Lasers, der fünf Sekunden lang auf maximale Leistung eingestellt ist, sollte der bestrahlte Bereich die Plasmamembran spalten, d. h. die Hälfte der fünf mal fünf Boxen sollte sich innerhalb der Faser befinden, während der Rest außerhalb der Faser sein sollte, um Bilder des Farbstoffeintritts in die Faser in Abständen von jeweils fünf Sekunden für bis zu fünf Minuten aufzunehmen. Pro Schale dürfen nur drei Fasern bestrahlt werden, da der Fluoreszenzfarbstoff schließlich in die Faser endozytiert wird und jede Datenanalyse erschwert.

Nachdem drei Fasern verwendet wurden, sollte ein neues Gericht zubereitet werden. Berechnen Sie mit Hilfe einer Analysesoftware die Änderung der Fluoreszenzintensität in einem Bereich von etwa 200 Quadratmikrometern für den Vergleich zwischen den Fasern. Die folgende Berechnung sollte für jedes Frame-Delta F dividiert durch F Null durchgeführt werden, wobei F Null die mittlere Fluoreszenz des interessierenden Bereichs im ersten aufgenommenen Frame und Delta F die Änderung der Fluoreszenz in jedem nachfolgenden Frame ist.

Verwenden Sie Standardmethoden, um Zellen mit Plasmid-DNA zu transfizieren, die GFP MG 53 exprimiert. Bereiten Sie dann die Mikropipetten vor. Legen Sie eine Pyrex-Kapillare auf eine Mikropipette.

Ziehen und Ziehen nach voreingestelltem Programm. Befestigen Sie die Mikropipette an einer dreiachsigen Mikromanipulatorkultur. Das Medium wird aus der Delta-T-Schale entfernt und durch 2,5 millimolaren Calcium-Tyropuffer ersetzt.

Stellen Sie die Schale mit den transfizierten Zellen auf ein konfokales Laserscanning-Mikroskop mit 40 x 1,3 NA Ölimmersionsobjektiv. Induzieren Sie akute Schäden an lebenden Zellen, indem Sie die Mikropipette in die Zellmembran einführen und dann die Mikropipette schnell aus der Zelle zurückziehen. Sammeln Sie aufeinanderfolgende Live-Zellbilder in einem Intervall von 1,54 Sekunden pro Frame für die Troponin-induzierte Membranauflösung.

PERFU 0,005 % Troponin mit einer Rate von etwa einem Milliliter pro Minute direkt über der abzubildenden Zelle. Mit dem Laufband kann eine Verringerung der Laufkapazität gemessen werden. Die hier gezeigten MG 53 Knockout-Mäuse haben aufgrund einer Schädigung der Skelettmuskulatur eine verminderte Laufkapazität.

Das Ausmaß der durch den UV-Laser verursachten Schädigung hängt von der Membranreparaturkapazität der sichtbaren Faser ab. Hier ist eine Faser vor der Verletzung bei einer normalen Maus. Dieses Bild wurde 200 Sekunden später aufgenommen und zeigt eine leichte Verletzung.

Eine Muskelfaser, die von den MG 53-Knockout-Mäusen mit beeinträchtigter Membranreparaturkapazität gewonnen wurde, zeigt nach einer beobachteten Verletzung einen signifikanteren Farbstoffeintrag. Hier ist ein Beispiel für einen unbeschädigten GFP MG 53 transfizierten C zwei C 12 Myotubus. Der Pfeil in diesem Bild zeigt auf GFP MG 53 mit Vesikel, die sich in Richtung der Schädigungsstellen bewegen.

In diesem Beispiel wurde Saponin verwendet, um die Plasmamembran zu schädigen. Beachten Sie die Translokation von GFP MG 53 aus dem Zytosol in die Zellmembran nach einer Verletzung. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gute Muskelfasern mit glatten Saralmembranen und klaren Streifenmustern zu isolieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Membranreparaturkapazität von Muskeln und der Kultur, den Zellen, beurteilen können.