Name: Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung der MG53-vermittelten Zellmembranreparatur in vivo und in vitro. Diese Methode nutzt UV-Laser und Mikroelektroden zur Untersuchung von Membranresealings in der regenerativen Medizin.

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1. Laufband Laufen für Revealing das Ausmaß der Muskelverletzung in Mausmodellen <ol><li> Richten Sie den Winkel des Laufbandes Oberfläche für den Einsatz während der laufenden Protokoll. Generell ist eine flache Ebene oder einem Winkel zwischen 7 ° und 15 ° Grad bergab oder bergauf verwendet wird. Einige Laufbänder haben in integraler Apparat, um die Steigung einstellen, während andere das Laufband, durch andere Mittel erhöht werden müssen. </li><li> Legen Sie eine Schale oder einen blauen Labor-Pad unter dem Laufband, bevor die Tiere in der Tretmühle, Abfälle von den Tieren zu sammeln während des laufenden Protokoll. </li><li> Vor dem Ausführen von Mäusen soll die Umwelt des Laufbandes akklimatisiert werden. Dies geht darum, die Tiere im Laufband für 15 Minuten mit dem Stromnetz abgeschaltet und der Riemenantrieb des Motors auf, aber der Gurt nicht bewegen (dh mit der Geschwindigkeit 0 m / s eingestellt ist). </li><li> Schalten Sie den Motivations-Stromnetz. Die Intensität und die Frequenz der Pulse verwendet werden kann in der Regel auf dem Laufband gesteuert werden, sondern variiert von Hersteller zu Hersteller. Im Allgemeinen ist maximale Intensität nicht erforderlich, um Mäuse zu motivieren, wenn sie bei einer hohen Frequenz (mindestens einmal alle zwei Sekunden) die Einhaltung zu verbessern. </li><li> Aktivieren Sie das Laufband an den laufenden Protokoll beginnen. Eine erste Geschwindigkeit von etwa 5 m / min sollte eine Aufwärmphase für die Mäuse verwendet werden. Die Geschwindigkeit des Laufbandes kann langsam beschleunigt werden, in der Regel durch Zugabe von 1-2 Meter / min für jede Minute nach Beginn des Laufbandes. </li><li> Die Einhaltung der Tiere in den meisten Protokollen kann durch eine Reihe von Kleinauflagen (5 Minuten) bei Aufwärmen Geschwindigkeit von 3 bis 10 Tage vor der experimentellen laufen beginnt verbessert werden. </li><li> Eine akute Erschöpfung Übung wird in der Regel beinhalten die Erhöhung der Geschwindigkeit des Laufbandes mit der Zeit, bis eine maximale Geschwindigkeit (in der Regel &lt;30 m / m) erreicht und aufrecht erhalten, bis die Mäuse Anzeichen von Erschöpfung zu zeigen. Kriterien für die Beurteilung Erschöpfung variieren, aber in der Regel eine Maus verbringen mehr als die Hälfte der Zeit auf das Stromnetz oder 5 aufeinander folgenden Sekunden auf dem elektrischen Netz ohne Rückkehr zum Laufband Oberfläche. Nach einer individuellen Maus erschöpft ist, kann aus dem Laufband entfernt werden und die gesamte Zeit laufen können aufgezeichnet werden. </li><li> Die Veränderung des Winkels des Laufbandes kann in akuten laufenden Studien verwendet werden, um die Ausübung Last (mit einem bergauf-Winkel) zu erhöhen oder zu beschädigen exzentrische Kontraktionen (mit einem Downhill-Winkel), dass die sarkolemmalen Membranen der Muskelfasern 1 Reißen zu induzieren. Evans blue Farbstoff kann in Tiere vor solchen Verfahren für den Einsatz als histologischen Farbstoff beschädigte Muskelfasern 2,3 identifizieren injiziert werden. </li><li> Ausdauertraining Laufen Protokolle bieten eine Übung Belastung für das Tier über einen längeren Zeitraum (bis zu Monate), um Umbau des Muskel-oder Herz-Kreislauf-System zu erzeugen. Warm up-Verfahren ist das gleiche wie oben (Schritt 1,5) jedoch die maximale Geschwindigkeit ist in der Regel niedriger und die Laufzeiten sehr lang sein können (&gt; 1 Stunde). </li><li> Nach Abschluss der Ausführung der Mäuse können in ihre Käfige zurück. Laufbänder in der Regel ziemlich schmutzig, während die Mäuse laufen, besonders über lange Protokolle. Es ist notwendig, um dem Laufband sauber, in der Regel mit einem 70% igem Ethanol Spray, nach jedem Gebrauch. </li></ol> 2. Ex vivo-Test der Membrane Repair Kapazität von isolierten Muskelfasern Nach UV-Laser Damage <ol><li> Sezieren die oberflächliche Schicht des M. flexor digitorum brevis (FDB) Muskeln von der Maus zu Fuß. Zuerst schneiden Sie die Haut der Sohle offen an der Mittellinie, während die Betreuung nicht auf die Muskeln darunter Schaden, dann horizontale Schnitte und die Haut abziehen. Die flache weiße Sehne des FDB Muskel (proximalen Sehne) zu sehen an der Fersenbein werden. Unverblümt trennen die Sehne durch die Zange und durchtrennen die Sehnen in der Nähe von Ort der Befestigung, greifen die freie Sehne durch die Zange und ziehen Sie sie sanft auf die FDB vom umgebenden Gewebe zu trennen, während beschneiden Bindegewebe, verbunden bleiben. Beim Anblick des distalen Sehnen Zweig zu den einzelnen Ziffern der FDB durch Schneiden, wo diese Sehnen, die tiefere Schicht der Muskeln verbinden entfernt werden kann. </li><li> Legen Sie die FDB Muskelbündel in 1 ml Kollagenase-Lösung vorgewärmt auf 37 ° C in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, kleben Sie das Rohr in einer horizontalen Ausrichtung in einem 37 ° C Schüttler und schütteln bei 200 rpm für 65 min. Times of Inkubation eventuell angepasst, um eine ausreichende Verdauung, die durch einen ausgefransten Erscheinungsbild und blasse Farbe des Muskels angegeben ist zu gewährleisten. </li><li> Sorgfältig übertragen verdaut FDB Bündel in eine 1,5 ul Zentrifugenröhrchen mit ~ 600 ul von 2,5 Ca 2 + Tyrode über eine 1 ml Pipettenspitze mit einem abgeschnittenen Ende, die einen Durchmesser ausreicht, um die verdauten Bündel leicht durch ohne Unterbrechung hat. Vorsichtig drehen Sie die Röhre in den losen Fasern aus dem Bündel zu schütteln. </li><li> Schneiden Sie ein 30 ul Pipettenspitze, so dass die diameter ist nur geringfügig kleiner als die Muskelbündel (zwischen 15 bis 20 &amp;mgr; m im Durchmesser) Verwenden Sie die Pipette zu ziehen Sie die Bündel in die Pipette und dann schieben Sie sie zurück in die Lösung.. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Mehrheit der Fasern losgelöst von dem Bündel sind. </li><li> Mix distanziert Fasern auch durch vorsichtiges Drehen der Tube, nehmen gewünschte Menge und Höhe auf ein Glas-bottom delta T Schüssel. Das Volumen, um Last auf die Effizienz der Isolation und der Anzahl der nützlichen Fasern, die auf einem Teller für ein bestimmtes Protokoll benötigt werden, variieren. Die restlichen Fasern können in die Röhrchen bei 4 ° C für ca. 6 Stunden für zusätzliche Studien abgelegt. </li><li> Anschließend wird die Schale sitzen für 5 Minuten ruhig stehen. Dies ermöglicht die Fasern auf das Glas Boden der Schale haften. </li><li> Setzen Sie den Glasboden Schüssel auf einem konfokalen Mikroskopie mit einem UV-Laser ausgestattet. Beachten Sie die Fasern unter Phasenmikroskopie bei&gt; 100-facher Vergrößerung auf das Vorhandensein eines normalen Streifung Muster und eine gerade, stabförmige Form zu überprüfen. </li><li> Add FM1-43 oder FM4-64 styrylpyridinium Farbstoffe 4 bis Lösung auf eine Endkonzentration von 2,5 uM 5. </li><li> Um eine Beschädigung der Faser ihre Position für die Imaging-Fenster bewegen, so wird die Faser in einem 45 ° Winkel von der Spitze des Feldes der Blick auf die unten rechts (Abbildung 1) nach links orientiert. Bestrahlen ein 5x5 Pixel-Bereich (ca. 0.9μmx0.9μm) der Plasmamembran mit einem UV-Laser (80 mW oder höher, 351/364 nm) eingestellt, um maximale Leistung für 5 Sekunden. Die bestrahlte Region sollte split der Plasmamembran, das heißt, die Hälfte der 5x5 Box sollte innerhalb der Faser, während der Rest außerhalb der Faser (Abbildung 1) werden soll. </li><li> Machen Sie Bilder von Farbstoff-Eintrag in die Faser im Abstand von jeweils 5 Sekunden für bis zu 5 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.8 für nicht mehr als 3 Fasern pro Gericht, wie die Fluoreszenz-Farbstoff wird schließlich in die Faser Endozytose und erschweren eine Analyse der Daten. Nach 3 Fasern ein neues Gericht sollte aus Schritt 2.5 vorbereitet werden. </li><li> Analysieren von Daten durch die Berechnung der Änderung der Fluoreszenzintensität (&amp;Dgr; F / F 0) zwischen den einzelnen aufgenommene Bild, um die Menge an Farbstoff Eintrag zu messen. Dies erfordert die Messung der mittleren Fluoreszenz eine Fläche von etwa 200 pm 2 mit Analyse-Software wie z. B. die öffentlich zugänglich ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Zum Vergleich zwischen den Fasern, sollte die folgende Berechnung für jeden Frame gemacht werden: &amp;Dgr; F / F 0, wobei F 0 ist die mittlere Fluoreszenz der Region von Interesse in der ersten erfassten Frame (t = 0; vor Verletzungen) und AF ist die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen nachfolgenden Frame (FF 0). </li></ol> 3. Live Cell Imaging Konfokale um den dynamischen Prozess der Cell Membrane Repair-Monitor <ol><li> Mikropipetten wurden aus PYREX Kapillaren aus. Die Kapillare wurde auf einer Mikropipette puller gesetzt und gezogen von voreingestellten Programm (Heat = 695; Pull = 50; Vel .= 55; Time = 250). </li><li> Micropipette war es, ein 3-Achsen (xyz) Mikromanipulator befestigt. </li><li> Die Zellen werden mit Plasmid-DNA mit normalen Methoden, die auf einem Glasboden delta T Schale transfiziert. Die Medien sollten bis 2,5 mm Ca 2 + geschaltet werden Tyrode Puffer vor Experimenten zu beginnen. </li><li> Glasschalen mit transfizierten Zellen wurden auf einer Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit 40x 1.3NA Ölimmersionsobjektiv platziert. </li><li> Die akute Live-Zellschäden wurde durch Einfügen der Mikropipette in die Zellmembran durchgeführt und dann schnell zurückziehen Mikropipette aus der Zelle 3,6. Fortlaufende Live-Cell-Bilder wurden im Abstand von 1,54 s / Frame erhalten. </li><li> Für das Saponin induzierte Membranzerstörung Assay, 0,005% Saponin (Sigma) in 2,5 mm Ca 2 + Tyrode Puffer wurde durch einen Schwerkraft-flow individuell zusammengestellt Perfusion System 7 perfundiert. Die Perfusion beträgt etwa 1 ml / min und die Durchblutung Spitze sollte direkt über der Zelle abgebildet platziert werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Ein Vertreter Film der Maus Laufband kann während der Dreharbeiten gemacht werden. Der Film illustriert die Senkung der laufenden Kapazität der MG53-/ - Mäusen durch den Skelettmuskel Schaden. Das Ausmaß der Schäden durch die UV-Laser-Schaden-Protokoll detaillierte oben verursacht, hängt von der Membran Reparatur Kapazität der Faser untersucht. Diese Kapazität wird durch den Genotyp der Maus, aus dem die Faser wurde isoliert, extrazellulären Bedingungen und gegebenenfalls auf die Proteinexpression (Transfektion oder Infektion) betroffen. Eine normale Wildtyp-Faser ermöglicht eine leichte bis Farbstoff Eintrag (Abbildung 2a) moderieren. Muskelfaser aus dem MG53-/ abgeleitet - Mäuse mit eingeschränkter Membran Reparatur Kapazität bedeutender Eintrag von Farbstoff in die Faser (Abb. 2b) anzuzeigen. Typische Ergebnisse für Mikroelektroden Verletzungen zeigen, die Translokation von MG53-haltigen Vesikelnzeuge an die verletzte Stelle. Abbildung 3a und 3b zeigen GFP-MG53 transfizierten C2C12 Myotuben durch Insertion der Mikropipette in die Zellmembran beschädigt. In der Zelle vor Mikropipette Schaden ist GFP-MG53 auf beiden Plasmamembran und Cytoplasma 3 befindet. Nach Mikropipette Penetration bewegt GFP-MG53 Vesikel Richtung Schadstellen (wie durch Pfeil gekennzeichnet). Abbildung 3c zeigt eine GFP-MG53 transfizierten C2C12 Myoblasten mit 0,005% Saponin, ein Waschmittel, das die Plasmamembran permeabilisieren können behandelt werden. Nach Saponin Behandlung, GFP-MG53 aus Cytosol an die Zellmembran transloziert. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Weisleder, et al. Abbildung 1. Fiber Alignment und Verletzungen Region Definition. Korrekte Ausrichtung der isolierten Muskelfasern innerhalb des Sichtfeldes und die Definition der Verletzung Region gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Weisleder, et al. Abbildung 2. UV-Laser Schäden FDB Faser. Images zeigen Fasern vor, um Verletzungen (0 sec, links) und bei 200 sec nach der Verletzung (rechts). Fasern aus einer Wildtyp-Maus (a) zeigen leichte Verletzungen. Fasern, die aus Mäusen mit geschwächtem Membran Reparatur (b) ermöglichen mehr Farbstoff zu geben. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Weisleder, et al. Abbildung 3. Mikroelektroden und Saponin Schäden an kultivierten Zellen. Images zeigen C2C12 Myotuben (a, b) und einer C2C12 Myoblasten (c) vor Verletzungen (oben) und nach der Verletzung (unten). Zellen mit einer Mikroelektrode (a, b) verletzt zeigen MG53 Translokation, um Verletzungen zu Websites (Pfeile). Zellen mit Saponin (c) behandelt zeigen MG53 Translokation an die Zellmembran.

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</ol>

Laufband ist eine nützliche Methode ist die Bereitstellung einer Trainingsbelastung zu den behandelten Tieren. Als eine Methode zur Messung der Muskelfunktion und Ausdauer Kapazität ist ein notorisch lauten Ansatz, der nur schwer in eine gleichbleibend reproduzierbar 8 ausgeführt wird. Im Allgemeinen können Zeiten bis zur Erschöpfung als Endpunkt verwendet werden, um große Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen, wie jene zwischen einigen Knockout-Maus Linien und Wildtyp-Mäusen 9 zu beheben. Experimentelle Manipulationen, die subtiler Unterschied, wie einige pharmazeutische Prozesse zu erzeugen, kann nicht aufgelöst werden Unterschiede über den Lärm mit dieser Technik verbunden sind. Um die Reproduzierbarkeit und Sensitivität dieser Techniken zu maximieren, ist es wichtig, die Bedingungen für Sitzung zu Sitzung sehr eng zu halten. Die Zeit des Tages die Tiere ausgeübt werden, sowie die Aufwärmphase Bedingungen verwendet werden, sind wichtige Faktoren und sollte konsistent bleiben von Versuch zu Versuch. Verzerrungseffekte können erhebliche Auswirkungen auf die Gestaltung der Laufband-Protokolle, wie bestimmte Stämme von Mäusen kann viel mehr Zeit auf dem Laufband als andere Stämme und reagieren unterschiedlich auf Ausdauertraining 10. Als allgemeine Richtlinie wird viele Mäuse in der Lage sein zu 200-300 Metern insgesamt zu einer Erschöpfung Studie mit konstanter Anstieg der Geschwindigkeit des Laufbandes (5 m / m Anfangsgeschwindigkeit mit 1 m / m pro Minute nach dem Start aufgenommen) laufen. Für ein Ausdauertraining die Mäuse können zwischen 9-12 m / m für 30 Minuten 2 oder 3 mal pro Woche durchgeführt werden. Allerdings werden die einzelnen Studien erfordern in der Regel einige Optimierungen des Protokolls zum individuellen experimentellen Anforderungen entsprechen. Der UV-Laser-Schaden Verfahren hat sich gezeigt, dass eine effektive Methode zur Messung der Membran Reparatur Kapazität von Skelettmuskelfasern 3,6,11 werden. Ein wesentlicher Bestandteil für den Erfolg dieser Experimente ist es, nur Muskelfasern, die einen geraden, stabförmigen Aussehen Display mit einem regelmäßigen Muster von Rillen und einen reibungslosen Sarkolemm, dass nicht angezeigt wird faltig verwenden. Wenn andere Muskelfasern aktiviert sind Membran beschädigen können bereits vorhanden sein in dieser Fasern und Interpretation der Ergebnisse aus diesen Experimenten kann kompliziert sein. Es ist auch wichtig, dass die Ausrichtung der Faser und der Definition der bestrahlten Region wie in Abbildung 1 definiert werden. Dies stellt eine Verletzung von reproduzierbaren Größe, so dass Vergleich zwischen Fasern. Wenn der definierte Bereich der Verletzung liegt vollständig innerhalb der Faser, wird eine innere Verletzung als Störung des Sarkolemm erstellt werden. Darüber hinaus ist der Wert für &amp;Dgr; F / F 0 berechnet sehr empfindlich auf die Region von Interesse für die Messung der mittleren Fluoreszenz ausgewählt. Eine Fläche von ca. 200 um 2, neben und mit der verletzten Stelle, ist angemessen. Im Gegensatz zu der Region für Verletzungen definiert, sollte dieser Bereich vollständig innerhalb der Faser. Wenn Sie Platz außerhalb der Faser enthalten, werden die daraus resultierenden leeren Bereich &amp;Dgr; F / F 0 in Fasern mit wenig Farbstoff Eintrag zu erhöhen bei gleichzeitiger Senkung der &amp;Dgr; F / F 0 in Fasern mit einem schwereren Phänotyp. Dies verringert die Empfindlichkeit des Tests, wodurch Vergleich zwischen den Fasern erschwert. Für die Mikropipette Schäden Assay sollte der Winkel zwischen der Mikropipette und Glasboden Schüssel etwa 45 Grad sein, um effektiv Schäden der Zellmembran. Die Zellen wurden für Mikropipette Schaden gewählt werden sollte fest mit dem Boden der Schale angebracht werden und runden Zellen nicht, da die meisten wahrscheinlich werden sie nach Mikropipette Stossen zu lösen. Saponin permeabilzation Experimente sind technisch weniger anspruchsvoll und relativ schneller im Vergleich zu Penetration Tests Mikropipette durchzuführen. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen auf Saponin Schäden, einschließlich, dass nur eine Zelle pro Gericht kann verwendet werden, da Saponin wird diffus und Schäden anderer Zellen in die Schüssel.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Nager Laufband </td><td> Columbus Instruments Exer 3 / 6 oder gleichwertig </td><td></td></tr><tr><td> 70% Ethanol </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Tools wie feine Spitze Pinzette, Schere Frühjahr </td><td> World Precision Instruments </td><td></td></tr><tr><td> 2 mg / ml Kollagenase Typ I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 CA 2 + Tyrode-Puffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mosm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm Ca 2 + Tyrode-Puffer (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mosm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Temperierbaren Schüttler </td><td> New Brunswick oder gleichwertig </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 konfokalen Mikroskop mit einem Enterprise 80 mW UV-Laser oder eine gleichwertige konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 oder FM4-64 Farbstoffe </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat Kapillaren Größe 0,8-1,0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Art.-Nr. 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td></tr><tr><td> 3-Achs-Mikromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop oder eine gleichwertige Mikroskop </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualisierung der mg53-vermittelte cell membrane repair mit in vivo und in-vitro- systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Die Reparatur der akuten Verletzung an der Zellmembran ist ein elementarer Prozess der normalen zellulären Physiologie und defekte Membran Reparatur hat zu vielen degenerativen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht worden. Die jüngste Entdeckung von MG53 als wichtige Komponente der Membran Wiederverschließen Maschinen ermöglicht eine bessere molekulare Verständnis der biologischen Grundlagen der Reparatur von Gewebe, als auch für potenzielle translationale Anwendungen in der regenerativen Medizin. Hier haben wir ausführlich die experimentelle Protokolle für die Erkundung der in vivo Funktion des MG53 in die Reparatur von Muskelverletzungen mit Laufband Protokolle an Mausmodellen, für die Prüfung der ex vivo Membran Reparatur Kapazität durch Messung Farbstoff Einstieg in isolierten Muskelfasern, und für die Überwachung des dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Vesikeltransport und Zellmembran Reparatur in kultivierten Zellen mit lebenden Zellen der konfokalen Mikroskopie.

Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Die Reparatur akuter Verletzungen der Zellmembran ist ein grundlegender Prozess der normalen Zellphysiologie, und eine defekte Membranreparatur wurde mit vielen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Membranreparaturkapazität sowohl im Tier als auch in isolierten Zellen zu bewerten. Isolierte Skelettmusikelfasern werden gesammelt und in ein Medium gegeben, das den Farbstoff FM 1 43 enthält. Anschließend wird mittels eines UV-Lasers ein Teil der Zellmembran bestrahlt und beschädigt, um den Eintritt des Farbstoffs in die Zelle zu ermöglichen.Isolierte Zellen werden mit Plasmadna transfiziert, die GFP MG 53 exprimiert, welches sich an der Plasmamembran und im Cytosol der Zelle anreichert. Anschließend wird die Spitze einer Mikroelektrode in die C zwei C 12-Membran eingeführt, um eine Schädigung zu induzieren. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Translokation von GFP MG 53 an die Verletzungsstelle zeigen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da bestimmte Praktiken erforderlich sind, um die Techniken der Mikroelektrodenpenetration und der Muskelzellisolation zu beherrschen. Die Durchführung des Verfahrens zeigen Dr. Lin, unsere Laborleiterin, Dr. Wazu, ein Postdoktorand, Matt Orange, ein Doktorand, sowie Dr. Shaza, eine wissenschaftliche Assistentenprofessorin an unserer Abteilung. Um zu beginnen, stellen Sie eine Schale oder ein blaues Labortuch unter das Laufband, um Abfälle der Tiere während des Experiments aufzufangen.Als Nächstes wird der Neigungswinkel der Lauffläche eingestellt. Einige Laufbänder verfügen über eine integrierte Vorrichtung zur Neigungsverstellung, während andere durch zusätzliche Hilfsmittel angehoben werden müssen. Üblicherweise wird eine ebene Fläche oder ein Winkel zwischen sieben und 15 Grad bergauf oder bergab verwendet.Gewöhnen Sie die Mäuse an das Laufband, indem Sie sie bei ausgeschalteter elektrischer Reizung und eingeschaltetem, aber stillstehendem Laufbandmotor für 15 Minuten darauf platzieren. Nach der Eingewöhnungsphase schalten Sie das motivierende elektrische Gitter ein. Starten Sie das Laufband mit einer Anfangsgeschwindigkeit von etwa fünf Metern pro Minute. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit jede Minute um ein bis zwei Meter pro Minute und gewähren Sie dem Tier eine fünfminütige Aufwärmphase.Wiederholen Sie diese Aufwärmphase jeden Tag für drei bis zehn Tage, um die Compliance während der Tests zu erhöhen. Um eine akute Erschöpfungsbelastung durchzuführen, erhöhen Sie im Laufe der Zeit die Geschwindigkeit des Laufbandes, bis eine maximale Geschwindigkeit erreicht ist, und beobachten Sie Anzeichen von Erschöpfung.Ein Tier gilt als erschöpft, wenn es mehr als die Hälfte der Zeit außerhalb des Laufbandes verbringt oder fünf aufeinanderfolgende Sekunden auf dem Gitter steht. Entfernen Sie die erschöpfte Maus und notieren Sie die gesamte Laufzeit. Ausdauertraining.Laufprotokolle beginnen mit dem gleichen Aufwärmverfahren. Die maximale Geschwindigkeit ist jedoch in der Regel niedriger, und die Laufzeiten können recht lang sein. Bringen Sie die Mäuse nach der Untersuchung in ihren Heimkäfig zurück und reinigen Sie das Laufband mit 70 % Ethanol.Isolezieren Sie die oberflächliche Schicht des Musculus flexor digitorum brevis aus dem Fuß zur weiteren Analyse. Schneiden Sie zunächst die Haut der Fußsohle entlang der Mittellinie auf, wobei darauf geachtet werden muss, den darunterliegenden Muskel nicht zu beschädigen. Danach horizontale Schnitte durchführen und die Haut entfernen.Identifizieren Sie die flache weiße Sehne des M. flexor digitorum brevis, die am Fersenbein (Calcaneus) ansetzt. Trennen Sie mit einer Pinzette die Sehne und durchtrennen Sie sie nahe der Ansatzstelle. Ziehen Sie die Sehne vorsichtig nach oben, während Sie das umgebende Bindegewebe abschneiden.Suchen Sie die Stelle, an der die distalen Sehnen in die einzelnen Zehen abzweigen. Durchtrennen Sie die Sehnen dort, wo sie mit der tieferen Muskelschicht verbunden sind, und entfernen Sie den Musculus flexor digitorum brevis (FDB). Geben Sie das FDB-Muskelbündel in ein Milliliter Kollagenase-Lösung, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.Befestigen Sie das Röhrchen horizontal mit Klebeband an einem orbitalen Schüttler bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es 65 Minuten lang bei 200 U/min. Ein ausreichender Verdau ist durch ein flockiges Aussehen und eine blasse Farbe gekennzeichnet. Schneiden Sie das Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab, damit das verdaute Bündel hindurchpassen kann.Überführen Sie das Bündel leicht in ein Zentrifugenröhrchen, das etwa 600 µL 2,5 %iger Calcium-Tyro enthält. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die losen Fasern aus dem Bündel zu lösen.Schneiden Sie anschließend das Ende einer 30-Mikroliter-Pipettenspitze ab, sodass der Durchmesser nur geringfügig kleiner als der des Muskelbündels ist. Ziehen Sie mit dieser Spitze das Bündel in die Pipette hinein und schieben Sie es dann wieder zurück in die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Großteil der Fasern vom Bündel gelöst ist.Mischen Sie die dissoziierten Fasern, indem Sie das Reagenzglas vorsichtig umdrehen. Entnehmen Sie die gewünschte Menge und geben Sie sie auf eine Glasboden-Delta-T-Schale. Bewahren Sie die restlichen Fasern für etwa sechs Stunden bei vier Grad Celsius zur weiteren Verwendung und für zusätzliche Untersuchungen auf.Lassen Sie die Schale fünf Minuten lang ungestört stehen. Dadurch können sich die Fasern an dem Glasboden der Schale festsetzen. Stellen Sie die Schale mit Glasboden auf ein konfokales Mikroskop, das mit einem UV-Laser ausgestattet ist.Die Fasern unter der Phasenkontrastmikroskopie mit einer Vergr&ouml;&szlig;erung von mehr als 100 x auf das Vorhandensein eines normalen Streifungsmusters und einer geraden, stabf&ouml;rmigen Gestalt &uuml;berpr&uuml;fen. FM 1 43 oder FM 4 64 Styro perineum Farbstoffe bis zu einer Endkonzentration von 2,5 &micro;mol/l zur L&ouml;sung hinzuf&uuml;gen. Die Faser so ausrichten, dass sie im Sichtfeld von oben links nach unten rechts in einem Winkel von 45 Grad verl&auml;uft, um Sch&auml;den zu induzieren.Bestrahlen Sie einen Bereich von fünf mal fünf Pixeln der Plasmamembran. Unter Verwendung eines UV-Lasers, der auf maximale Leistung eingestellt ist, für fünf Sekunden sollte der bestrahlte Bereich die Plasmamembran so teilen, dass die Hälfte des Fünf-mal-Fünf-Kästchens innerhalb der Faser liegt, während der Rest außerhalb der Faser liegt. Erfassen Sie Bilder zum Eindringen des Farbstoffs in die Faser in Abständen von jeweils fünf Sekunden über einen Zeitraum von bis zu fünf Minuten. Pro Schale dürfen nur drei Fasern bestrahlt werden, da der fluoreszierende Farbstoff letztendlich in die Faser endozytiert wird und dadurch die Datenanalyse erschweren würde.Nach der Verwendung von drei Fasern sollte eine neue Petrischale vorbereitet werden. Mithilfe einer Analyse-Software berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität in einem Bereich von etwa 200 Quadratmikrometern, um die Fasern miteinander zu vergleichen. Für jedes Bild sollte die folgende Berechnung durchgeführt werden: Delta F geteilt durch F null, wobei F null die mittlere Fluoreszenz des interessierenden Bereichs im ersten aufgezeichneten Bild darstellt und Delta F die Änderung der Fluoreszenz in jedem nachfolgenden Bild ist.Transfizieren Sie Zellen mit Plasmid-DNA, die GFP MG 53 exprimiert, mithilfe standardisierter Methoden. Bereiten Sie anschließend die Mikropipetten vor. Legen Sie eine Pyrex-Kapillare auf eine Mikropipette.Ziehen und Ziehen nach voreingestelltem Programm. Befestigen Sie die Mikropipette an einem dreidimensionalen Mikromanipulator. Das Medium wird aus der Delta-T-Schale entfernt und durch Tyro-Puffer mit 2,5 mmol/l Kalzium ersetzt.Platzieren Sie die Schale mit transfizierten Zellen auf einem laser-scanning konfokalen Mikroskop mit einer 40x/1,3-NA-Ölimmersionsobjektivlinse. Verursachen Sie akute Schäden an lebenden Zellen, indem Sie die Mikropipette in die Zellmembran einführen und sie anschließend schnell wieder aus der Zelle zurückziehen. Erfassen Sie aufeinanderfolgende Bilder lebender Zellen in einem Intervall von 1,54 Sekunden pro Bild für die durch Troponin induzierte Membranruptur.PERFU 0,005 % Troponin mit einer Rate von etwa einem Milliliter pro Minute direkt über die Zelle, die abgebildet wird. Laufband kann verwendet werden, um eine Verringerung der Laufkapazität zu messen. Die hier gezeigten MG-53-Knockout-Mäuse weisen aufgrund von Schäden am Skelettmuskel eine verminderte Laufkapazität auf.Das Ausmaß der durch den UV-Laser verursachten Schädigung hängt von der Membranreparaturkapazität der beobachteten Faser ab. Hier ist eine Faser vor der Verletzung bei einer normalen Maus. Dieses Bild wurde 200 Sekunden später aufgenommen und zeigt eine leichte Verletzung.Eine Muskelzelle, die von MG-53-Knockout-Mäusen mit beeinträchtigter Membranreparaturkapazität stammt, zeigt nach einer Verletzung einen stärkeren Farbstoffeintritt. Hier sehen Sie ein Beispiel für eine intakte GFP-MG-53-transfizierte C2C12-Myotube. Der Pfeil in dieser Aufnahme zeigt auf GFP-MG-53-haltige Vesikel, die sich in Richtung der Schadensstellen bewegen.In diesem Beispiel wurde Saponin verwendet, um die Plasmamembran zu schädigen. Beachten Sie die Translokation von GFP MG 53 vom Cytosol zur Zellmembran nach der Verletzung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gute Muskelzellfasern mit glatten Sarkolemmen und klaren Streifungsmustern zu isolieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Membranreparaturkapazität von Muskelzellen und die Kultur der Zellen beurteilt werden kann.

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

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Ein in vitro fluoreszenzbasierter Assay zur Messung der Effizienz der Wiederversiegelung von Plasmamembranen

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

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