CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie der COMET-Chip zur Durchführung von Hochdurchsatz-Messungen von DNA-Schäden in Säugetierzellen eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Säugetierzellen in den COMET-Chip geladen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit Chemikalien zu behandeln, von denen bekannt ist, dass sie DNA-Schäden verursachen.

Anschließend werden die Zellen lysiert und mittels traditioneller COMET-Assay-Protokolle elektrophoretisch aufgetrennt. Im letzten Schritt erfolgt die Fluoreszenz-Bildgebung der zellulären DNA, um die Migration der beschädigten DNA sichtbar zu machen. Letztendlich wird eine Bildanalyse-Software verwendet, um das Ausmaß der DNA-Schädigung zu quantifizieren.

Der COMET-Assay existiert bereits seit einer sehr langen Zeit und ist ein äußerst nützliches Verfahren zur Untersuchung vieler verschiedener Arten von DNA-Schäden. Das Problem bestand jedoch darin, dass er eine sehr geringe Durchsatzleistung aufweist und an Empfindlichkeit fehlt. Daher haben wir den COMET-Chip entwickelt, der im Wesentlichen eine Variante des COMET-Assays mit sehr hoher Durchsatzleistung darstellt und beispielsweise Hochdurchsatz-Screenings für die Wirkstoffforschung sowie epidemiologische Studien ermöglicht.

Jing, eine Doktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Der Coma-Chip ist ein Gel mit einer Anordnung von Mikrotellern, das mithilfe eines mikrofabrizierten Stempels mit Mikropfosten hergestellt wird, deren Durchmesser so klein sind wie der einer einzelnen Zelle. Platziert wird das Gel zunächst rückseitig (mit der Bondfilm-Seite nach unten) in eine rechteckige Einzeltellerplatte. Nach dem zweimaligen Waschen des Gels in jeweils 25 Milliliter 1× PBS wird der Coma-Chip auf eine Glasplatte gelegt und die Orientierung des Gels entsprechend gekennzeichnet.

Drücken Sie nun vorsichtig eine umgedrehte, bodenlose 96-Well-Platte in das Gel, wobei sichergestellt werden muss, dass alle 96 Vertiefungen innerhalb des Gelbereichs liegen. Befestigen Sie anschließend beide Seiten der 96-Well-Platte mit 1,5-Zoll-Hefteklammern an der Glasplatte. Abschließend aspirieren Sie jegliches überschüssige PBS aus jeder Vertiefung ab.

Gewinnen Sie die Zellsuspension oder adhärente Zellen gemäß Standardverfahren und verdünnen Sie die Zellen mit Medium auf eine Endkonzentration von 100.000 bis 1 Million Zellen pro Milliliter. Stellen Sie sicher, dass eine Einzelzell-Suspension vorliegt, indem Sie die Zellen gegebenenfalls durch einen Zellfilter leiten. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in jedes Loch der 96-Loch-Komet-Chip-Platte.

Decken Sie die Platte mit dem Gel-Bond-Film ab, um Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie sie anschließend in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, für 30 Minuten, nachdem die Platte aus dem Inkubator entnommen wurde. Wenn die 30 Minuten verstrichen sind, aspirations das Medium aus jedem Gut, entfernen Sie dann die Büroklammern und die bodenlose 96-Loch-Platte. Halten Sie den Comet-Chip mit der Glasplatte schräg und spülen Sie vorsichtig mit einem XPBS, um überschüssige Zellen von der Oberseite des Agaros zu entfernen. Betrachten Sie nun die Platte mithilfe eines 4x-Objektivs an einem Hellfeldmikroskop, um die optimale Zellbeladung zu überprüfen. Nachdem ausreichend Zellen beladen sind, stellen Sie einen Comet-Chip auf eine ebene Oberfläche und überlagern Sie ihn mit 1 % niedrigschmelzendem Agaros, der zuvor auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Lassen Sie die Überlagerung bei Raumtemperatur drei Minuten lang verfestigen und stellen Sie sie anschließend fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Zellen vollständig mit den gewünschten Chemikalien zu belasten. Richten Sie zunächst die Vertiefungen des Komet-Chips sorgfältig mit den Vertiefungen einer neuen bodenlosen 96-Loch-Platte aus und drücken Sie diese vorsichtig nach unten. Befestigen Sie die 96-Loch-Platte wie zuvor mit Büroklammern an der Glasplatte.

Legen Sie die Platte anschließend auf Eis und geben Sie 100 Mikroliter der gewünschten Chemikalie in die jeweilige Konzentration in jede Vertiefung. Lassen Sie die untersuchte Chemikalie für die gewünschte Zeitspanne nach der Applikation auf den Zellen verbleiben, saugen Sie die chemische Lösung aus jeder Vertiefung ab und spülen Sie gegebenenfalls mit einem Mal XPBS. Schneiden Sie das Gel in separate Stücke. Um anschließend die Reparaturkinetik zu untersuchen, geben Sie Kulturmedium in die Vertiefungen, inkubieren Sie und führen Sie zur Lyse der Zellen spezifische Zeitpunkte für die alkalische Kometa-Assay-Durchführung durch.

Bereiten Sie etwa 25 Milliliter Arbeitspuffer für die alkalische Lyse pro Chip vor, indem Sie 1 % Triton X-100 zur alkalischen Lyselagerlösung hinzufügen. Anschließend auf vier Grad Celsius vorkühlen. Gießen Sie den Puffer für die alkalische Lyse in ein Behältnis, das etwas größer als der Comet-Chip ist.

Anschließend tauchen Sie den alkalischen Chip in den gekühlten Arbeitsansatz der alkalischen Lysispufferlösung, stellen ihn in den Kühlschrank und lassen die Lyse über Nacht bei vier Grad Celsius ablaufen. Am nächsten Tag nehmen Sie den Comet-Chip aus der Lysispufferlösung und spülen ihn kurz mit einem XPBS durch. Danach legen Sie den Chip in eine Elektrophoresekammer, wobei die Seite mit dem Gel-Film nach unten zeigt, und befestigen ihn mit doppelseitigem Klebeband.

Nehmen Sie die Kammer in den Kälteraum mit vier Grad Celsius und füllen Sie die Kammer mit kaltem alkalischen Elektrophoresepuffer bis zu einem Stand, der das Gel gerade bedeckt. Lassen Sie danach den Chip 40 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die alkalische Entwindung zu ermöglichen. Führen Sie abschließend das Gel bei ein Volt pro Zentimeter und 300 Milliampere für 30 Minuten laufen.

Stellen Sie im Kühllabor das Volumen des Elektrophoresepuffers in der Kammer so ein, dass der gewünschte Laufstrom erreicht wird. Für den neutralen Kometen-Assay stellen Sie den Arbeits-Lysepuffer her, indem Sie 1 % Triton X-110 % DMSO zur neutralen Lyse-Stammlösung hinzufügen. Bereiten Sie erneut etwa 25 Milliliter Arbeits-Lysepuffer pro Chip vor.

Stellen Sie den Arbeits-Puffer für die neutrale Lyse in den auf 43 Grad Celsius eingestellten Inkubator, um ihn vorzuwärmen. Nachdem der Puffer für die neutrale Lyse erwärmt wurde, tauchen Sie den Komma-Chip in den Puffer für die neutrale Lyse ein und stellen ihn über Nacht in einen 40 Grad Celsius warmen Inkubator. Am nächsten Tag entfernen Sie den Puffer für die neutrale Lyse und waschen den Chip zweimal mit neutralem Elektrophoresepuffer je 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Befestigen Sie den Chip jedes Mal in der Elektrophoresekammer und bringen Sie ihn in den Kühlschrank.

Wie zuvor füllen Sie die Elektrophoresekammer mit kaltem, neutralem Elektrophoresepuffer bis zu einer Höhe, die das Gel gerade bedeckt, und lassen das Gel 60 Minuten lang im Kühlschrank stehen. Führen Sie dann die Elektrophorese im Kühlschrank bei 0,6 Volt pro Zentimeter und sechs Milliampere 60 Minuten lang durch. Passen Sie gegebenenfalls das Volumen des Elektrophoresepuffers in der Kammer an, um den gewünschten Laufstrom zu erreichen. Nachdem der Com-Chip aus dem Kühlschrank entnommen wurde, neutralisieren Sie die Gele durch zweimaliges Waschen mit Neutralisierungspuffer jeweils 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Verbleiben Sie im Chip mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff wie Cybergold oder Iridiumbromid gemäß den Anweisungen des Herstellers und bilden Sie mittels Fluoreszenzmikroskopie repräsentative Mikroloch-Kometen von unbehandelten TK6-Lymphoblasten im oberen Feld dieses Diagramms ab. Diejenigen aus TK6-Zellen, die 50 µM Wasserstoffperoxid ausgesetzt waren, sind im mittleren Feld dargestellt, und die aus Zellen, die 100 µM Wasserstoffperoxid ausgesetzt waren, im unteren Feld.

Alle Behandlungen erfolgten 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dieses Liniendiagramm zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve von Wasserstoffperoxid für TK6-Zellen. Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt aus drei unabhängigen Experimenten dar, wobei der Medianwert des prozentualen Schwanz-DNA-Anteils von mindestens 50 einzelnen Kometen in jedem Experiment ermittelt wurde.

Dieses Diagramm zeigt die Proben-zu-Proben-Variation des Cometa-Chip-Assays für TK6-Zellen, die Wasserstoffperoxid ausgesetzt waren. Die Prozent-DNA-Werte im Schwanz für jede Vertiefung sind hier dargestellt. Jede Box repräsentiert den Median von mindestens 50 einzelnen Kometen aus jeder Vertiefung. Der Mittelwert von 12 Vertiefungen beträgt 77,53 %, die Standardabweichung liegt bei 3,99 % und der Variationskoeffizient beträgt 5,2 %. Dieses Diagramm zeigt die Variation von Experiment zu Experiment.

Die gleiche Wasserstoffperoxid-Behandlung wurde sechsmal wiederholt, und die Daten jedes Durchlaufs sind als grauer Balken dargestellt. Jede Box repräsentiert den medianen Anteil an Schwanz-DNA von mindestens 100 einzelnen Kometen pro Wiederholung. Der Mittelwert aus sechs Wiederholungen beträgt 49,57 % und ist hier als schwarzer Balken dargestellt.

Die Standardabweichung von sechs Wiederholungen beträgt 4,99 % und die Fehlerbalken des Mittelwerts liegen bei 2,04 %, dargestellt als Luftbalken in der Abbildung. Wie bei herkömmlichen Standardanalysen können Forscher Modifikationen an diesem Verfahren vornehmen oder andere Ansätze verwenden, beispielsweise die Zugabe gereinigter, läsionsspezifischer Enzyme, um zusätzliche Fragen bezüglich der Art der in Zellen verursachten DNA-Schäden zu beantworten. Die Komet-Chip-Technik hat den Weg für Untersuchungen an Säugetierzellen geebnet, um Erkenntnisse über DNA-Schäden und deren Reparatur zu gewinnen.

Und da es hochdurchsatzfähig ist, ermöglicht es klinische und epidemiologische Studien, die aufgrund der Probenanzahl zuvor nicht möglich waren.