CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie der COMET-Chip verwendet werden kann, um DNA-Schadensmessungen mit hohem Durchsatz in Säugetierzellen durchzuführen. Dazu werden zunächst Säugetierzellen in den COMET-Chip geladen. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit Chemikalien zu behandeln, von denen bekannt ist, dass sie DNA-Schäden verursachen.

Anschließend werden die Zellen lysiert und Electro East mit herkömmlichen COMET-Assay-Protokollen durchgeführt. Der letzte Schritt ist die Fluoreszenzbildgebung der zellulären DNA, um die Migration der beschädigten DNA sichtbar zu machen. Letztendlich wird Bildanalysesoftware verwendet, um das Ausmaß der DNA-Schäden zu quantifizieren.

Den Com-Assay gibt es also schon sehr lange und er ist ein sehr nützlicher Assay, um viele verschiedene Arten von DNA-Schäden zu untersuchen. Aber das Problem war, dass es einen wirklich geringen Durchsatz hat und es an Empfindlichkeit mangelt. Also haben wir den COMET-Chip entwickelt, der im Grunde eine sehr hohe Durchsatzversion des COMET-Assays ist, die es ermöglicht, Hochdurchsatz-Screenings durchzuführen, zum Beispiel für das Wirkstoff-Screening und für epidemiologische Studien.

Jing GA, Doktorand in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Der Komachip ist ein Gel mit einer Anordnung von Mikrovertiefungen, die aus einem mikrofabrizierten Stempel mit Mikrostiften hergestellt werden, deren Durchmesser so klein sind wie der einer einzelnen Zelle, um mit der rechteckigen Platte nach unten in eine rechteckige Platte mit dem Gelbindungsfilm nach unten zu platzieren. Nachdem Sie das Gel zweimal in 25 Millilitern in einem XPBS gewaschen haben, setzen Sie den Komma-Chip auf eine Glasplatte und beschriften Sie dann die Ausrichtung des Gels entsprechend.

Drücken Sie nun vorsichtig eine umgedrehte bodenlose 96-Well-Platte in das Gel und stellen Sie sicher, dass sich alle 96 Wells im Bereich des Gels befinden. Befestigen Sie dann beide Seiten der 96-Well-Platte mit 1,5-Zoll-Binderklammern an der Glasplatte. Saugen Sie schließlich überschüssiges PBS von jedem ab.

Ernten Sie Suspensions- oder adhärente Zellen nach Standardverfahren und verdünnen Sie die Zellen mit Medien auf eine Endkonzentration von 100.000 bis 1 Million Zellen pro Milliliter. Bei Bedarf ist sicherzustellen, dass eine einzellige Suspension durch Passieren eines Zellfilters erhalten wird. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung, die Komet-Chip-96-Well-Platte, wenn sie fertig ist.

Decken Sie die Platte mit dem Gel-Bond-Film ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und legen Sie sie dann 30 Minuten lang in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator, nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator genommen haben. Wenn die 30 Minuten abgelaufen sind, saugen Sie das Medium von jedem an, entfernen Sie dann die Bindemittelklammern und die bodenlose 96-Well-Platte. Halten Sie den Kometenchip mit der Glasplatte in einem Winkel und spülen Sie ihn vorsichtig mit einem XPBS ab, um überschüssige Zellen auf dem Aros zu entfernen. Betrachten Sie nun die Platte durch eine vierfache Objektivlinse auf einem Hellfeldmikroskop, um die optimale Zellbeladung zu überprüfen. Nachdem genügend Zellen geladen wurden, platzieren Sie einen Com-Chip auf einer ebenen Oberfläche, eine Überlagerung mit 1% niedrigem Schmelzpunkt Agros, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Lassen Sie das Overlay drei Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren und platzieren Sie es dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Zellen vollständig zu dünsten, um die Zellen mit den gewünschten Chemikalien zu dosieren. Richten Sie zunächst die Vertiefungen des Kometenchips vorsichtig mit den Vertiefungen einer neuen bodenlosen 96-Well-Platte aus und drücken Sie sie nach unten. Befestigen Sie die 96-Well-Platte wie bisher mit Binderklammern an der Glasplatte.

Legen Sie dann die Platte auf Eis und fügen Sie 100 Mikroliter der interessierenden Chemikalie in der gewünschten Dosis hinzu. Lassen Sie die zu untersuchende Chemikalie in jeder Vertiefung mit der gewünschten Zeit nach der Dosierung auf den Zellen verbleiben, saugen Sie die chemische Lösung aus jeder Vertiefung ab und spülen Sie sie bei Bedarf mit einem XPBS aus. Schneide das Gel in einzelne Stücke. Um dann die Reparaturkinetik zu untersuchen, geben Sie Kulturmedien in die Vertiefungen, inkubieren Sie sie und fahren Sie zu bestimmten Zeitpunkten mit der Zelllyse der LY-Zellen für den alkalischen Kometen-Assay fort.

Bereiten Sie ca. 25 Milliliter alkalischen Lysepuffer für jeden Chip vor, indem Sie 1 %Triton X 100 zur alkalischen Lyse-Stammlösung hinzufügen. Anschließend bei vier Grad Celsius vorkühlen. Dekantieren Sie den alkalischen Lysepuffer in einen Behälter, der etwas größer als der Comet-Chip ist.

Tauchen Sie dann den alkalischen Chip in den gekühlten Arbeitspuffer, stellen Sie ihn in den Kühlschrank und lassen Sie die Lyse über Nacht bei vier Grad Celsius weiterlaufen. Am nächsten Tag wird der Comet-Chip aus dem Lysepuffer entfernt und schnell mit einem XPBS verdampft. Legen Sie dann den Chip mit der Gelfilmseite nach unten in eine Elektrophoresekammer und sichern Sie ihn mit doppelseitigem Klebeband.

Bringen Sie die Kammer in den vier Grad Celsius kalten Raum und füllen Sie die Kammer mit kaltem alkalischem Elektrophoresepuffer bis zu einem Niveau, das das Gel gerade bedeckt. Lassen Sie den Chip dann 40 Minuten lang bei vier Grad Celsius, damit sich die Alkaline abwickeln kann. Lassen Sie das Gel schließlich 30 Minuten lang bei einem Volt pro Zentimeter und 300 Milliampere laufen.

Passen Sie im Kühlraum das Volumen des Elektrophoresepuffers in der Kammer an, um den gewünschten Betriebsstrom zu erreichen. Für den neutralen Kometen-Assay stellen Sie einen funktionierenden neutralen Lysepuffer her, indem Sie 1 % Triton X 110 % DMSO zur neutralen Lyse-Stammlösung hinzufügen. Auch hier werden ca. 25 Milliliter Arbeitslysepuffer für jeden Chip vorbereitet.

Legen Sie den funktionierenden neutralen Lysepuffer zum Vorwärmen in den auf 43 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Nachdem der neutrale Lysepuffer erwärmt ist, tauchen Sie den Komma-Chip in den neutralen Lysepuffer und stellen Sie ihn über Nacht in einen 40 Grad Celsius heißen Inkubator. Am nächsten Tag wird der neutrale Lysepuffer entfernt und dann zweimal für 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit einem neutralen Elektrophoresepuffer verstärkt. Sichern Sie den Chip in der Elektrophoresekammer und bringen Sie ihn in den Kühlraum.

Füllen Sie die Elektrophoresekammer wie zuvor mit kaltem neutralem Elektrophoresepuffer bis zu einem Niveau, das das Gel gerade bedeckt, und lassen Sie das Gel 60 Minuten lang in einem Kühlraum ruhen, lassen Sie das Gel 60 Minuten lang mit 0,6 Volt pro Zentimeter und sechs Milliampere im Kühlraum laufen. Passen Sie auch hier das Volumen des Elektrophoresepuffers in der Kammer an, um bei Bedarf den gewünschten Betriebsstrom zu erreichen. Nachdem Sie den Com-Chip aus dem Kühlraum genommen haben, neutralisieren Sie die Gele durch zweimal Waschen und Neutralisationspuffer für jeweils 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Bleiben Sie mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff wie Cyberg-Gold oder Iridiumbromid im Chip. Gemäß den Anweisungen des Herstellers und der Abbildung mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sind repräsentative Microwell-Kometen aus unbehandelten TK sechs Lymphoblasten im oberen Feld dieses Diagramms dargestellt. Diejenigen aus TK sechs Zellen, die 50 mikromolare Wasserstoffperoxide in der mittleren Tafel und 100 mikromolare Wasserstoffperoxide in der unteren Tafel ausgesetzt waren.

Alle Aufnahmen erfolgten für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dieses Liniendiagramm zeigt die Wasserstoffperoxid-Dosiswirkung von TK sechs Zellen. Jeder Datenpunkt ist der Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten, bei denen in jedem Experiment der mediane prozentuale Anteil der Schweif-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen gewonnen wurde.

Dieses Diagramm zeigt die Variation des Komma-Chip-Assays von Probe zu Probe für TK sechs Zellen, die dem exponierten Wasserstoffperoxid in Prozent der Schwanz-DNA-Daten jeder Vertiefung ausgesetzt sind. Jeder Kasten repräsentiert den Median von mindestens 50 einzelnen Kometen aus jeder Vertiefung. Der Mittelwert von 12 Vertiefungen beträgt 77 Punkte, 53 % Die Standardabweichung beträgt 3,99 % und der Variationskoeffizient beträgt 5,2 %. Dieses Diagramm zeigt die Variation von Experiment zu Experiment.

Die gleiche Wasserstoffperoxid-Exposition wurde sechsmal wiederholt, und die Daten jeder Wiederholung werden als grauer Balken dargestellt. Jedes Kästchen repräsentiert den Median der prozentualen Schweif-DNA von mindestens 100 einzelnen Kometen aus jeder Wiederholung. Der Durchschnitt von sechs Wiederholungen beträgt 49,57 %, die hier als hintere Leiste angezeigt werden.

Die Standardabweichung von sechs Wiederholungen beträgt 4,99 % und der Fehlerbalken des Mittelwerts beträgt 2,04 %, dargestellt als Luftbalken in der Abbildung, wie beim traditionellen üblichen Assay. Den Forschern steht es frei, Änderungen an diesem Verfahren vorzunehmen oder andere Durcheinander zu verwenden, wie z. B. die Einbeziehung von gereinigten läsionsspezifischen Enzymen, um zusätzliche Fragen über die Art der in Zellen erzeugten DNA-Schäden zu beantworten. Die Kometenchip-Technik hat den Weg für Studien an Säugetierzellen geebnet, um mehr über DNA-Schäden und -Reparaturen zu erfahren.

Und da es sich um einen hohen Durchsatz handelt, ist es möglich, klinische und epidemiologische Studien durchzuführen, die vorher aufgrund der Anzahl der Proben einfach nicht möglich waren.