Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Hallo, ich heiße Anael. Ich arbeite bei der Oswaldo Cruz Foundation am Cellular Communication Laboratory. Wir untersuchen hier P2-Rezeptoren und Gap-Injektion im Zusammenhang mit Immunsystem und Leber.

Heute stelle ich Ihnen die Mikroinjektion von Zellen vor. Gap-Injektionen spielen einige physiologische Rollen wie Synapsenübertragung, Herzkontraktionen und andere. Bei dieser Technik können wir untersuchen, ob die Lückeninjektionen funktionsfähig sind oder nicht.

Okay, sehen wir uns die Basiskomponenten des Mikroinjektions-Setups an. Hier haben wir das inverse Fluoreszenzmikroskop, in dem wir die Zellen sehen werden. Dabei handelt es sich um eine CCD-Kamera, um die Ergebnisse aufzuzeichnen.

Wir haben hier den Stromgenerator, mit dem wir den Farbstoff in die Zelle einbringen werden. Als nächstes haben wir die Halterung, an der die Mikroelektrode angeschlossen ist. Und der Mikromanipulator, der mit dem Halter verbunden ist und die Bewegung der Mikroelektrode in den drei Achsen Z, Y und X ermöglicht.Bevor wir das Experiment starten, müssen wir die Mikroelektrode herstellen.

Wir verwenden diese Kapillare aus Borosilikatglas und dieses Gerät mit der Bezeichnung Polar. Hier bringen wir die Borosilikat-Kapillare an. Dieses Wolframfilament werden wir erhitzen, um zwei Mikroelektroden herzustellen.

Jetzt werden wir das Wolframfilament erhitzen und die Welle hier, um die beiden Mikroelektroden herzustellen. Leicht. Unser erster Schritt besteht darin, die Mikroelektrode mit dem Farbstoff zu füllen. Ein Tipp hier ist, dass man nur die Spitze mit ein paar Mikrolitern füllen muss, um das Experiment durchzuführen.

Es ist nicht notwendig, alles zu füllen. Notiz mit weiteren Details. Füllen Sie nur die Spitze.

Starten wir ein Experiment. Wir haben hier die Zellen in der Petrischale, in einer Natriumlösung. Das silberne Kabel, das mit dem Stromgenerator verbunden ist.

Wir müssen nun die Mikroelektroden in der Kopfstufe anbringen. Hier in der Kopfstufe haben wir einen weiteren Silberdraht, der ebenfalls mit dem Stromgenerator verbunden ist. Sobald die Mikroelektrode angebracht ist, können wir sie in das Bad legen.

Beachten Sie, dass die Spitze der Pipette vorsichtig die Badewanne berührt. Dieses Verfahren wird sehr sorgfältig durchgeführt, um ein Abprallen der Spitze am Boden der Petrischale zu vermeiden. Sobald wir uns in der Badewanne befinden, können wir zum Mikroskop gehen, um nach dem Schatten der Mikropipette zu suchen.

Wir empfehlen, mit dem Blick in die Vergrößerungslinse zu beginnen. Wenn wir den Schatten der Pipette finden, können wir die Mikroelektrode mit dem Mikromanipulator in Richtung der Zelle bewegen. Sobald sie sehr nahe an der Zelle ist, können wir einen Test durchführen, um zu überprüfen, ob die Mikroelektrode nicht blockiert ist.

Wie wir als nächstes sehen werden. Hier sehen wir die Mikropipette und stellen die Mikropipette sehr nah an der Zelle ein. Wir können Zellbewegungen nach rechts und links sehen.

Dann wechseln wir zum Filter, Fluoreszenzfilter. Wir können einen hyperpolarisierenden Impuls anwenden, um zu testen, ob die Spitze der Pipette nicht blockiert ist. Da sich die Mikropipette im Inneren der Zelle befindet, können wir einen hyperpolarisierenden Impuls anwenden, um die Zelle mit dem Farbstoff zu beladen.

Wir verwenden hier den losen freien gelben Farbstoff. Nachdem wir die Zelle mit dem Farbstoff beladen haben und die Nachbarzellen durch Lückeninjektionen verbunden sind, warten wir einige Minuten und wir werden sehen, dass sich die Nachbarzellen durch die Diffusion des Farbstoffs durch diese Lückeninjektionen aufhellen. In unserem Experiment können wir fünf Zellen sehen, die mit Sternen markiert sind und Fluoreszenz zeigen.

Hier gibt es ein gutes Beispiel für ein Experiment der Mikroinjektion in Thymusepithelzellen, in A und B.In den Abbildungen C und D zeigt sich eine Mikroinjektion in eine inerte Thymuszelle von losem freiem Gelb und ein weiterer Farbstoff, der für die Spaltinjektion nicht durchlässig ist, im Insert. Die Thymus-Epithelzelllinie der Figur E und F mikroinjiziert mit losem freiem Gelb und im Insert mit losem freiem Gelb und einem Gap-Injektionsblock. Die Ergebnisse zeigen, dass sich loses freies Gelb nicht auf die Nachbarzellen ausbreitete.

Als nächstes sehen wir eine Mikroinjektion in Thymusepithelzellen in Gegenwart von Dexamethason und die Quantifizierung in B. Dexamethason erhöhte den Kopplungsgrad, wie in der Abbildung B gezeigt wird. Von 100 Injektionen war die Anzahl von drei oder vier verbundenen Zellen in Gegenwart dieses Arzneimittels häufiger. Ich hoffe, ich konnte Anfängern helfen, diese wichtige Technik für das Studium der Mobilfunkkommunikation anzuwenden. Danke und tschüss.