Eine hochdurchsatzkompatible FRET-basierte Plattform zur Identifizierung und Charakterisierung von Botulinum-Neurotoxin-Leichtkettenmodulatoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kleine Moleküle auf Botulinumneurotoxin, eine Leichtkettenhemmung, zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Verbindungsverdünnungsreihen mit hoher Genauigkeit und Präzision vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Verdünnungen der Verbindung in eine schwarze 96-Well-Platte zu übertragen.

Als nächstes wird verdünntes Leichtkettenenzym auf die Platte gegeben und das Enzym wird mit der Verbindung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der letzte Schritt ist die Zugabe des Substrats aus dem leichten Kettenbund, um die Reaktion zu initiieren, die mit einem Fluoreszenzplatten-Reader überwacht wird. Letztendlich sollten sekundäre Screenings, die ein nicht fluoreszierendes Peptidsubstrat verwenden, eingesetzt werden, um die Aktivität der Verbindung zu bestätigen und strengere kinetische Konstanten wie die Dissoziationskonstante des Inhibitors oder ki zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber bestehenden Methoden wie HPLC-basierten oder zellbasierten Methoden besteht darin, dass er einfach durchzuführen und leicht zu automatisieren ist und zum Vergleich der relativen Wirksamkeit einer Reihe von Verbindungen verwendet werden kann. Einzelpersonen können Schwierigkeiten haben, wenn sie mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, wenn sie eine Verdünnungsserie vorbereiten und die Platte richtig mischen, sobald alle Komponenten hinzugefügt wurden. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Puffer und Reagenzien vorbereiten, wie im Textprotokoll beschrieben.

Konfigurieren Sie den Plattenleser so, dass die Platte 10 Sekunden lang mit mittlerer Geschwindigkeit geschüttelt wird und dann die Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 490 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 523 Nanometern alle fünf Minuten im kinetischen Modus für eine Stunde und 30 Minuten bei Raumtemperatur überwacht wird. Nach der Bestimmung des Konzentrationsbereichs der Verbindung markieren Sie die Röhrchen mit dem entsprechenden Verbindungsnamen und der entsprechenden Konzentration, Eloqua, 100 % Dimethylsulfoxid oder DMSO auf alle Röhrchen, um sie für die Verdünnung von zusammengesetztem Getreide vorzubereiten. Bereiten Sie als Nächstes die serielle Verdünnung der Verbindungen für die standardmäßigen Verdünnungsreihen von ein bis drei vor.

Geben Sie zwei Mikroliter der unverdünnten Verbindung zu vier Mikrolitern DMSO in das erste Röhrchen der Verdünnungsreihe und mischen Sie es gut mit einer neuen Pipettenspitze. Entfernen Sie zwei Mikroliter der ersten Verdünnung und fügen Sie vier Mikroliter DMSO in die zweite Röhrchenmischung hinzu. Nun, wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Verdünnungen.

Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen der Verbindungen gut gemischt werden, um sicherzustellen, dass die Konzentrationen der Verbindungen genau sind. Decken Sie die Verbundröhrchen ab und stellen Sie sie beiseite Bei Raumtemperatur erhalten Sie eine undurchsichtige schwarze 96-Well-Platte mit flachem Boden. Unter Verwendung des empfohlenen Plattenaufbaus, der im Textprotokoll zu finden ist.

Sie manuell einen Mikroliter der jeweiligen Verdünnungsverdünnung direkt auf den Boden jeder entsprechenden Vertiefung für die Vertiefungen eins bis neun, geben Sie einen Mikroliter der höchsten Konzentration der zu testenden Verbindung in die Vertiefung ab.11. Dient als intrinsische Fluoreszenzkontrolle der Verbindung. Bei dieser Kontrolle soll festgestellt werden, ob die Verbindungen selbst fluoreszierend sind und/oder die Substrathydrolyse beeinflussen.

Manuelles Dispensieren eines Mikroliters eines bekannten potenten Inhibitors in die Vertiefung, 12 als Positivkontrolle und einen Mikroliter 100 % DMSO in die Vertiefung. 10 als Negativkontrolle mit einer automatisierten Pipettiererabgabe. 79 Mikroliter Assay-Puffer an der Seite der Vertiefungen, einer bis 10 und 12 und 89 Mikroliter an der Seite der Vertiefung, 11.Achten

Sie darauf, dass Sie die Spitze nicht mit dem Boden der Vertiefung berühren, wo sich die Verbindung befindet, um eine Kreuzkontamination der Vertiefungen zu vermeiden. Vortex, das verdünnte Leichtkettenenzym, und verwenden Sie eine automatische Pipette, um 10 Mikroliter des Enzyms an die Seite jeder Vertiefung zu geben, mit Ausnahme von Vertiefung 11. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des hinzugefügten Enzyms zum Boden der Vertiefung gelangt, mischen Sie die Platte vorsichtig an, decken Sie sie ab und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Diese Inkubation bietet einen Vorgleichgewichtsschritt für die Verbindungen, um an die Leichtkette zu binden. Vor der Substratzugabe ist das Botulinum-Neurotoxin vorsichtig mit einem leichtkettigen Substrat zu verwirbeln. Geben Sie dann mit einer automatisierten Pipette jeweils 10 Mikroliter Substrat an die Seite.

Achten Sie darauf, das Substrat an der Seite der Vertiefung hinzuzufügen, die der Stelle gegenüberliegt, an der das Enzym zuvor hinzugefügt wurde. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Reagenzien sofort zu mischen. Legen Sie die Platte in einen Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Reader und starten Sie das zuvor konfigurierte Programm.

Nachdem das Programm beendet ist, berechnen Sie die Enzymgeschwindigkeiten, indem Sie die relative Fluoreszenzeinheit über der Zeit grafisch darstellen und die Steigung der Linie während der linearen Periode der Reaktion berechnen. Bereiten Sie sich auf den automatisierten Betrieb für das Hochdurchsatz-Screening vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Demonstration eines Teils des Hochdurchsatz-Screening-Protokolls wird de young als Postdoc in meinem Labor durchführen. Er wird zeigen, wie Verbindungen mit Hilfe von Laborautomatisierungsgeräten in Platten für das Hochdurchsatz-Screening überführt werden. Nach der Abgabe von verdünntem Botulinumneurotoxin, einem Leichtkettenenzym, in die Assay-Platte.

Weisen Sie den Verbundplatten, Assay-Platten und Behältern mit Reinigungslösungen Bereiche auf der Liquid-Handler-Plattform zu. Programmieren Sie den Liquid Handler so, dass er die Compound-Platten und die Assay-Platten in den vorgesehenen Positionen platziert und die Plattendeckel vor dem Stanzen entfernt. Kalibrieren Sie die Stempelprogrammsoftware und stellen Sie sicher, dass die Stempelstifte untergetaucht sind, aber nicht den Boden der Assay-Platte zerkratzen.

Prägen Sie 50 Nanoliter der Verbindung direkt in die Assay-Platte, die acht Mikroliter Botulinum-Neurotoxin enthält. Eine Lichterkette. Reinigen Sie die Stecknadeln nach jeder Platte, indem Sie sie in DMSO tauchen und dann auf Löschpapier trocknen und diesen Vorgang mit Isopropanol und Methanol wiederholen.

Trocknen Sie abschließend die Stifte über dem Lüfter, nachdem die Verbindungen mit Enzym in die Assay-Platten gestanzt wurden. Stapeln Sie die Standard-Compound-Platten separat, und die Assay-Platten decken die obere Assay-Platte im Stapel ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie sie beiseite. Achten Sie darauf, die Leichtkette mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Verbindungen zu inkubieren.

Längere Inkubationszeiten können beim Stanzen einer großen Anzahl von Platten verwendet werden. Geben Sie abschließend das Substrat in die Assay-Platten und messen Sie die Fluoreszenz, wie im Textprotokoll beschrieben. Unabhängig davon, ob der bundbasierte Botulinum-Neurotoxin-Leichtketten-Assay in einer Weise mit niedrigem Durchsatz oder mit hohem Durchsatz durchgeführt wird, sollte eine Zunahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit beobachtet werden, wenn das Botulinum-Neurotoxin, eine leichte Kette, mit dem Substrat inkubiert wird.

Wenn serielle Verdünnungen einer Verbindung getestet werden, erhält man oft eine Reihe von Linien mit unterschiedlichen Steigungen. Hier. Die Endkonzentration einer Verbindung auf Hydroxyatbasis wird in mikromolaren Einheiten angegeben. Nun, 10 in der hier beschriebenen Plattenanordnung dient als Negativkontrolle, bei der nur das Fahrzeug hinzugefügt wird.

Die Geschwindigkeit dieser Reaktion ist definiert als 100%ige Enzymaktivität und die Raten in Gegenwart einer Verbindung können auf diese Rate normalisiert werden, um die relative Rate oder prozentuale Hemmung zu erhalten. Wenn der Assay mit seriellen Verdünnungen einer Verbindung durchgeführt wird, kann ein Diagramm der Reaktionsgeschwindigkeit im Vergleich zur Inhibitorkonzentration verwendet werden, um die halbmaximale Hemmkonzentration oder IC 50 zu bestimmen. Der Verdünnungsbereich sollte so gewählt werden, dass das Diagramm für eine optimale Kurvenanpassung sigmoidförmig erscheint.

Der IC 50-Wert ist ein relatives Maß für die Wirksamkeit, das am besten als scheinbarer KI-Wert beschrieben wird, da er von der Konzentration des im Assay vorhandenen Enzyms abhängt. Dieser Wert kann dann verwendet werden, um die Wirksamkeit mehrerer getesteter Verbindungen zu vergleichen und zu bewerten. Parallel dazu ist das richtige Mischen der Platte nach der Zugabe jeder Komponente entscheidend, um einen gleichmäßigen linearen Anstieg der Fluoreszenz im Laufe der Zeit zu erhalten, der für eine genaue Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten erforderlich ist.

Dieses Diagramm zeigt ein repräsentatives Experiment, bei dem es eine unzureichende Durchmischung gab und die Rate der Produktbildung über die Zeit nicht linear ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Stunden für bis zu acht Verbindungen durchgeführt werden. Nach diesem Experiment können weitere Assays mit nicht fluoreszierenden Peptidsubstraten durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass Verbindungen das Botulinum-Neurotoxin, die Leichtkette und die somatische Aktivität hemmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die relative Wirksamkeit von Botulinum-Neurotoxin-Leichtkettenhemmern bestimmen können. Das Protokoll wurde in drei Schritten durchgeführt. Zunächst die Herstellung einer Verdünnungsreihe für Verbindungen.

Zweitens die Zugabe eines rekombinanten Leichtkettenenzyms und drittens die Zugabe eines fluoreszierenden Substrats und die anschließende Messung auf einem Fluoreszenzplatten-Reader.