Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die proteolytische Aktivität von Botulinum-Neurotoxin in komplexen Matrices wie Pharma-, Umwelt- und Lebensmittelproben zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Verarbeitungstests und gegebenenfalls Standardkurvenproben durchgeführt werden, um geeignete pH- und Viskositätsbedingungen zu ermitteln. Als nächstes wird das Botulinum-Neurotoxin aus den Proben mit Hilfe von Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen immunpräzipitiert.

Anschließend werden die magnetischen Kügelchen gründlich gewaschen, um störende Verbindungen zu entfernen, und in einem optimierten Reaktionspuffer resuspendiert. Schließlich werden die gewaschenen Kügelchen mit einem Proteinreporter inkubiert und spektroskopisch die Spaltung des Reporters im Laufe der Zeit gemessen. Letztendlich wird der Vergleich der Reporterspaltung in den Testproben mit den Standardkurvenproben verwendet, um die Aktivität des Botulinumtoxins in den Testproben mit einer Empfindlichkeit von Maus bis nahe der Maus Bioassays zu quantifizieren.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie Maus-, Bioassay-, Immun- und anderen Fluoreszenzmethoden bestehen darin, dass dieser Assay keine Tiere erfordert und für die Verwendung in hochkomplexen Matrices in Lebensmittel-, Umwelt- und pharmazeutischen Proben nachgewiesen wurde. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da eine sorgfältige Probenverarbeitung und -verdünnung erforderlich ist. Dieses Verfahren wird von Dr. Mark Dunning, einem Wissenschaftler bei Bio Sentinel, demonstriert.

Bereiten Sie Puffer gemäß dem Textprotokoll vor, um eine Standardkurve für die Quantifizierung von Testproben zu erzeugen, wiegen Sie 10 plus oder minus 0,01 g feste Lebensmittelprobe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und legen Sie diese Probe als Verdünnungsmittel beiseite, wiegen Sie zwei plus oder minus 0,01 g feste Lebensmittelprobe ab. Geben Sie Botulinum-Neurotoxin oder gekauftes Botulinum-Neurotoxin auf die Oberfläche der zwei Gramm Lebensmittelprobe bis zu einer Endkonzentration von 30.000 MLD 50 pro Gramm Lebensmittel. Inkubieren Sie das Verdünnungsmittel und die dotierten Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius, um dem Bot Zeit zu geben, mit der Lebensmittelmatrix zu interagieren.

Um eine natürliche Kontamination nachzuahmen, beziehen Sie sich auf das Textprotokoll für weitere Probentypen. Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter GPB pro Gramm Lebensmittel zu den dotierten und nicht dotierten Proben hinzu und homogenisieren Sie sie mit einem Stößel, bis sie gründlich vermischt sind. Extrapolieren Sie das Gesamtvolumen der zwei Gramm schweren Probe einer dotierten Probe aus dem ungefähren Gesamtvolumen der 10-Gramm-Verdünnungsprobe.

Fügen Sie dann der 10-Gramm-Verdünnungsprobe ein 10-tel-Volumen von 10 x Neutralisationspuffer hinzu und zwei Gramm kauften eine Sdot-Probe basierend auf ihrem Gesamtvolumen. Die Proben werden durch Inversion gut gemischt und durch 10-minütige Zentrifugation bei 6.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius teilweise geklärt. Entfernen Sie dann sofort die Überstände und überführen Sie sie mit dem Bot in neue Röhrchen, indem Sie eine dotierte Probe als D eins und die nicht dotierte Probe als Verdünnungsmittel verwenden, um die restlichen Standardkurvenproben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu erzeugen.

Um feste Lebensmittelproben vorzubereiten, wiegen Sie zunächst zwei feste oder weniger 0,01 Gramm feste unbekannte Proben in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie zwei Milliliter GPB hinzu und verwenden Sie einen Stößel, um die Probe zu homogenisieren. Als nächstes fügen Sie der Probe ein 10stel des Volumens von 10 x Neutralisationspuffer hinzu und mischen Sie gut durch Inversion, nachdem Sie die Probe 10 Minuten lang durch Zentrifugation bei 6.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius teilweise geklärt haben, und übertragen Sie sofort mindestens 750 Mikroliter Überstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Dies ist eine unbekannte Verdünnung. Geben Sie 675 Mikroliter des Verdünnungsmittels in zwei Röhrchen mit der Beschriftung unbekannte Verdünnung zwei und drei. Das Verdünnungsmittel ist das gleiche verarbeitete Material, das für die Erstellung von Standardkurven verwendet wird.

Verwenden Sie die erste Verdünnung, um eine serielle Verdünnung durchzuführen, indem Sie 75 Mikroliter Verdünnung eins in das zweite Verdünnungsröhrchen geben und mischen. Übertragen Sie dann 75 Mikroliter Verdünnung zwei in das Verdünnungsröhrchen drei und mischen Sie. Um die Proben zu klären, zentrifugieren Sie sie mindestens 14.000 Mal fünf Minuten lang. Schwerkraft.

Entfernen Sie sofort die Überstände und füllen Sie sie in neue Röhrchen um, um eine Platte für die Proben einzurichten, fügen Sie 20 Mikroliter 10 x Bindungspuffer zu jeder Vertiefung hinzu, jede unbekannte Probe und die gekrümmten Standardproben D eins bis D acht erfordern drei Vertiefungen und Probe D neun sechs Vertiefungen. Geben Sie 200 Mikroliter jeder Probe in die jeweiligen Vertiefungen und mischen Sie die Platte mit einem Mikroplattenmischer 10 Sekunden lang. Vortex die IPA-Perlen 10 Sekunden lang bei höchster Geschwindigkeit oder bis sie vollständig resuspendiert sind.

Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter der Kügelchen in jede Probenvertiefung und mischen Sie die Platte 30 Sekunden lang. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang in einem rotierenden Platteninkubator bei 750 U/min und 25 Grad Celsius oder Raumtemperatur, um die Platte mit einer automatischen Plattenwaschmaschine zu waschen. Platzieren Sie die Platte nach dem Ausführen des Prime-Programms auf der 96-Well-Magnetbead-Trennplatte auf der Plattenunterlegscheibe.

Führen Sie dann das Master-Waschprogramm aus. Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte von der Waschmaschine. Geben Sie 50 Mikroliter eines x Reaktionspuffers in jede Probenvertiefung und mischen Sie 30 Sekunden lang.

Um den Bot-Test-Matrix-Assay zu starten, fügen Sie 50 Mikroliter 0,5 mikromolaren AE-Reporter hinzu. Um Kanteneffekte zu vermeiden, geben Sie zu jeder Probenvertiefung 100 Mikroliter Wasser. Nun, verwenden Sie Deckenband, um die Platte abzudichten, sie vor Licht abzuschirmen und bei 750 U/min und 25 Grad Celsius oder Raumtemperatur zu inkubieren.

Nehmen Sie die Platte zu jeder Lesezeit aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Deckenband und platzieren Sie die Platte sofort auf der 96-Well-Magnetperlentrennplatte und lassen Sie die Perlen zwei Minuten lang trennen. Legen Sie die Platte in den Mikroplatten-Reader und messen Sie die Emissionen bei etwa 470 und etwa 526 Nanometern unter Anregung bei etwa 434 Nanometern.

Wenn zusätzliche Lesezeiten gewünscht sind, verschließen Sie die Platte nach einer erneuten Aufhängung der Kügelchen für 30 Sekunden auf dem Mikrotiterplattenmischer wieder und legen Sie sie wieder in den Inkubator. Hier sehen Sie die Untersuchungsergebnisse: Mit dem Bot wurde ein Holo-Toin in PBS versetzt und nach zwei-, vier- und 24-stündigen Inkubationen mit dem AE-Reporter getestet. Die Spaltung des Reporters durch den Bot wird als Verringerung des Emissionsverhältnisses gemessen, das von unserem Plattenleser mit etwa 2,7 für den intakten Reporter und etwa 0,7 für den vollständig gespaltenen Reporter gemessen wird.

Spezifische Werte sind zwischen den Plattenlesern unterschiedlich, wie die Linksverschiebung in der Kurve zeigt, eine verlängerte Inkubationszeit mit dem Reporter führt zu einer erhöhten Reporterspaltung. Die in dreifacher Ausfertigung getesteten Datenpunkte zeigen eine geringe Standardabweichung des Mittelwerts und folgen dem erwarteten Trend eines erhöhten Emissionsverhältnisses mit verringerter Toxinbelastung. Wenn der Assay diesem erwarteten Trend nicht folgt, kann dies auf einen Fehler bei der Verdünnungsgenerierung hinweisen, oder wenn die Daten zur Darstellung der Emissionsverhältnisse der Kontrollen, die kein Bot A enthalten, während der Inkubation ebenfalls konstant bleiben, was auf das Fehlen einer unspezifischen Proteaseaktivität hinweist.

Diese Abbildung zeigt die allgemeine Methodik, die zum Nachweis oder zur Quantifizierung unbekannter Proben anhand einer Standardkurve verwendet wird, und quantifiziert pharmazeutische Proben von a. Eine Standardkurve wurde in PBS mit gereinigtem Bot, einem Holo-Toin, erzeugt und parallel zu Verdünnungen des Arzneimittels verarbeitet, das aus einem einzelnen 100-Einheiten-Fläschchen lyophilisiertem Botox, rehydriert in 0,9 % Kochsalzlösung, in diesem Assay erzeugt wurde, wobei der lineare Teil der Standardkurve zwischen einem Emissionsverhältnis von 2,11 und 1,05 liegt und durch das gestrichelte Feld in der Abbildung angezeigt wird. Die Konzentrationen der drei Unbekannten, die in diesen linearen Bereich fallen, wurden dann aus der Standardkurve interpoliert.

In diesem Experiment wurden frische Tomaten und 2%ige Milch als feste und flüssige Lebensmittelmatrizen verwendet und mit einem Komplex versetzt, der aus den Kernproteinen Hollo, Toin und Neurotoxin besteht. Diese Kombination wurde ausgewählt, weil sie dem Toxin ähnelt, das bei einer natürlichen Clostridium-Kontamination entsteht, wie hier gezeigt. Die Wiederherstellung von Bot A wird bei beiden Matrizen beobachtet.

Darüber hinaus erhöht eine verlängerte Inkubationszeit mit dem Reporter die Sensitivität des Assays, führt jedoch nicht zu verringerten Emissionsverhältnissen für die Kontrollen ohne Toxin, was auf die beobachteten Spaltungsergebnisse von Bot A und nicht auf unspezifische Proteaseverschleppung aus dem Lebensmittel im Assay hinweist. In dieser Tabelle sind die Werte A-L-O-D-L-O-Q und EC 50 für beide Lebensmittel zu jedem angegebenen Zeitpunkt zusammengefasst. Die LOD und die LOQ sind definiert als die Probe mit der niedrigsten Konzentration und einem Emissionsverhältnis von weniger als drei bzw. 10 Standardabweichungen unter dem Hintergrund.

Es wird eine gewisse Variabilität von Matrix zu Matrix in LOD und LOQ erwartet, da Matrixeffekte die Bindung des Toxins an die Kügelchen und die Rückgewinnung der Kügelchen während des Waschens beeinflussen können. Obwohl es den Anschein hat, dass aus den Daten eine höhere Toxinrückgewinnung aus 2 %-Milch als aus Tomaten hervorging, resultiert ein Großteil dieses Unterschieds aus der zusätzlichen Verdünnung, die zur Homogenisierung der Tomatenproben in GPB erforderlich ist. Tomaten sind nicht nur eine feste Lebensmittelmatrix, sondern auch ein bemerkenswerter Probentyp, bei dem die Einstellung des pH-Werts und der Ionenstärke für den Erfolg des Assays entscheidend ist.

Diese Abbildung veranschaulicht die Assay-Reaktionen bei der Untersuchung von Tomaten mit oder ohne Einschluss des 10-fachen Neutralisationspuffers. Die Nichtzugabe des Puffers führt zu einer schlechten Rückgewinnung von Bot A aus den Proben und wird durch ein konstantes Emissionsverhältnis über alle getesteten Bot A-Konzentrationen demonstriert. Die Zugabe des 10-fachen Neutralisationspuffers führt jedoch zu einem empfindlichen Toxinnachweis, unspezifische Proteasen können endogen in der Lebensmittelprobe sein oder bei Verwendung von nicht gereinigten Bot-Präparaten wie Clostridium-Kultur eingeführt werden. Überstände und können den AE-Reporter spalten, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Dieses Beispiel zeigt die unspezifische Proteaseaktivität, die in Clostridium-Bot-A-Kulturüberständen gefunden wurde, die einen modifizierten Reporter verwenden, der nicht mehr von Bot A gespalten wird. Die hohe Spaltung des Reporters weist auf die Kultur hin.

Der Überstand enthält eine signifikante Proteaseaktivität, die durch die Zugabe von Proteaseinhibitoren wirksam negiert wird. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie je nach Probentyp und Toxinbelastung in einer Gesamttestzeit von vier bis 26 Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Botulinum-Neurotoxin aus komplexen Proben mittels Immunpräzipitation in einem fluoreszenzbasierten Proteinreportersystem isoliert und quantifiziert

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Botulinum-Neurotoxinen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborcodes sowie chemische und biologische Sicherheitswerkbänke getroffen werden sollten.