Name: Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Quantifizierung von Botulinum-Neurotoxin aus komplexen Matrices mit immunpräzipitierten Antikörper-Magnetperlen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion in Lebensmitteln und Umweltproben.

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Die Autoren danken H. Olivares und D. Ruge für wertvolle Diskussionen und Rat. Diese Forschung wurde zum Teil durch eine NSF SBIR Auszeichnung (IIP-1127245 zu BioSentinel Inc.) und einem Department of Defense Vertrag (W81XWH-07-2 bis 0045 um BioSentinel Inc.) unterstützt.

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin und WC Tucker sind Mitarbeiter oder Eigentümer von BioSentinel Inc. BioSentinel derzeit produziert und hat einige der Reagenzien in diesem Bericht kommerzialisiert.

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Quantifizierung von BoNT / A-Komplex, Holotoxin oder Clostridium Kulturüberstand in komplexen Matrices. Das Protokoll ist das gleiche, jedoch bei der Prüfung anderer BoNT-Serotypen (z. B. BoNT / B, E und F) mit ihren jeweiligen Matrix-Assays 56,60, obwohl die Empfindlichkeit des Assays werden in Serotypen und Assays variieren. Dieses Protokoll ist nicht für jede Art von Probe möglich Rechnung und je nach der spezifischen Probenzusammensetzung und der...

Botulinum-Neurotoxine (BoNT) sind die tödlichsten Stoffe bekannt, mit intravenöser Menschen bei 1-3 ng geschätzte letale Dosen / kg 1,2. Sieben strukturell ähnlichen Serotypen von BoNT, die mit A bis G bestehen, die jeweils aus einer schweren Kette Domäne für Zellbindung, Aufnahme und Translokation in das Cytosol und eine leichte Kette, die eine Zink-Endopeptidase 05.03 kodiert verantwortlich. Die exquisite Toxizität der BoNT ergibt sich aus, zum Teil, seine spezifische Bindung und Aufnahme in die Motor-Neuronen an der neuromuskulären Endplatte 6. Einmal im Inneren des Neurons, die leichte Kette Endopeptidase spaltet spezifisch eine oder mehrere der löslichen N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor Attachment-Protein-Rezeptor (SNARE) Proteine, die für Vesikelfusion erforderlich, die Hemmung der Freisetzung von Neurotransmittern und führt zu schlaffer Lähmung 14.07. Allgemein bekannt als die Krankheit &quot;Botulismus&quot; Lähmung der Membran und Rippenmuskeln durch BoNT bekannten führt letztendlichAtemversagen und Tod, es sei denn eine frühzeitige Diagnose und Behandlung erhalten. Menschenlebensmittelbedingten Botulismus wird am häufigsten mit BoNT-Serotypen A, B, E verbunden sind, und F (BoNT / A, BoNT / B, etc.) und in der Regel ergibt sich aus der Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln 15,16, obwohl, mehrere Fälle von Wundbotulismus wurden unter intravenös Drogen 17,18 wiesen. In den Vereinigten Staaten, ist Säuglingsbotulismus von der Einnahme von Clostridium-Sporen durch Kinder unter dem Alter von einem daraus resultierenden die häufigste Form des Botulismus 19-21. Allerdings wurden lebensmittelbedingten Ausbrüche von BoNT unsachgemäße Einmachen und Lebensmittelverarbeitung resultierenden sowohl in den Vereinigten Staaten und im Ausland berichtet. Zwischen 2000-2009 wurden mindestens 338 Fälle von lebensmittelbedingten Botulismus weltweit, darunter sechs Todesfälle 22 berichtet. Die Fähigkeit zu lebensmittelbedingten Botulismus Ausbrüche rasch und sensibel zu erfassen ist ein entscheidender Hinweis darauf, dass eine frühe Diagnose helfen könnte 23,24. Darüber hinaus werden Nachweismethoden, die kostengünstig und Routinelebensmitteltests ermöglichen eine verbesserte Ernährungssicherheit führen. BoNT des neuronalen Spezifität und langen biologischen Halbwertszeit macht es eine starke therapeutische auch. In den Vereinigten Staaten, sind BoNT-basierte Medikamente, die von der Food and Drug Administration für die Behandlung von kosmetischen Bedingungen und neuromuskuläre bedingten Erkrankungen einschließlich Glabellafalten, zervikale Dystonie, Migräne-Kopfschmerzen, überaktive Blase, und Strabismus genehmigt. Zahlreiche &quot;off-label&quot;-Anwendungen werden dokumentiert, einschließlich der Hochdosis-Behandlungen für schwere Muskelfunktionsstörungen 25-28. Genaue Toxin Quantifizierung ist entscheidend für die richtige Dosierung, wie Unterdosierung kann zu unwirksame Behandlung führen, während eine Überdosierung bringt Patienten mit einem Risiko von potenziell schädlichen Nebenwirkungen. Leider ist keine standardisierte Potenz Testprotokoll über Hersteller geteilt, was zu Einheit Definition Ungleichheiten zwischen BoNT-basierten Wirkstoff products 29-31. Der Standardtest für BoNT ist der Maus-Bioassay, in der BoNT-haltigen Proben werden intraperitoneal in Mäuse injiziert und die Zahl der Todesfälle registriert über 1-7 Tage 16,32,33. Der Maus-Bioassay ist sehr empfindlich mit Nachweisgrenzen (LOD) von 5-10 pg BoNT / A 34, aber ethische Bedenken über Tierversuche, die hohen Kosten der Ausbildung von Personal und die Aufrechterhaltung Tierhaltung, lange Testzeiten und das Fehlen von standardisierte Protokolle führte Anrufe auf standardisierte, tierversuchsfreie Test BoNT-und Quantifizierungsmethoden 35-39 zu entwickeln. Kürzlich wurden mehrere alternative BoNT Quantifizierungsmethoden entwickelt, die Maus oder in der Nähe von Maus-Bioassay-Empfindlichkeit 40-49 bieten. Diese Methoden verwenden häufig Fluoreszenz, Massenspektrometrie, oder immunologische Methoden und bieten Testzeiten deutlich kürzer als der Maus-Bioassay, ohne Tierversuche. Massenspektrometrie-Ansätze mit immunologischen Techniq kombiniertues wurde gezeigt, nachzuweisen und zu quantifizieren BoNT in Lebensmitteln und anderen komplexen Proben enthielten jedoch, Personal Training Anforderungen und Spezialausrüstung Grenze diese Assays 50-55. Die meisten anderen alternativen Assays sind nicht ohne weiteres auf komplexe Stichproben oder fehlt die Routine für BoNT Prüfung erforderlichen Durchsatz. Die hohe Variabilität der Lebensmittelprobe Viskosität, pH-Wert, Salzgehalt und Matrixbestandteile stellt eine besondere Herausforderung bei dem Versuch, in-vitro-Testverfahren mit einer Empfindlichkeit, die extreme Wirksamkeit von BoNT entsprechen zu entwickeln. Selbst einfache und relativ gutartig Puffersysteme, wie die von Aufwirbelung von BoNT-basierte Arzneimittel entstehen, enthalten Salz, Eiweiß, Zucker und Stabilisatoren (zB Hilfsstoffe), die wesentlichen Einfluss in vitro Wirksamkeit von BoNT 56. Toxin Reinigung wird für die genaue Prüfung der Wirksamkeit von allen, aber die einfachsten Proben 56-59 erforderlich. DieBotest Matrix-Tests wurden für die schnelle Hochdurchsatz ausgelegt und konsistente Quantifizierung von BoNT von sehr komplexen Proben mit Hilfe von Geräten häufig in Forschungslabors 56,60 gefunden. Diese Assays verwenden paramagnetischen Kügelchen kovalent an Serotyp-spezifischen Anti-BoNT-Antikörper verbunden, zu binden und zu maskieren BoNT von einer Probe und entfernen störende Matrix Verbindungen durch Waschen. Nach dem Waschen wird gebundenen BoNT proteolytischen Aktivität dann in einer optimierten Reaktionspuffer mit einem Reporter mit der BoNT-Serotyp getestet kompatibel quantifiziert. Diese Reporter sind fluorogene Proteine, bestehend aus einem N-terminalen cyan fluoreszierende Protein (GFP)-Komponente und eine C-terminale gelb fluoreszierendes Protein-Derivat (Venus)-Einheit durch ein BoNT Substrat, SNAP25 Reste 141-206 oder Synaptobrevin Reste 33-94 verbunden, die die Botest A / E oder B / D / F / G-Reporter, beziehungsweise 45. Reporter Spaltung durch BoNT wird mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) überwacht. Wenn ter Reporter ist intakt, Anregung von CFP führt FRET zur Venus, Abschrecken CFP-Emission und spannende Venus Emission. Spaltung des Reporters durch BoNT verhindert FRET, was zu einem Anstieg der GFP-Emission und Abnahme der Venus-Emission. BoNT-Aktivität kann dann quantitativ mit dem Verhältnis der GFP und Venus-Emissionen gemessen werden. LOD unter 3 pg sind aus einer breiten Palette von Lebensmitteln mit einem Hochdurchsatz-96-Well-Plattenformat 56 möglich. Erhöhte Empfindlichkeit kann durch größere Probenvolumina erzielt werden, da der Test ermöglicht Konzentration des Toxins auf die Oberfläche der Kügelchen. Die Botest Matrix Assays für BoNT A, B, E und F wurden entwickelt und mit Lebensmittel-, Pharma-und Umweltproben 56,60 getestet. Hier beschreiben wir Verfahren für die Durchführung dieser Tests für den Nachweis von BoNT bei geringer Komplexität (zB Pharma-, BoNT in Puffer) und hoher Komplexität (zB Lebensmittel-, Umwelt-) Proben. Spezielle Verarbeitungsmethodenmehrere Probentypen werden in diesem Protokoll adressiert und Probentypen hier nicht beschrieben sind, können in der Regel mit einer Kombination der vorgestellten Methoden angepasst werden. Das Protokoll wurde entwickelt und getestet, mit BoNT / A, jedoch ist anpassungsfähig an andere BoNT-Serotypen unter Verwendung ihres jeweiligen Assays wie anderswo 56,60 demonstriert.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A Botulinum-Neurotoxin-Nachweiskit</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>Nachweiskits für BoNT/B und F sind ebenfalls erhältlich.</td></tr><tr><td>Varioskan Flash Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>Es können die meisten Monochromator- oder Filter-basierten Geräte mit 434 nm Anregung und 470 nm und 526 nm Emissionsfähigkeit verwendet werden.</td></tr><tr><td>96-Well-Magnetbead-Trennplatte</td><td>V& P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Es können auch andere Magnetplatten verwendet werden, aber die Platte sollte so gestaltet sein, dass die Kügelchen an der Seite der Vertiefung getrennt sind.</td></tr><tr><td>Magnetbead-kompatibler Tellerwascher</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>Optional, nur für die automatisierte Plattenwäsche erforderlich. Es können auch andere mit magnetischen Perlen kompatible Tellerscheiben verwendet werden, die jedoch vor der Verwendung getestet werden sollten.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td>Optional, nur für Proben erforderlich, die zentrifugiert werden müssen.</td></tr><tr><td>MixMate Plattenmischer</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td>Wird bei Raumtemperatur oder bei 25 & Grad verwendet; C Wenn eine Temperaturregelung verfügbar ist</td></tr>: <tr><td>EDTA-freie Proteasehemmer Tabletten Roche</td><td></td><td>4693132001</td><td>Nur für Lebensmittel- oder Umwelttests erforderlich. Proteasehemmer müssen EDTA-frei sein.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiologika</td><td></td><td>Optional, nur für Standardisierungs- und Quantifizierungszwecke erforderlich</td></tr><tr><td>Schwarze, 96-Well-Platten mit flachem Boden</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>Platten, die nicht behandelt werden sollten</td></tr><tr><td>96-Well-Plattendichtband</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und quantifizierung von botulinum neurotoxin aus komplexen matrices mit den botest matrix assays

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Für Pharma-, Umwelt-, und Lebensmittelstichproben ist eine genaue Erfassung und Quantifizierung von Botulinum-Neurotoxin (BoNT) in komplexen Matrices erforderlich. Schnelle Prüfung von BoNT Lebensmittel während Ausbruch Forensik, Patientendiagnose und die Lebensmittelsicherheit Tests erforderlich, während genaue Wirksamkeitsprüfung ist für BoNT-basierten Wirkstoffproduktherstellung und die Sicherheit der Patienten erforderlich. Die weit verbreitete Maus-Bioassay für BoNT-Tests ist sehr empfindlich aber es fehlt die Präzision und Durchsatz für schnelle und Routine BoNT Tests erforderlich. Darüber hinaus hat die Verwendung von Tieren in der Bioassay Anrufe Medikament Regulierungsbehörden und Tierschutz Befürworter in den USA und im Ausland, um den Maus-Bioassay für BoNT Versuche ersetzen geführt. Mehrere in vitro-Assays Ersatz entwickelt worden, die gut mit gereinigtem BoNT in einfachen Puffern zu arbeiten, aber die meisten haben nicht gezeigt, für Tests in hoch komplexen Matrices zu sein. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis vonBoNT in komplexen Matrices mit den Botest Matrix-Tests vorgestellt. Der Test besteht aus drei Teilen: Der erste Teil beinhaltet die Herstellung der Proben für die Prüfung, ist der zweite Teil eine Immunpräzipitation Schritt mit Anti-BoNT Antikörper-beschichteten paramagnetischen Kügelchen zu BoNT aus der Matrix zu reinigen, und der dritte Teil quantifiziert des isolierten BoNT des proteolytischen Aktivität unter Verwendung eines fluorogenen Reporter. Das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-Tests in 96-Well-Platten mit flüssigen und festen Matrizen geschrieben und benötigt ca. 2 h manuelle Vorbereitung mit Gesamttestzeiten von 4-26 h je nach Probentyp, Toxin Last und gewünschte Empfindlichkeit. Daten für BoNT / A-Tests mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, einem Medikament, Kulturüberstand, 2% Milch und frischen Tomaten dargestellt und umfasst Erörterung kritischer Parameter für den Test erfolgreich.

Ein Diagramm, das die Schritte in der beschriebenen Protokoll ist in Fig. 2 gezeigt. Der Test benötigt zwischen 4-26 Stunden, je nach Probentyp und die gewünschte Testempfindlichkeit zu vervollständigen, aber nur ~ 2 Stunden von Hands-on-Zeit. Der Assay wird in 96-Well-Platten durchgeführt und je nach Art der Prüfung durchgeführt wird, ermöglicht Dreifachprüfung von bis zu 20 Proben einschließlich Standards pro Platte. Fig. 3 zeigt repräsentative Testergebni...

Die Botest Matrix Botulinum-Neurotoxin (BoNT) Nachweisassays schnell zu reinigen und zu quantifizieren BoNT aus einer Reihe von Probenmatrix. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von BoNT sowohl aus festen und flüssigen Matrices und zeigen die Assay mit BOTOX, Tomaten und Milch.

Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die proteolytische Aktivität des Botulinum-Neurotoxins in komplexen Matrizes wie pharmazeutischen, umweltbezogenen und Lebensmittelproben zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Test- und Standardkurvenproben gegebenenfalls aufbereitet werden, um geeignete pH- und Viskositätsbedingungen herzustellen. Anschließend wird das Botulinum-Neurotoxin mittels antikörperbeschichteter magnetischer Kügelchen aus den Proben immunpräzipitiert.Anschließend werden die magnetischen Partikel gründlich gewaschen, um störende Verbindungen zu entfernen, und in einem optimierten Reaktionspuffer resuspendiert. Schließlich werden die gewaschenen Partikel mit einem Proteinreporter inkubiert, und die Spaltung des Reporters wird spektroskopisch über die Zeit gemessen. Letztendlich ermöglicht der Vergleich der Reporterspaltung in den Testproben mit den Proben der Standardkurve die Quantifizierung der Aktivität des Botulinumtoxins in den Testproben mit einer Empfindlichkeit nahe der von Maus-Bioassays. Die Hauptvorteile dieser Methode gegenüber anderen Verfahren wie dem Maus-Bioassay, immunologischen oder anderen fluoreszierenden Methoden li

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Research

Forschung

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt einen Multiplex-Bead-basierten Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele in einer Probe. Eine Mischung aus unterschiedlichen Mikrosphären, die an zytokinspezifische Antikörper konjugiert sind, wird verwendet, um die in der Probe vorhandenen Zytokine zu binden. Streptavidin-markierte Reporter werden mit biotinylierten Nachweisantikörpern an den gebundenen Zytokinen immobilisiert. Die Durchflusszytometrie identifiziert die gebundenen Zytokine anhand der...

Ein Multiplex-Bead-basierter Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele

Das Botulinum-Neurotoxin Typ A Leichtkette (BoNT/A LC) ist eine Metalloprotease, die in Motoneuronen eindringt, ihr Substrat SNAP-25 spaltet und die Neurotransmission stört, was zu schlaffer Lähmung führt. Unter Verwendung eines hochdurchsatzkompatiblen FRET-basierten Assays können große Bibliotheken kleiner Moleküle auf ihre Auswirkungen auf die enzymatische Aktivität von BoNT/A LC untersucht werden.

Eine hochdurchsatzkompatible FRET-basierte Plattform zur Identifizierung und Charakterisierung von Botulinum-Neurotoxin-Leichtkettenmodulatoren

Botulinum-Neurotoxin ist eines der stärksten Toxine unter den Biobedrohungsstoffen der Kategorie-A, dennoch ist kein Postexpositionstherapeutikum verfügbar. Der High-Content-Imaging-Ansatz ist eine leistungsfähige Methode zur Identifizierung neuartiger Inhibitoren, da er ein Multiparameter-Screening mit biologisch relevanten Motoneuronen, dem primären Ziel dieses Toxins, ermöglicht.

Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren

Ein benutzerdefiniertes Protokoll wird beschrieben, um ES-Zellen von Mäusen in definierte Populationen von hochreinen Neuronen zu differenzieren, die funktionierende Synapsen und emergentes Netzwerkverhalten aufweisen. Die elektrophysiologische Analyse zeigt den Verlust der synaptischen Übertragung nach Exposition gegenüber Botulinum-Neurotoxin-Serotypen /A-/G und Tetanus-Neurotoxin.

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Dieses Protokoll stellt eine validierte Massenspektrometrie mit Flüssigchromatographie, Ionenmobilität und hoher Auflösung vor, um das Vorhandensein von Mutterkornalkaloiden in Lebensmitteln in Übereinstimmung mit der kürzlich veröffentlichten Verordnung (EU) 2023/915 der Kommission zu bestimmen.

Nachweis von regulierten Mutterkornalkaloiden in Lebensmittelmatrizen mittels Flüssigchromatographie-Mobilitätsspektrometrie-Flugzeitspektrometrie

Explantate aus dem Mittelhirn Dopamin und Striatum in einer Kollagenmatrix Assay für die...

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Neuronale Schaltkreise sind topographisch in Funktionsräume mit spezifischen molekularen Profile organisiert. Hier bieten wir Ihnen die praktischen und technischen Schritte zur Aufdeckung globale Gehirn Topographie mit einem vielseitigen wholemount immunhistochemische Färbung Ansatz. Wir demonstrieren den Nutzen der Methode mit dem wohlverstandenen Zytoarchitektur und Schaltung des Kleinhirns.

Wholemount Immunhistochemie für die Aufdeckung von komplexen Gehirn Topographie

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Dieser Artikel beschreibt ein neuronales Kultursystem, das verwendet werden kann, um große Mengen reiner axonaler Proben für biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Diese Technik wird ein besseres Verständnis der normalen axonalen Physiologie und der Signalwege ermöglichen, die zur Neurodegeneration führen.

Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.

Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

Erfahren Sie die Isolierung und Quantifizierung von Botulinum-Neurotoxin aus komplexen Matrices mit immunpräzipitierten Antikörper-Magnetperlen. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion in Lebensmitteln und Umweltproben.

Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

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