Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die proteolytische Aktivität des Botulinum-Neurotoxins in komplexen Matrizes wie pharmazeutischen, umweltbezogenen und Lebensmittelproben zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Test- und Standardkurvenproben gegebenenfalls aufbereitet werden, um geeignete pH- und Viskositätsbedingungen herzustellen. Anschließend wird das Botulinum-Neurotoxin mittels antikörperbeschichteter magnetischer Kügelchen aus den Proben immunpräzipitiert.

Anschließend werden die magnetischen Partikel gründlich gewaschen, um störende Verbindungen zu entfernen, und in einem optimierten Reaktionspuffer resuspendiert. Schließlich werden die gewaschenen Partikel mit einem Proteinreporter inkubiert, und die Spaltung des Reporters wird spektroskopisch über die Zeit gemessen. Letztendlich ermöglicht der Vergleich der Reporterspaltung in den Testproben mit den Proben der Standardkurve die Quantifizierung der Aktivität des Botulinumtoxins in den Testproben mit einer Empfindlichkeit nahe der von Maus-Bioassays.

Die Hauptvorteile dieser Methode gegenüber anderen Verfahren wie dem Maus-Bioassay, immunologischen oder anderen fluoreszierenden Methoden liegen darin, dass bei diesem Test kein Tierversuch erforderlich ist und dass er bereits für den Einsatz in stark komplexen Matrizes aus Lebensmittel-, Umwelt- und Arzneimittelproben nachgewiesen wurde. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da eine sorgfältige Probenvorbereitung und Verdünnung erforderlich ist. Diese Prozedur wird Dr. Mark Dunning, ein Wissenschaftler bei Bio Sentinel, demonstrieren.

Puffer gemäß der schriftlichen Anleitung vorbereiten, um eine Standardkurve zur Quantifizierung von Testproben zu erstellen; 10 ± 0,01 g feste Lebensmittelprobe in ein 50-ml-Kegelrohr abwiegen und beiseitestellen. Diese Probe wird als Verdünnungsmittel verwendet. In einem zweiten Rohr 2 ± 0,01 g feste Lebensmittelprobe abwiegen. Botulinum-Neurotoxin oder Bought auf die Oberfläche der zweigrammigen Lebensmittelprobe geben, um eine Endkonzentration von 30.000 MLD50 pro Gramm Lebensmittel zu erreichen. Die Verdünnungsmittel- und die angereicherten Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder 4 °C inkubieren, um dem Botulinum-Neurotoxin Zeit für die Interaktion mit der Lebensmittelmatrix zu geben.

Um eine natürliche Kontamination nachzuahmen, siehe den Textprotokoll für zusätzliche Probenarten. Geben Sie anschließend ein Milliliter GPB pro Gramm Lebensmittel zu den angereicherten und nicht angereicherten Proben hinzu und homogenisieren Sie mit einem Pistill, bis eine gründliche Durchmischung erreicht ist. Schließen Sie das Gesamtvolumen der zwei Gramm großen angereicherten Probe aus dem ungefähren Gesamtvolumen der 10-Gramm-Verdünnungsprobe zurück.

Anschießend eine zehntel Volumenmenge 10× Neutralisierungspuffer zur 10 Gramm Verdünnungslösung Probe und zwei Gramm gekauft einer gespikten Probe basierend auf ihren Gesamtvolumina hinzufügen. Die Proben gut durch Umstürzen mischen, beide Proben teilweise durch Zentrifugation 10 Minuten bei 6.000×g und 4 °C klären. Danach sofort die Überstände abnehmen und in neue Röhrchen übertragen, wobei die gespikte Probe als D1 und die nicht gespikte Probe als Verdünnungslösung verwendet wird, und die verbleibenden Standardkurvenproben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen herstellen.

Um feste Proben vorzubereiten, wiegen Sie zunächst zwei plus/minus 0,01 Gramm der festen unbekannten Probe in ein 50-Milliliter-Kegelrohr ab. Geben Sie zwei Milliliter GPB hinzu und homogenisieren Sie die Probe mit einem Pistill. Fügen Sie danach ein Zehntel des Volumens an 10× Neutralisierungspuffer zur Probe hinzu und mischen Sie gut durch Vorsichtiges Umstülpen. Klären Sie die Probe anschließend teilweise durch Zentrifugation 10 Minuten bei 6.000 × g und 4 °C und überführen Sie unverzüglich mindestens 750 Mikroliter des Überstandes in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Dies ist die unbekannte Verdünnung eins. Geben Sie 675 µL des Verdünnungsmittels zu zwei Röhrchen, die als unbekannte Verdünnung zwei und drei gekennzeichnet sind. Das Verdünnungsmittel ist dasselbe aufbereitete Material, das zur Erstellung der Standardkurve verwendet wurde.

Verwenden Sie die Verdünnung eins, um eine serielle Verdünnung herzustellen, indem Sie 75 µL der Verdünnung eins in das Gefäß für die Verdünnung zwei überführen und mischen. Überführen Sie anschließend 75 µL der Verdünnung zwei in das Gefäß für die Verdünnung drei und mischen Sie erneut. Um die Proben zu klären, zentrifugieren Sie diese fünf Minuten lang bei mindestens 14.000 ×g.

Entfernen Sie sofort die Überstände und übertragen Sie sie in neue Röhrchen, um eine Platte für die Proben vorzubereiten. Geben Sie 20 µL 10× Bindungspuffer in jedes Well. Jede unbekannte Probe und die Standard-Kurvenproben D1 bis D8 benötigen drei Wells, Probe D9 benötigt sechs Wells. Geben Sie 200 µL jeder Probe in die jeweiligen Wells und mischen Sie die Platte mit einem Mikroplatten-Mischer für 10 Sekunden. Vortexen Sie die IPA-Kügelchen 10 Sekunden lang mit höchster Geschwindigkeit oder bis sie vollständig resuspendiert sind.

Gegeben Sie anschließend 20 Mikroliter der Perlen in jedes Probenloch und mischen die Platte 30 Sekunden lang. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang in einem rotierenden Platteninkubator bei 750 U/min und 25 Grad Celsius oder Raumtemperatur, um die Platte mit einem automatisierten Plattenwascher zu waschen. Nach Ausführung des Prime-Programms stellen Sie die Platte auf die 96-Loch-Magnetperlen-Trennplatte des Plattenwaschers.

Führen Sie dann das Hauptwaschprogramm aus. Entfernen Sie die Platte nach Beendigung des Programms aus dem Wascher. Geben Sie 50 µL eines 1x Reaktionspuffers in jedes Probenloch und mischen Sie 30 Sekunden lang.

Um den Bot-Test-Matrix-Assay zu starten, geben Sie 50 µL eines 0,5 µM AE-Reporters hinzu. Um Randeffekte zu vermeiden, fügen Sie 100 µL Wasser jedem ungenutzten Probenloch hinzu. Verschließen Sie die Platte mit Deckfolie, schützen Sie sie vor Licht und inkubieren Sie sie bei 750 U/min und 25 °C oder Raumtemperatur.

Entfernen Sie die Platte bei jedem Ableszeitpunkt aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Deckfolienband und stellen Sie die Platte unverzüglich auf die magnetische Trennplatte mit 96 Vertiefungen; lassen Sie die Perlen zwei Minuten lang absetzen. Stellen Sie die Platte in das Mikroplattenlesegerät und messen Sie die Emission bei etwa 470 und etwa 526 Nanometern bei Anregung bei etwa 434 Nanometern.

Wenn zusätzliche Messzeitpunkte gewünscht sind, nachdem die Perlen 30 Sekunden lang auf dem Mikroplattenmischer resuspendiert wurden, die Platte erneut verschließen und in den Inkubator zurückstellen. Dargestellt sind hier Assayergebnisse mit bot holo toin, das in PBS gespikt wurde und nach zwei, vier und 24-stündiger Inkubation mit dem AE-Reporter getestet wurde. Der von bot verursachte Schnitt im Reporter wird als Abnahme des von unserem Plattenreader gemessenen Emissionsverhältnisses von etwa 2,7 für den intakten Reporter auf etwa 0,7 für den vollständig gespaltenen Reporter erfasst.

Die spezifischen Werte variieren zwischen verschiedenen Mikroplatten-Readern, wie durch die nach links verschobene Kurve angezeigt wird; eine verlängerte Inkubationszeit mit dem Reporter führt zu einer stärkeren Spaltung des Reporters. Die in Triplikaten gemessenen Datenpunkte zeigen eine geringe Standardabweichung des Mittelwerts und folgen dem erwarteten Trend einer zunehmenden Emissionsrate bei abnehmender Toxinbelastung. Wenn der Test diesem erwarteten Trend nicht folgt, kann dies auf einen Fehler während der Verdünnungserstellung oder der grafischen Auftragung der Emissionsraten hinweisen. Die Emissionsraten der Kontrollen, die kein Botulinumtoxin A enthalten, bleiben während der Inkubation stabil, was auf das Fehlen unspezifischer Proteaseaktivität hinweist.

Diese Abbildung zeigt die allgemeine Methodik zur Detektion oder Quantifizierung einer unbekannten Probe anhand einer Standardkurve und veranschaulicht die Quantifizierung pharmazeutischer BotA-Proben. Eine Standardkurve wurde in PBS mit gereinigtem BotA-Holotoxin erzeugt und parallel zu Verdünnungen des Arzneimittelprodukts verarbeitet, die aus einem einzelnen 100-Einheiten-Fläschchen lyophilisiertes Botox stammen, das in 0,9 %iger Saline rehydriert wurde. In diesem Assay liegt der lineare Bereich der Standardkurve zwischen einem Emissionsverhältnis von 2,11 und 1,05 und wird im Bild durch die gestrichelte Box angezeigt. Die Konzentrationen der drei unbekannten Proben, die innerhalb dieses linearen Bereichs liegen, wurden anschließend aus der Standardkurve interpoliert.

In diesem Experiment wurden frische Tomaten und 2% Milch als feste bzw. flüssige Nahrungsmatrix verwendet und mit einem Komplex aus dem Core-Hollo, Toxin und neurotoxinassoziierten Proteinen versetzt. Diese Kombination wurde gewählt, da sie dem Toxin ähnelt, das bei einer natürlichen Clostridium-Kontamination gebildet wird, wie hier gezeigt. Die Rückgewinnung von Bot A wird bei beiden Matrices beobachtet.

Außerdem erhöht eine längere Inkubationszeit mit dem Reporter die Empfindlichkeit des Assays, führt jedoch nicht zu verringerten Emissionsverhältnissen bei den Kontrollen ohne Toxin, was darauf hinweist, dass die beobachtete Spaltung auf Bot A und nicht auf eine unspezifische Proteaseübertragung aus der Lebensmittelprobe im Assay zurückzuführen ist. Die Bot A-L-O-D-L-O-Q- und EC 50-Werte für beide Lebensmittel zu jedem angegebenen Zeitpunkt sind in dieser Tabelle zusammengefasst. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) sind definiert als die niedrigste Konzentration, bei der das Emissionsverhältnis um drei bzw. zehn Standardabweichungen unter dem Hintergrund liegt.

Es ist mit einer gewissen Variabilität der Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen (LOD und LOQ) zwischen verschiedenen Matrizes zu rechnen, da Matrixeffekte die Bindung des Toxins an die Kügelchen sowie die Wiedergewinnung der Kügelchen während der Waschschritte beeinflussen können. Obwohl die Daten darauf hindeuten, dass die Toxinrückgewinnung aus 2 % Milch höher war als aus Tomaten, resultiert ein großer Teil dieses Unterschieds aus der zusätzlichen Verdünnung, die notwendig ist, um Tomatenproben in GPB zu homogenisieren. Neben der Eigenschaft als feste Nahrungsmatriz stellen Tomaten einen bemerkenswerten Probentyp dar, bei dem die Einstellung von pH-Wert und Ionenstärke entscheidend für den Erfolg des Assays ist.

Diese Abbildung veranschaulicht die Assay-Antworten bei der Untersuchung von Tomaten mit oder ohne Zugabe des 10× Neutralisationspuffers. Das Auslassen des Puffers führt zu einer geringen Rückgewinnung von Botulinumtoxin A aus den Proben, was sich in einem konstanten Emissionsverhältnis über alle getesteten Konzentrationen von Botulinumtoxin A zeigt. Die Zugabe des 10× Neutralisationspuffers hingegen ermöglicht eine empfindliche Toxin-Detektion. Unspezifische Proteasen können endogen in der Lebensmittelprobe enthalten sein oder durch die Verwendung nicht gereinigter Botulinumtoxin-Präparationen, wie beispielsweise Clostridium-Kulturüberstände, eingeführt werden und den AE-Reporter spalten, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann. Dieses Beispiel zeigt die unspezifische Proteaseaktivität, die in Überständen von Clostridium-botulinum-A-Kulturen mit einem modifizierten Reporter nachgewiesen wurde, der nicht mehr durch Botulinumtoxin A gespalten wird. Die hohen Spaltungsgrade des Reporters deuten auf die Kultur hin.

Das Überstand enthält eine signifikante Proteaseaktivität, die durch die Zugabe von Proteaseinhibitoren effektiv unterbunden wird. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie je nach Probentyp und Toxinlast insgesamt zwischen vier und 26 Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Botulinum-Neurotoxin aus komplexen Proben mittels Immunpräzipitation in einem fluoreszenzbasierten Proteinsensorsystem isoliert und quantifiziert.

Beachten Sie, dass die Arbeit mit Botulinum-Neurotoxinen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborkittel sowie chemische und biologische Sicherheitswerkbänke sollten während dieses Verfahrens verwendet werden.