Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die besondere Biologie an der Grenzfläche zwischen malignen epithelialen Zellen an der invasiven Tumorgrenze und tumorassoziierten stromalen Zellen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre Fibroblastenkulturen aus kolorektalen Implantaten etabliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, organotypische Kokultursysteme unter Verwendung primärer kolonischer Fibroblasten und kultivierter kolorektaler Krebszellen zu konstruieren.

Als Nächstes werden organotypische Modelle in Formalin fixiert, auf Membranobjektträger geschnitten und mit Kristallviolett gefärbt. Der letzte Schritt ist die Laser-Mikrodissektion, um eindringende Tumorzellen von nicht eindringenden Tumorzellen und stromabildenden, tumorbegleitenden Zellen zu trennen. Schließlich können molekulare Profilierungstechniken eingesetzt werden, um die Biologie der eindringenden und nicht eindringenden Tumorzellen sowie der Stromazellen im umgebenden Tumormikromilieu zu charakterisieren.

Die Idee zu dieser Methode entstand, als uns bewusst wurde, wie deutlich eindringende Zellen von nicht eindringenden Zellen in dreidimensionalen organotypischen Ko-Kulturmodellen des kolorektalen Karzinoms zu unterscheiden sind. Zunächst werden Proben von normalem menschlichem Kolonmukosagewebe direkt aus dem chirurgischen Operationssaal in das Labor geholt. Ein Präparat wird in die Mitte einer 10 cm großen Zellkulturschale gegeben und anschließend dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS, ergänzt mit Penicillin, Streptomycin und Fungi Zone, gewaschen.

Aspirieren Sie nicht, nachdem Sie das Gewebe mit sterilen Pinzette und Skalpell in kleine Stücke geschnitten haben. Platzieren Sie dann jedes Stück in der Mitte eines mit der Skalpellklinge eingeritzten Kreuzes. In einer 12-Loch-Platte bewegen Sie das Skalpell vorsichtig über das Gewebe, um dessen Anheftung an die Kultur zu ermöglichen.

Die Proben in 750 Mikroliter Primär-Fibroblasten-Wachstumsmedium, das das Gewebe bedecken, aber ein Aufschwimmen verhindern sollte. Danach die Proben für die nächsten fünf Tage in einen 37 Grad Celsius warmen, 5–10 % CO2 haltigen Inkubator stellen. Fibroblasten beginnen langsam, sich ab etwa sieben Tagen vom Rand des Gewebes aus auszuwachsen.

Dies wird nach ungefähr drei bis vier Wochen deutlicher sichtbar sein. Und wenn ausreichend Fibroblasten ausgewandert sind, geben Sie 750 Mikroliter Trypsin zu jedem Well hinzu, nachdem sich die Zellen gelöst haben, und überführen Sie sie in einen T-25-Zellkulturgefäßkolben für das fibroblastenimprägnierte organotypische Gel. Bereiten Sie zunächst eine Fibroblastenzellsuspension mit 500.000 Zellen pro Gel in supplementiertem DMM vor.

Stellen Sie die organotypischen Gele auf Eis in den im Textprotokoll angegebenen Verhältnissen für neun Gele mit je einem Milliliter her. Bereiten Sie 10 Milliliter vor und mischen Sie vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden. Geben Sie dann je einen Milliliter in jedes Brunnen einer 24-Loch-Platte und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre.

Um den Gelen nach einer Stunde das Aushärten zu ermöglichen, geben Sie ein Milliliter ergänztes DMEM auf die Gelen und stellen Sie sie für die Nacht in den Inkubator zurück. Am folgenden Tag entfernen Sie das Medium vorsichtig von der Oberfläche der Gelen und geben ein Milliliter Medium mit 500.000 kolorektalen Karzinom-Epithelzellen auf die mit Gel beschichteten Nylonfolien.

Bereiten Sie sterilisierte Nylonfolien mit einer Größe von 1,5 cm × 1,5 cm im Voraus unter Verwendung steriler Pinzetten vor. Legen Sie die erforderliche Anzahl an Nylonfolien in eine 10 cm große Kulturschale. Bereiten Sie die Gel-Mischung wie im Textprotokoll beschrieben auf Eis vor und geben Sie 0,1 molare Natronlauge zur Gel-Mischung hinzu, bis diese rosa wird, was darauf hinweist, dass die Lösung neutralisiert wurde.

Fügen Sie dann 250 Mikroliter dieser Lösung zu jedem Nylonblatt hinzu. Anschließend 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren, damit das Gel aushärten kann. Danach 10 Milliliter einer 1 %igen Glutaraldehydlösung in PBS jedem 10 Zentimeter großen Kulturgefäß hinzufügen.

Nachdem das Gel gestanden hat, vor der Inkubation bei vier Grad Celsius für eine Stunde, waschen Sie die Nylonfolien dreimal in PBS und einmal in supplementiertem DME. Inkubieren Sie die Folien über Nacht in demselben Puffer bei vier Grad Celsius, um die organotypischen Gele auf Stahlgittern für die Invasion anzubringen, und sterilisierte Gerüstgitter, die durch Falten von Edelstahlfolien in eine Dreibein-Formation vorbereitet wurden. Anschließend verwenden Sie Pinzette, sterilisiert und mit Ethanol behandelt, um ein Stahlgitter in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte zu legen.

Legen Sie ein Gel mit beschichteter Nylonfolie mit der Kollagen-Seite nach oben auf jedes Raster. Übertragen Sie die organotypischen Gele vorsichtig mit einem Spatel, der sterilisiert und mit Ethanol behandelt wurde, von der 24-Loch-Platte auf die erhöhte Nylonfolie. Füllen Sie die Vertiefung mit supplementiertem D-Mem, bis die Nylonfolie mit dem Medium in Kontakt steht, aber nicht untergetaucht ist.

Stellen Sie sicher, dass das Medium das organotypische Gel nicht berührt. Inkubieren Sie 14 Tage bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage.

Entfernen Sie das gesamte organotypische Gewebe einschließlich der Nylonfolie aus der Mulde und legen Sie es auf eine Haftfolie. Halbieren Sie das organotypische Gewebe und die Nylonfolie mit einem sauberen Einweg-Skalpell und fixieren Sie beide Hälften 24 Stunden lang in Formaldehyd. Ersetzen Sie nach 24 Stunden bei Raumtemperatur den Formaldehyd durch 70 %igen Ethanol und belassen Sie dies über Nacht, bevor das Einbetten in Paraffin, das Schneiden von Schnitten und die Färbung zur Durchführung der Laser-Mikrodissektion erfolgt.

Erster Abschnitt, das organspezifische Gewebe auf eine Dicke von 10 Mikrometern auf Membranobjektträgern schneiden. Nach der Behandlung der Schnitte gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll, bereiten Sie die Durchführung der Laser-Mikrodissektion unter Verwendung der gewählten Plattform vor. Legen Sie den Glasobjektträger mit dem zu mikrodissezierenden gefärbten Schnitt ein.

Montieren Sie rückwärts auf der Mikroskoptischplatte ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in die Sammelkassette und geben Sie 50 Mikroliter Zelllysepuffer in die Kappe, in die das mikrodissektierte Gewebe unter direkter Sicht sammeln wird. Verwenden Sie den Joystick, um das gewünschte Gewebe zu identifizieren, und markieren Sie mithilfe der Software-Schnittstelle den gefärbten Organschnitt, wobei die Zellen am Tumorinvasionsrand hervorgehoben werden, die mikrodisseziert werden sollen. Geben Sie den Befehl an den Laser, zu feuern, wodurch der hervorgehobene Bereich ausgeschnitten und das mikrodissektierte Gewebe in die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens katapultiert wird.

Fahren Sie mit der Verarbeitung der Proben durch eine geeignete Methode zur Extraktion des Analyten der Wahl fort. Hier werden Laser-Mikroschneide-Bilder von SW 480 Darmkrebszellen gezeigt, die in das organoide Stroma eindringen. Crestalviolett wird verwendet, um die epithelialen Darmkrebszellen hervorzuheben.

Die invasiven Tumorislands werden anschließend definiert, bevor die Laser-Mikroschneide erfolgt und das geschnittene Fragment auf ein Sammelgerät übertragen wird. Nicht-invasive Zellen und stromale Zellen werden mit derselben Methodik identifiziert und isoliert. Die dreidimensionalen Ko-Kulturen wurden mittels Mikro-RNA-Profilanalyse untersucht, um die unterschiedlich exprimierten Mikro-RNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorgrenze und Zellen in den geschichteten Tumorzonen zu vergleichen.

Die Daten wurden nach vollständiger Veränderung und Datenwerten, die um den Faktor zwei erhöht oder verringert waren, sortiert. Die Veränderungen aus einem repräsentativen Experiment werden dargestellt und zeigen die unterschiedliche Expression von micro-RNA-Genen zwischen Zellen am invasiven und am nicht-invasiven Rand. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anatomisch angemessene organotypische Modelle aufbaut und wie man mittels Lasermikrodissektion einzelne Zellpopulationen für weitere Untersuchungen isoliert. Whoa.