Name: Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und Ex-vivo- Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie die molekulare Charakterisierung invasiver Tumorzellen und Stromazellen mittels Laser-Mikrodissektion in einem 3D-Organotyp-Modell des kolorektalen Karzinoms. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen der Tumor-Mikroumgebung.

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MB wird durch Zuschüsse aus einem MRC-Stipendium unterstützt. KP und AHM werden durch Zuschüsse von Wessex Medical Research and Cancer Research UK / RCS (England) (C28503/A10013) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Universität von Southampton Histochemistry Research Unit.

1. Gründung der Primär Fibroblasten-Kulturen von Darm Explantate <ol><li> Erhalten Proben von normalem menschlichen Darmschleimhaut Gewebe direkt von der chirurgischen Operationssaal und Aussetzung in 7-10 ml PBS, ergänzt mit 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 &amp;mgr; g / ml Fungizon. </li><li> Im Labor stellen die Probe in der Mitte einer 10-cm-Gewebekulturschale und 3 x waschen mit PBS / Pen-Strep / Fungizone. Nach dem letzten Waschen saugen nicht. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette und Skalpell geschnitten das Gewebe in kleine Stücke (ca. 2 mm) und legen jedes Stück in der Mitte des Kreuzes mit dem Skalpell in einer 12-Well-Platte gezogen. Rock the Skalpell vorsichtig über das Gewebe, damit sie halten. </li><li> Kultur die Proben in 750 ul primären Fibroblasten-Wachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 292 ug / ml L-Glutamin), die subme sollterge das Gewebe ohne Aktivierung es zu schweben. Vermeiden Sie die Platte stören in den nächsten 5 Tagen außer neu Feed alle 2 Tage. </li><li> Im Laufe der nächsten 5 Tage Fibroblasten langsam beginnen, von der Kante des Gewebes herauswachsen. Bei etwa 7 Tage, das mehr sichtbar sein. Nach ca. 3-4 Wochen, und wenn es genügend Fibroblasten wachsen aus, fügen Sie 750 ul Trypsin in jede Vertiefung. Nach Zellen abgelöst, Pool und in ein T-25-Zellkulturflasche (die 5-10 Minuten dauern kann). </li></ol> 2. Organotypische Vorbereitung Vorbereitung der Fibroblasten-Gel imprägniert organotypischen: <ol><li> Vorbereitung einer Fibroblastenzellsuspension mit 5 x 10 5 Zellen pro organotypischen in DMEM mit 10% FCS und 292 ug / ml L-Glutamin ergänzt. </li><li> Bilden die organotypischen Gele auf Eis, in den folgenden Verhältnissen: <ul><li> 7 Volumen Rattenschwanz Collagen: Matrigel-Mischung (1:1) </li><li> 1 Volumen gefiltert 10x DMEM </li><li> 1 Volumen FCS </li><li> 1 Volumen der Fibroblasten-Zellsuspension mit 5 x 10 5 Fibroblasten Für 9 Gele (1 ml pro Gel) 10 ml vorzubereiten und vorsichtig mischen, um Blasen zu vermeiden. </li></ul></li><li> 1 ml in jedes Well einer 24-Well-Platte und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre zu ermöglichen Gele einzustellen. Nach 1 Stunde 1 ml DMEM (10% FCS) / Glut auf der Gele und zurück in den Inkubator über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag absaugen Medium von der Oberseite des Gels und der Platte 1 ml Medium, enthaltend 5 × 10 5 CRC Epithelzellen. </li></ol> Herstellung von Gel-beschichteten Nylon Blätter: <ol start="5"><li> Bereiten steril, autoklavierbar Nylon Blätter Messung 1,5 cm x 1,5 cm, im Voraus. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie die gewünschte Anzahl der Blätter in einer Nylon 10 cm Kulturschale (in der Regel 4 Nylonblätter können pro Schale untergebracht werden). </li><li> Make-up-Gel auf Eis in der folgenden Reihenfolge (250 ul GesamtNylon pro Blatt Volumen erforderlich): <ul><li> 7 Volumen Rattenschwanz Collagen </li><li> 1 Volumen gefiltert 10x DMEM </li><li> 1 Volumen FCS </li><li> 1 Volumen DMEM 10% FCS / Glut </li></ul></li><li> Wenn die Lösung gelb, zu neutralisieren, indem 0,1 M NaOH in 50 &amp;mgr; l Aliquots, bis die Lösung rosa. </li><li> Add 250 ul dieser Lösung zu jeder Nylonfolie und bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 für 30 min, damit Gel einzustellen. </li><li> Make-up 1% Glutaraldehyd-Lösung in PBS. 10 ml zu je 10 cm Kulturschale einmal das Gel gesetzt und Inkubation bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Wasch Nylon Blätter 3x in PBS und 1 x in DMEM (10% FCS) / Glu beimpft und über Nacht in DMEM / Glu bei 4 ° C. </li></ol> Raising organotypischen Gele auf Stahlgitter für die Invasion: <ol start="12"><li> Pre-Vorbereitung Gerüstnetze durch Falten Edelstahlbleche in einem Stativ Bildung. Autoklavieren vor der Verwendung.</li><li> Verwenden einer Pinzette in Ethanol sterilisiert, um eine Stahl-Gitter in jede Vertiefung einer sechs Well-Platte zu platzieren. </li><li> Legen Sie ein Gel-beschichteten Nylon-Blatt mit der Kollagen-Seite nach oben, auf jedes Netz. </li><li> Organotypischen die Gele vorsichtig übertragen von der 24-Well-Platte in die erhöhte Nylon Blatt mit einem Spatel in Ethanol sterilisiert. </li><li> Füllen Sie die gut mit DMEM 10% FCS / Glut mit 10% FCS, bis die Nylonfolie in Kontakt mit dem Medium, aber nicht unter Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Medium nicht die organ Gel berühren. </li><li> Inkubation für 14 Tage bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 ersetzt Medien alle 2 Tage. </li></ol> 3. Organotypische Fixation <ol><li> Entfernen ganzen organotypischen einschließlich Nylon Blatt von gut und setzen auf Frischhaltefolie. </li><li> Halbierung organotypischen und Nylon-Blatt mit einem sauberen Einmalskalpell und fixieren beide Hälften in Formaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Formaldehyd Ersetzen mit 70% ethanol nach 24 Stunden und lassen Sie über Nacht vor der Einbettung in Paraffin, Schneiden und Färben. </li></ol> 4. Laser Mikrodissektion des Invasive Margin <ol><li> Abschnitt bis 10 um-Dicke auf Membran Dias. </li><li> Entparaffinieren Abschnitte durch die Anwendung Xylol für 1 min, dann entfernen Xylol und fixieren in 75% Ethanol für eine weitere 1 min. </li><li> Entfernen Ethanol und Fleck mit 0,125% Kresylviolett Lösung für 1 min. Kresylviolett hebt Epithelzellen und erlaubt die einfache Unterscheidung von Stroma. </li><li> Entfernen Kresylviolett und gelten 100% Ethanol für eine weitere 1 min vor dem Spülen mit 100% Ethanol. Lassen Sie Folien an der Luft trocknen für 30 min. </li><li> Führen Lasermikrodissektion mit gewählten Plattform (zB Leica AS-System). </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger mit dem gefärbten Abschnitt, um sich auf den Mikroskoptisch mikrodissektiert Gesicht werden. </li><li> Montieren Sie eine 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in die Sammelkassette und 50 ulZell-Lyse-Puffer (z. B. DNA, RNA oder Protein-Lyse-Puffer) an der Kappe in die microdissected Gewebe zu sammeln. </li><li> Unter direkter Sicht mit dem Joystick, um Gewebe von Interesse zu identifizieren, und mit Hilfe der Software-Schnittstelle, kommentieren die gefärbte Bio-Ecke, Hervorhebung Zellen bei der Tumorinvasionsfront mikrodissektiert werden. </li><li> Weisen Sie den Laser zu feuern, die beide aus den markierten Bereich schneiden sollte und treiben mikrodissezierten Gewebe in der Kappe des Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Sobald genügend Material gesammelt worden ist, werfen Sie die Kassette Sammlung, schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen und Spin sanft, um die Lyse-Puffer auf den Boden der Röhre zu ziehen. </li><li> Zeigen Proben auf Eis, bis Mikrodissektion abgeschlossen ist. Verfahren Proben durch ein geeignetes Verfahren, um den Analyten von Interesse zu extrahieren. </li></ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li>
<li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+invasion+in+an+organotypic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li>
<li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li>
<li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li>
<li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li>
<li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+roads+to+maturity%3A+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+cells+and+snap+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li>
<li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren offenbaren keine potenziellen Interessenkonflikte.

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um spezifisch zu isolieren und zu charakterisieren, Tumorzellen, die die Fähigkeit, den Krebs Stroma in den frühesten Stadien der metastatische Fortschreiten in einer 3-dimensionalen Co-Kultur-Konstrukt von epithelialen und stromalen Zellen eindringen erworben. Co-Kultur-Modelle der CRC-Epithelzellen mit einem synthetischen Stroma enthält ex vivo menschlichen Kolon-Fibroblasten nebeneinander bestehen wurden verwendet, um CRC-Invasion in 3-Dimensio...

Organotypische Co-Kulturen sind Tissue-Engineering-Modelle, die Hilfe bei der Rekonstruktion der in vivo Tumor-Mikroumgebung in drei Dimensionen durch Nebeneinander malignen Epithelzellen und Stromazellen in einem Kollagen-Gel, die wesentliche Komponenten der extrazellulären Matrix 3.1. Hauptsächlich als ein Verfahren zur Messung der Tumorinvasion konzipiert, organotypics die Abhängigkeit von in vivo-Tiermodellen, und vermeiden die Nachteile der anderen in vitro-Techniken, wie Transwell-Assays, bei dem eindringenden Zellen künstlich in einem monodispersen Zustand 2-4 gedrückt. Die Einbeziehung von Stromazellen in diesen Modellen, wie Fibroblasten, spiegelt die wesentliche Rolle der Tumor-Mikroumgebung bei der Regulierung der Invasion und Metastasierung maligner 3-4, jedoch ist die phänotypische Heterogenität des Stroma ist derart, dass, um die physiologische Relevanz der organotypischen maximieren Modelle, organspezifische, anatomisch genaue ex vivoFibroblasten aufgenommen werden sollten, wo immer möglich 3,6. Organotypics sind eine vielseitige Plattform, um Interaktionen zwischen Tumor-und Stromazellen studieren und werden zunehmend in neue Wege, um die Auswirkungen auf die Tumor-Invasion von chemischen Inhibitoren und gezielten Genveränderungen 7,8 untersuchen eingesetzt. Das Studium der invasiven Tumorrand ist eine besonders aufregende Aussicht. In organotypischen Modellen etabliert Darmkrebs (CRC) Zelllinien in der Regel eine gut geschichtete Epithel, und im Querschnitt, Zellen, die die Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix (ECM) eindringen erworben haben, sind leicht erkennbar. Angesichts der etablierten Mikro-topographische Heterogenität von Tumor-und Tumor-assoziierten Stroma-Zellen in vivo, Extrahieren, diese Zellen mit Laser-Mikrodissektion und studiert sie in Isolation, können wichtige biologische Erkenntnisse über die Entstehung von Darmkrebs Metastasen zeigen, und wie kann es effizienter sein richtet. Ichn die folgende Methode, alle Patienten, die Gewebeproben eine schriftliche Einverständniserklärung, und die Studie wurde gespendet von den Institutionen regionaler Forschungsethikkommission genehmigt.

<table><tbody><tr><td>Darmkrebs-Zelllinien - Beispiel gezeigt SW480</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-228</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354265</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Nylonmembran</td><td>Merck Millipore</td><td>VVLP01300</td><td></td></tr><tr><td>Metallgitter</td><td>The Mesh Company</td><td>WSS20-A4</td><td></td></tr><tr><td>themeshcompany.com Laser Plattform für Mikrodissektion</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica AS LMD</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger mit Membran Molekulare</td><td>Bauelemente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet</td><td>Merck Millipore</td><td>1052350025</td><td></td></tr></tbody></table>

molecular profiling von der invasiven tumor-microenvironment in einem 3-dimensional model of colorectal cancer cells und<em&gt; ex-vivo-</em&gt; fibroblasten

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invasion Darmkrebs (CRC)-Zellen haben die Fähigkeit, aus ihrer Schwesterzellen zu befreien, das Stroma zu infiltrieren, und renovieren die extrazelluläre Matrix (ECM) erworben. Charakterisierung der Biologie dieser phänotypisch bestimmte Gruppe von Zellen könnte wesentlich unser Verständnis der frühen Ereignisse verbessern während der metastatischen Kaskade. Tumorinvasion ist ein dynamischer Prozess, durch bidirektionale Interaktion zwischen dem Epithel und malignem Krebs Stroma erleichtert. Um Zell-spezifische Antworten auf den Tumor-Stroma-Schnittstelle haben wir organotypischen Kokultur und Laser Mikrodissektion Techniken kombiniert untersuchen. Organotypische Modelle, in denen wichtige Bestandteile wie Stroma-Fibroblasten sind 3-dimentioanally co-kultiviert mit Krebs Epithelzellen, sind sehr manipulierbar experimentelle Werkzeuge, die Invasion und Krebs-Stroma-Interaktionen ermöglichen, in der Nähe von-ph studiert werdenysiological Bedingungen. Laser Mikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die chirurgische Präparation und Extraktion der verschiedenen Schichten im Tumorgewebe, mit Mikrometer-Präzision Niveau bringt. Durch die Kombination dieser Techniken mit genomischer, Transkriptom und epigenetische Profiling wollen wir zu einem tieferen Verständnis der molekularen Eigenschaften der Invasion von Tumorzellen und die umliegenden Stroma-Gewebe zu entwickeln, und dabei möglicherweise offenbaren neue Biomarker und Chancen für die Entwicklung von Medikamenten in CRC.

Wir haben das obige Verfahren, um mehrere Kombinationen von CRC-Zelllinien und Stromazellen aufgebracht. Ein Beispiel hier präsentiert wird, ist SW480 CRC epithelialen Zelllinien mit primären humanen ex vivo Darm Fibroblasten. 3-dimensionale Co-Kulturen sind zum Vergleich der unterschiedlich exprimierten miRNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorfront ausgebildet (Fig. 1), um Mikroskopie und Laser-Capture-Mikrodissektion (Fig. 2) unterzogen und durch microRNA (miRNA) Profili...

Molecular Profiling von Laser mikrodissektiert Zellen und Stroma aus synthetischen, Tissue-Engineering-Darmkrebs-Modelle stellt einen neuartigen Ansatz zur manipulierbaren und an der Schnittstelle zwischen Tumorzellen zu charakterisieren und zu sezieren die unverwechselbare Biologie an der invasiven Front und Krebs Stromazellen.

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die besondere Biologie an der Grenzfläche zwischen malignen epithelialen Zellen an der invasiven Tumorgrenze und tumorassoziierten stromalen Zellen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre Fibroblastenkulturen aus kolorektalen Implantaten etabliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, organotypische Kokultursysteme unter Verwendung primärer kolonischer Fibroblasten und kultivierter kolorektaler Krebszellen zu konstruieren.Als Nächstes werden organotypische Modelle in Formalin fixiert, auf Membranobjektträger geschnitten und mit Kristallviolett gefärbt. Der letzte Schritt ist die Laser-Mikrodissektion, um eindringende Tumorzellen von nicht eindringenden Tumorzellen und stromabildenden, tumorbegleitenden Zellen zu trennen. Schließlich können molekulare Profilierungstechniken eingesetzt werden, um die Biologie der eindringenden und nicht eindringenden Tumorzellen sowie der Stromazellen im umgebenden Tumormikromilieu zu charakterisieren.Die Idee zu dieser Methode entstand, als uns bewusst wurde, wie deutlich eindringende Zellen von nicht eindringenden Zellen in dreidimensionalen organotypischen Ko-Kulturmodellen des kolorektalen Karzinoms zu unterscheiden sind. Zunächst werden Proben von normalem menschlichem Kolonmukosagewebe direkt aus dem chirurgischen Operationssaal in das Labor geholt. Ein Präparat wird in die Mitte einer 10 cm großen Zellkulturschale gegeben und anschließend dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS, ergänzt mit Penicillin, Streptomycin und Fungi Zone, gewaschen.Aspirieren Sie nicht, nachdem Sie das Gewebe mit sterilen Pinzette und Skalpell in kleine Stücke geschnitten haben. Platzieren Sie dann jedes Stück in der Mitte eines mit der Skalpellklinge eingeritzten Kreuzes. In einer 12-Loch-Platte bewegen Sie das Skalpell vorsichtig über das Gewebe, um dessen Anheftung an die Kultur zu ermöglichen.Die Proben in 750 Mikroliter Primär-Fibroblasten-Wachstumsmedium, das das Gewebe bedecken, aber ein Aufschwimmen verhindern sollte. Danach die Proben für die nächsten fünf Tage in einen 37 Grad Celsius warmen, 5–10 % CO2 haltigen Inkubator stellen. Fibroblasten beginnen langsam, sich ab etwa sieben Tagen vom Rand des Gewebes aus auszuwachsen.Dies wird nach ungefähr drei bis vier Wochen deutlicher sichtbar sein. Und wenn ausreichend Fibroblasten ausgewandert sind, geben Sie 750 Mikroliter Trypsin zu jedem Well hinzu, nachdem sich die Zellen gelöst haben, und überführen Sie sie in einen T-25-Zellkulturgefäßkolben für das fibroblastenimprägnierte organotypische Gel. Bereiten Sie zunächst eine Fibroblastenzellsuspension mit 500.000 Zellen pro Gel in supplementiertem DMM vor.Stellen Sie die organotypischen Gele auf Eis in den im Textprotokoll angegebenen Verhältnissen für neun Gele mit je einem Milliliter her. Bereiten Sie 10 Milliliter vor und mischen Sie vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden. Geben Sie dann je einen Milliliter in jedes Brunnen einer 24-Loch-Platte und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre.Um den Gelen nach einer Stunde das Aushärten zu ermöglichen, geben Sie ein Milliliter ergänztes DMEM auf die Gelen und stellen Sie sie für die Nacht in den Inkubator zurück. Am folgenden Tag entfernen Sie das Medium vorsichtig von der Oberfläche der Gelen und geben ein Milliliter Medium mit 500.000 kolorektalen Karzinom-Epithelzellen auf die mit Gel beschichteten Nylonfolien. Bereiten Sie sterilisierte Nylonfolien mit einer Größe von 1,5 cm × 1,5 cm im Voraus unter Verwendung steriler Pinzetten vor. Legen Sie die erforderliche Anzahl an Nylonfolien in eine 10 cm große Kulturschale. Bereiten Sie die Gel-Mischung wie im Textprotokoll beschrieben auf Eis vor und geben Sie 0,1 molare Natronlauge zur Gel-Mischung hinzu, bis diese rosa wird, was darauf hinweist, dass die Lösung neutralisiert wurde.Fügen Sie dann 250 Mikroliter dieser Lösung zu jedem Nylonblatt hinzu. Anschließend 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren, damit das Gel aushärten kann. Danach 10 Milliliter einer 1 %igen Glutaraldehydlösung in PBS jedem 10 Zentimeter großen Kulturgefäß hinzufügen.Nachdem das Gel gestanden hat, vor der Inkubation bei vier Grad Celsius für eine Stunde, waschen Sie die Nylonfolien dreimal in PBS und einmal in supplementiertem DME. Inkubieren Sie die Folien über Nacht in demselben Puffer bei vier Grad Celsius, um die organotypischen Gele auf Stahlgittern für die Invasion anzubringen, und sterilisierte Gerüstgitter, die durch Falten von Edelstahlfolien in eine Dreibein-Formation vorbereitet wurden. Anschließend verwenden Sie Pinzette, sterilisiert und mit Ethanol behandelt, um ein Stahlgitter in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte zu legen.Legen Sie ein Gel mit beschichteter Nylonfolie mit der Kollagen-Seite nach oben auf jedes Raster. Übertragen Sie die organotypischen Gele vorsichtig mit einem Spatel, der sterilisiert und mit Ethanol behandelt wurde, von der 24-Loch-Platte auf die erhöhte Nylonfolie. Füllen Sie die Vertiefung mit supplementiertem D-Mem, bis die Nylonfolie mit dem Medium in Kontakt steht, aber nicht untergetaucht ist.Stellen Sie sicher, dass das Medium das organotypische Gel nicht berührt. Inkubieren Sie 14 Tage bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2. Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage.Entfernen Sie das gesamte organotypische Gewebe einschließlich der Nylonfolie aus der Mulde und legen Sie es auf eine Haftfolie. Halbieren Sie das organotypische Gewebe und die Nylonfolie mit einem sauberen Einweg-Skalpell und fixieren Sie beide Hälften 24 Stunden lang in Formaldehyd. Ersetzen Sie nach 24 Stunden bei Raumtemperatur den Formaldehyd durch 70 %igen Ethanol und belassen Sie dies über Nacht, bevor das Einbetten in Paraffin, das Schneiden von Schnitten und die Färbung zur Durchführung der Laser-Mikrodissektion erfolgt.Erster Abschnitt, das organspezifische Gewebe auf eine Dicke von 10 Mikrometern auf Membranobjektträgern schneiden. Nach der Behandlung der Schnitte gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll, bereiten Sie die Durchführung der Laser-Mikrodissektion unter Verwendung der gewählten Plattform vor. Legen Sie den Glasobjektträger mit dem zu mikrodissezierenden gefärbten Schnitt ein.Montieren Sie rückwärts auf der Mikroskoptischplatte ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in die Sammelkassette und geben Sie 50 Mikroliter Zelllysepuffer in die Kappe, in die das mikrodissektierte Gewebe unter direkter Sicht sammeln wird. Verwenden Sie den Joystick, um das gewünschte Gewebe zu identifizieren, und markieren Sie mithilfe der Software-Schnittstelle den gefärbten Organschnitt, wobei die Zellen am Tumorinvasionsrand hervorgehoben werden, die mikrodisseziert werden sollen. Geben Sie den Befehl an den Laser, zu feuern, wodurch der hervorgehobene Bereich ausgeschnitten und das mikrodissektierte Gewebe in die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens katapultiert wird.Fahren Sie mit der Verarbeitung der Proben durch eine geeignete Methode zur Extraktion des Analyten der Wahl fort. Hier werden Laser-Mikroschneide-Bilder von SW 480 Darmkrebszellen gezeigt, die in das organoide Stroma eindringen. Crestalviolett wird verwendet, um die epithelialen Darmkrebszellen hervorzuheben.Die invasiven Tumorislands werden anschließend definiert, bevor die Laser-Mikroschneide erfolgt und das geschnittene Fragment auf ein Sammelgerät übertragen wird. Nicht-invasive Zellen und stromale Zellen werden mit derselben Methodik identifiziert und isoliert. Die dreidimensionalen Ko-Kulturen wurden mittels Mikro-RNA-Profilanalyse untersucht, um die unterschiedlich exprimierten Mikro-RNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorgrenze und Zellen in den geschichteten Tumorzonen zu vergleichen.Die Daten wurden nach vollständiger Veränderung und Datenwerten, die um den Faktor zwei erhöht oder verringert waren, sortiert. Die Veränderungen aus einem repräsentativen Experiment werden dargestellt und zeigen die unterschiedliche Expression von micro-RNA-Genen zwischen Zellen am invasiven und am nicht-invasiven Rand. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anatomisch angemessene organotypische Modelle aufbaut und wie man mittels Lasermikrodissektion einzelne Zellpopulationen für weitere Untersuchungen isoliert. Whoa.

molecular-profiling-invasive-tumor-microenvironment-3-dimensional

Research

Forschung

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Medicine

Medizin

Wir beschrieben ein Verfahren für die Zerlegung von Darmkrebs (CRC), lebensfähige einzelne Zellen, die dann auf kundenspezifische Antikörper Microarrays erkennen Oberflächen-Antigene (DotScan CRC-Microarray) erfasst zu produzieren. Sub-Populationen von Zellen gebunden, die Microarray kann durch Fluoreszenz-Multiplexing mit monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert profiliert werden.

Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

Wir haben 3D-Kokultur-Modelle für Live-Cell-Imaging entwickelt in Echtzeit von Interaktionen zwischen Brust-Tumor-Zellen und andere Zellen in ihrer Mikroumgebung, die Einfluss auf Progression zu einem invasiven Phänotyp. Diese Modelle können als Bildschirme für präklinische Arzneimittel auf parakrine-induzierte proteolytische, Chemokin / Zytokin-und Kinase-Signalwege in Invasivität-Ziels dienen.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

Das Video beschreibt die Laserdissektion des 3D-organotypischen Co-Kulturmodells mit Präzision im Mikrometerbereich. In organotypischen 3D-Modellen werden stromale Bestandteile wie Fibroblasten 3-dimensional mit Krebsepithelzellen kokultiviert. Das 3D-Modell dient als experimentelles Werkzeug, mit dem Invasion und Krebs-Stroma-Wechselwirkungen unter nahezu physiologischen Bedingungen untersucht werden können.

Lasermikrodissektion: Eine Technik zur Isolierung eindringender Darmkrebszellen aus einem organotypischen 3D-Kulturmodell

Gewebezüchtungen Fibroblasten-nativen Matrix ist eine aufstrebende Werkzeug, um eine Stroma-Substrat, das epitheliale Zellproliferation und Differenzierung unterstützt generieren. Hier wird ein Protokoll gemäß dieser Methode die Auswirkung verschiedener stromalen Zelltypen auf Tumor Zellbiologie Beurteilung vorgelegt.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung von 3D-Brustkrebs-Surrogaten, die mit einem Perfusionsbioreaktorsystem kultiviert werden können, um Sauerstoff und Nährstoffe zu liefern. Nach dem Wachstum werden Surrogate fixiert und zu Paraffin verarbeitet, um die interessierenden Parameter zu bewerten. Die Auswertung eines solchen Parameters, der Zelldichte, wird erläutert.

Herstellung und Analyse von<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates

Hier beschreiben wir eine dreidimensionale Kultur-Methode, um die Morphologie des primären Brustkrebs-Zellen, sowie deren direkte/indirekte Wechselwirkungen mit Monozyten und die Ergebnisse wie Kollagen-Abbau, Immunzelle Rekrutierung, Zelle studieren analysieren Invasion, und Förderung der Krebs-in Verbindung stehenden Entzündung.

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Erfahren Sie die molekulare Charakterisierung invasiver Tumorzellen und Stromazellen mittels Laser-Mikrodissektion in einem 3D-Organotyp-Modell des kolorektalen Karzinoms. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen der Tumor-Mikroumgebung.

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und Ex-vivo- Fibroblasten (Video) | JoVE Journal

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und

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