Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und Ex-vivo- Fibroblasten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die charakteristische Biologie an der Schnittstelle zwischen malignen Epithelzellen an der invasiven Tumorfront und krebsassoziierten Stromazellen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre Fibroblastenkulturen aus Dickdarmimplantaten etabliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, organotypische Co-Kulturmodelle unter Verwendung von primären Kolonfibroblasten und kultivierten Darmkrebszellen zu konstruieren.

Als nächstes werden organotypische Modelle in Formin fixiert, auf membrankaschierte Objektträger geschnitten und mit krestalem Violett gefärbt. Der letzte Schritt ist die Lasermikrodissektion, um eindringende Tumorzellen von nicht eindringenden Tumorzellen und krebsassoziierten Stromazellen zu trennen. Letztendlich können molekulare Profiling-Techniken verwendet werden, um die Biologie von eindringenden und nicht eindringenden Tumorzellen und Stromazellen in der umgebenden Tumormikroumgebung zu charakterisieren.

Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir feststellten, wie klar in dreidimensionalen organotypischen Co-Kulturmodellen des Darmkrebses eindringende Zellen von nicht eindringenden Zellen unterscheidbar sind. Entnehmen Sie zunächst Proben von normalem Gewebe der menschlichen Dickdarmschleimhaut direkt aus dem chirurgischen Operationssaal im Labor. Legen Sie eine Probe in die Mitte einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale und waschen Sie die Kultur dann dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS, die mit Penicillin, Streptomycin und Pilzzone ergänzt wird.

Nach der letzten Wäsche nicht mit steriler Pinzette und Skalpell aspirieren, sondern das Gewebe in kleine Stücke schneiden. Lege dann jedes Stück in die Mitte eines Kreuzes, das mit der Skalpellklinge gezeichnet wird. Bewegen Sie das Skalpell in einer 12-Well-Platte sanft über das Gewebe, damit es an der Kultur haften kann.

Die Proben in 750 Mikroliter primäres Fibroblasten-Wachstumsmedium, das das Gewebe untertauchen soll, ohne es schwimmen zu lassen. Legen Sie die Proben dann in den nächsten fünf Tagen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf bis 10 % CO2. Fibroblasten beginnen mit etwa sieben Tagen langsam aus dem Rand des Gewebes herauszuwachsen.

Dies wird nach etwa drei bis vier Wochen sichtbarer sein. Und wenn genügend Fibroblasten herauswachsen, fügen Sie 750 Mikroliter Trypsin in jede Vertiefung hinzu, nachdem sich die Zellen abgelöst haben, und übertragen Sie sie in einen T 25-Gewebekulturkolben für das mit Fibroblasten imprägnierte organotypische Gel. Bereiten Sie zunächst eine Fibroblasten-Zellsuspension vor, die 500.000 Zellen pro Gel in supplementiertem dmm enthält.

Konstituieren Sie die organotypischen Gele auf Eis in den Verhältnissen, die im Textprotokoll für neun Gele zu einem Milliliter pro Gel gefunden sind. Bereiten Sie 10 Milliliter vor und mischen Sie vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Geben Sie dann einen Milliliter in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre.

Damit die Gele nach einer Stunde fest werden, geben Sie einen Milliliter supplementiertes DM EM auf die Gele und kehren Sie über Nacht in den Inkubator zurück. Am nächsten Tag. Aspirieren Sie das Medium von der Oberseite der Gele und plättieren Sie einen Milliliter des Mediums, das 500.000 Darmkrebs-Epithelzellen für die gelbeschichteten Nylonfolien enthält.

Bereiten Sie im Voraus mit einer sterilen Pinzette sterile Autoklaven mit einer Größe von 1,5 x 1,5 Zentimetern vor. Legen Sie die erforderliche Anzahl von Nylonblättern in eine 10 Zentimeter große Kulturschale. Bereiten Sie die Gelmischung auf Eis vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und fügen Sie der Gelmischung 0,1 molare Natriumhydroxid hinzu, bis sie rosa wird, was anzeigt, dass die Lösung neutralisiert wurde.

Geben Sie dann 250 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Nylonplatte. Dann bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 für 30 Minuten inkubieren, damit das Gel fest werden kann. Geben Sie anschließend 10 Milliliter einer 1%igen Glutaraldehydlösung in PBS in jede 10-Zentimeter-Kulturschale.

Sobald das Gel ausgehärtet ist, bevor es eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubiert wird, waschen Sie die Nylonblätter dreimal in PBS und einmal in zugesetztem DME. Inkubieren Sie die Bleche über Nacht im gleichen Puffer bei vier Grad Celsius, um die organotypischen Gele auf Stahlgitter für die Invasion zu heben sterilisierte Gerüstgitter, die durch Falten von Edelstahlblechen in eine Dreibeinformation vorbereitet wurden. Verwenden Sie dann eine Pinzette, sterilisiert und Ethanol, um ein Stahlgitter in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu platzieren.

Legen Sie ein mit Gel beschichtetes Nylonblatt mit der Kollagenseite nach oben auf jedes Gitter. Übertragen Sie die organotypischen Gele vorsichtig mit einem Spatel, sterilisiert und mit Ethanol von der 24-Well-Platte auf die erhabene Nylonfolie. Füllen Sie die Vertiefung mit zugesetztem D mem, bis die Nylonfolie mit dem Medium in Berührung kommt, aber nicht untergetaucht ist.

Achten Sie darauf, dass das Medium das organotypische Gel nicht berührt. Inkubieren Sie 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2. Das Medium wird alle zwei Tage gewechselt.

Nehmen Sie die gesamte organotypische Folie einschließlich Nylonfolie aus der Vertiefung und legen Sie sie auf eine Frischhaltefolie. Halbieren Sie die organotypische Folie und die Nylonfolie mit einem sauberen Einwegskalpell und fixieren Sie beide Hälften 24 Stunden lang in Formaldehyd. Bei Raumtemperatur Formaldehyd nach 24 Stunden durch 70%iges Ethanol ersetzen und über Nacht einwirken lassen, bevor es in Paraffin einbettet, geschnitten und gefärbt wird, um eine Lasermikrodissektion durchzuführen.

Erster Abschnitt, der organotypische bis 10 Mikrometer Dicke auf membrangelagerte Objektträger. Nach der Behandlung der Schnitte, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie sich auf die Durchführung der Lasermikrodissektion mit der gewählten Plattformform vor. Platzieren Sie den Objektträger mit dem zu präparierenden Fleckenteil.

Setzen Sie mit der Vorderseite nach unten auf dem Mikroskoptisch ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in die Entnahmekassette ein und geben Sie 50 Mikroliter Zelllysepuffer in die Kappe, in der sich das mikropräparierte Gewebe unter direkter Sicht sammelt. Verwenden Sie den Joystick, um das interessierende Gewebe zu identifizieren, und kommentieren Sie über die Softwareschnittstelle den gefärbten organischen Abschnitt, wobei Sie Zellen hervorheben, die an der Tumorinvasionsfront mikrodiseziert werden sollen. Weisen Sie den Laser an, zu feuern, wodurch sowohl der markierte Abschnitt ausgeschnitten als auch das Mikrodissektionsgewebe in die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens geschleudert werden sollte.

Fahren Sie mit der Verarbeitung der Proben nach einer geeigneten Methode fort, um den interessierenden Analyten zu extrahieren. Hier sind Lasermikrodissektionsbilder von SW 480 kolorektalen Krebszellen zu sehen, die in das organotypische Stroma eindringen. Krestalviolett wird verwendet, um die Epithelzellen des Darmkrebses hervorzuheben.

Anschließend werden die invasiven Tumorinseln definiert, bevor die Laserdissektion erfolgt und das geschnittene Stück zu einem Entnahmegerät transportiert wird. Nicht eindringende Zellen und Stromazellen werden mit der gleichen Methodik identifiziert und isoliert. Die dreidimensionalen Kokulturen wurden mittels microRNA-Profiling analysiert, um differentiell exprimierte microRNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorfront und denen in den geschichteten Tumorzonen zu vergleichen.

Die Daten wurden nach vollständiger Änderung sortiert und die Datenwerte plus oder minus zweifach. Es werden Veränderungen gegenüber einem repräsentativen Experiment vorgestellt, die eine differentielle Mikro-RNA-Genexpression zwischen den invasiven Randzellen und den nicht-invasiven Randzellen zeigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man anatomisch geeignete organotypische Modelle konstruiert und wie man die Lasermikrodissektion verwendet, um einzelne Zellpopulationen für weitere Studien zu isolieren. Whoa.