Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die exakten Positionen integrierender viraler Vektoren im Genom zu identifizieren. Dies wird durch eine initiale lineare PCR-Reaktion mit biotinylierten Primern erreicht, um in einer Reihe von Reaktionen an fester Phase Sequenzen der Vektor-Genom-Übergänge aus genomischer DNA anzureichern; dabei entstehen doppelsträngige DNA-Moleküle mit bekannten DNA-Sequenzen an beiden Enden des Produkts, was eine exponentielle Amplifikation der Vektor-Genom-Übergänge ermöglicht. Anschließend werden Sequenzieradapter an die LAM-PCR-Produkte eingefügt.

Um die unbekannte flankierende DNA mittels Tiefensequenzierung zu sequenzieren und zu charakterisieren, zeigen diese Fragmente die exakten Positionen der Vektorintegrationen auf. Das Ergebnis ist eine Vielfalt amplifizierter Übergänge, wie sie mittels Gelelektrophorese sichtbar werden. Diese Methode liefert Einblicke in die Verteilung der Integrationsstellen von Virenvektoren bei Patienten in der klinischen Gentherapie.

Sie kann auch auf andere Studien angewendet werden, wie beispielsweise Insertions-, Mutagenese-Screens, Virusinfektionen, Krebs, sowie Klonalitätsanalysen von Stammzellen oder die Untersuchung der T-Zell-Diversität. Das Verfahren wird durchgeführt von Ina RA, einer Technikerin aus meinem Labor. Für dieses Verfahren bereiten Sie zunächst die Linkerkassetten vor, indem Sie 40 Mikroliter jeder der beiden LCO-Legos mit 110 Mikrolitern Tris-Hydrochlorid und 10 Mikrolitern Magnesiumchlorid in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Anschließend setzen Sie die Mischung zur Inkubation auf einen 95 °C heißen Block für fünf Minuten und kühlen sie danach langsam über Nacht auf Raumtemperatur ab.

Am nächsten Tag 300 Mikroliter Wasser zu dem hergestellten doppelsträngigen Linker-DNA hinzufügen und über ein Mikrozentrifugenröhrchen filtrieren. Den Filter kurz zentrifugieren, um die konzentrierte Linker-DNA im Ouit zu sammeln. Danach das Ouit vom Filter zurückgewinnen.

Geben Sie 80 Mikroliter Wasser zur Ouit hinzu und pipettieren Sie 10-Mikroliter-Aliquote in PCR-Röhrchen. Verwenden Sie PCR, um die Vektorgenom-Übergänge in 50-Mikroliter-Reaktionsröhrchen für Lamm vorzuverstärken.

Fügen Sie zwischen einem Nanogramm und einem Mikrogramm Proben-DNA pro 50-Mikroliter-Reaktion hinzu. Verwenden Sie für NR-Lamm mindestens 100 Nanogramm DNA. Fügen Sie nicht mehr als 25 Mikroliter hinzu und führen Sie die PCR gemäß Tabelle zwei im Text durch.

Und nach Fertigstellung 0,5 Mikroliter Tech zu jeder Reaktion hinzufügen und das PCR-Programm ein zweites Mal durchführen. Bereiten Sie zunächst die magnetischen Kügelchen vor. Geben Sie 20 Mikroliter mit streptavidinbeschichteten magnetischen Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie diese eine Minute lang bei Raumtemperatur auf den Magnetenabscheider.

Danach den überstehenden Überstand verwerfen. Die Kügelchen in 40 Mikrolitern PBS mit BSA resuspendieren und die Kügelchen erneut eine Minute lang auf den Trennmagneten stellen. Den Überstand durch eine 20-Mikroliter-Waschung mit dreimolarer Lithiumchloridlösung ersetzen.

Erneut die Perlen eine Minute lang auf den Trennmagneten stellen. Zum Abschluss den Überstand durch 50 Mikroliter einer sechs Molaren Lithiumchloridlösung ersetzen. Nun die magnetische Perlenmischung zum Produkt der PCR-Reaktion hinzufügen und das Gemisch zwei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubieren lassen.

Die biotinylierten DNA-Stränge und die beschichteten Perlen bilden Komplexe, die bei vier Grad Celsius bis zu vier Tage lang gelagert werden können. Fahren Sie mit LAMP oder NR-LAMP fort, aufgrund der hohen Empfindlichkeit. LAMP-PCR ist anfällig für Kontaminationen, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt wird.

Das ist ein PCR-geeignetes Umfeld. Besondere Aufmerksamkeit auf Sauberkeit ist von größter Bedeutung. Um die unbekannte flankierende DNA erfolgreich zu amplifizieren, ohne die Proben zu kontaminieren, setzen Sie die Komplexe zunächst eine Minute lang dem Separator aus und resuspendieren Sie die DNA-Perlen in 100 Mikrolitern Wasser.

Als Nächstes setzen Sie die Komplexe eine Minute lang dem Separator aus. Dieses Mal resuspendieren Sie die DNA-Perlen-Komplexe in einer Mischung mit 8,25 µL Wasser, 1 µL HEXA-Nukleotidpuffer, einem Viertel µL dDNTPs und einer halben µL Cano-Polymerase.

Inkubieren Sie dieses Gemisch eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend 90 Mikroliter Wasser hinzufügen und die Reaktion weitere eine Minute dem Separator aussetzen. Danach die DNA-Perlen-Komplexe in einer 100-Mikroliter-Waschung mit Wasser resuspendieren.

Verwenden Sie den Separator eine weitere Minute und bereiten Sie die Restriktionsenzymreaktion vor. Nach dem Entfernen des Überstandes geben Sie 8,5 Mikroliter Wasser, ein Mikroliter Restriktionspuffer und ein halbes Mikroliter des Restriktionsenzyms hinzu.

Bei der Auswahl des Restriktionsenzyms sicherstellen, dass es keine Schnittstellen innerhalb oder stromabwärts der primeren Bindungsstelle aufweist, die in der Vorverstärkungsreaktion verwendet wurde. Nach einer einstündigen Inkubation der Enzyme bei der idealen Temperatur 90 Mikroliter Wasser hinzufügen. Eine Minute lang zentrifugieren und die BDNA-Komplexe in 100 Mikroliter Wasser waschen und resuspendieren.

Wiederholen Sie die Trennung und bereiten Sie die Ligationsreaktion vor. Geben Sie zu den Kügelchen fünf Mikroliter Wasser, ein Mikroliter 10 x Fast-Link-Puffer, ein Mikroliter TP, ein Mikroliter Fast-Link-DNA-Ligase und ein Mikroliter der zu Beginn des Verfahrens hergestellten Linkerkassette hinzu.

Lassen Sie diese Reaktion fünf Minuten bei Raumtemperatur laufen. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 90 Mikrolitern Wasser und Trennen der Perlen, gefolgt von einer Wäsche mit 100 Mikrolitern Wasser. Führen Sie anschließend eine weitere Trennung durch, um die synthetisierte DNA zu denaturieren, resuspendieren Sie die Perlen in fünf Mikrolitern 0,1 normaler Natronlauge und lassen Sie das Gemisch fünf Minuten bei Raumtemperatur schütteln.

Trennen Sie anschließend die Komplexe eine Minute lang und sammeln Sie das SUP Natin, das die vorverstärkte Vektorgenom-Übergangsstelle enthält. Fahren Sie unverzüglich mit der exponentiellen Amplifikation fort oder lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius. Beginnen Sie damit, die Komplexe eine Minute lang dem Separator auszusetzen.

Und resuspendieren Sie die DNA-Perlen in 100 Mikrolitern Wasser. Trennen Sie sie erneut und entfernen Sie den Überstand. Für die Ligationsreaktion geben Sie 6,5 Mikroliter Wasser, ein Mikroliter CircLigase und 10× Reaktionspuffer hinzu.

Ein halbes Mikroliter Magnesiumchlorid, ein halbes Mikroliter eines TP, ein Mikroliter SS-Linker-Oligos und ein halbes Mikroliter CirLigase. Nach einer Stunde bei 60 Grad Celsius die Reaktion mit 90 Mikrolitern Wasser beenden, die Perlen mithilfe des Perlenabscheiders resuspendieren und in weitere 100 Mikroliter Eins suspendieren, erneut den Abscheider verwenden und die Waschkomplexe in 10 Mikrolitern Wasser sammeln. Beginnen Sie mit der Herstellung einer PCR-Master-Mix-Lösung, wie in Tabelle drei des Textes beschrieben.

Geben Sie 48 Mikroliter Mastermix zu zwei Mikrolitern LAMB- oder NR-LAMB-Produkten in 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen hinzu, und führen Sie die PCR wie im Text zuvor beschrieben durch. Bereiten Sie mehr Strept in Perlen vor, und resuspendieren Sie diese in sechs molarer Lithiumchloridlösung. Verwenden Sie 20 Mikroliter für LAMB oder 50 Mikroliter für NR-LAMB. Anschließend Perlen in gleichem Volumen zu den PCR-Reaktionsprodukten hinzufügen und die Mischung auf einem Schüttler bei 300 U/min für zwei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Den DNA-Perlen-Komplex gewinnen und wie zuvor gezeigt mit 100 Mikrolitern Wasser waschen.

Suspendieren Sie nun den Komplex in 0,1 normaler Natriumhydroxidlösung und inkubieren Sie die Kügelchen 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Danach setzen Sie die Kügelchen eine Minute lang dem Trennmagneten aus und sammeln den Überstand, der die amplifizierte DNA enthält, in einem neuen Gefäß. Verwenden Sie als Vorlage die amplifizierte DNA und führen Sie mit zwei Mikrolitern davon eine PCR gemäß Tabelle vier im Text durch.

Die Produkte durch Gelelektrophorese sichtbar machen, um sie zu reinigen. 40 Mikroliter davon mit 44 Mikrolitern der bei Raumtemperatur befindlichen AMPure XP-Magnetkugeln mischen und fünf Minuten lang inkubieren. Anschließend die Kugeln zwei Minuten lang auf dem Magneten separieren.

Nach dem Entfernen des Überstandes die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern 70%igem Ethanol waschen und anschließend die Kügelchen in 30 Mikrolitern Wasser unter Verwendung von 40 Nanogramm DNAA-Fusionsprimer resuspendieren. PCR kann verwendet werden, um sequenzierungsspezifische Adapter hinzuzufügen. Einzelheiten sind in Tabelle fünf angegeben.

Überprüfen Sie die Produkte im Gel. Die Betrachtung der Ergebnisse der LAMB-PCR mittels hochauflösender Gelelektrophorese ist im Vergleich die beste Wahl für die diagnostische Analyse. Obwohl auch 2 % Agarose funktioniert, eignet sie sich nicht so gut.

Klonalität von NR LAMB, PCR-Produkte können nicht visuell diagnostiziert werden. Ein 2 % Agarosegel ist jedoch vollkommen ausreichend, um den Erfolg des Protokolls zu bestimmen. Nach der Sequenzierung der PCR-Produkte kann die Position der Vektoren im Wirts-Genom ermittelt werden.

Aus diesen Daten ist es möglich, die Positionen der Insertionsstellen in kodierenden Bereichen sowie in der Nähe von Transkriptionsstartstellen nach der Entwicklung der Methode zu dokumentieren. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Gentherapie den Weg, die Biosicherheit von Genübertragungsvektoren sowohl in präklinischen Modellen als auch in klinischen Gentherapie-Studien zu untersuchen.