Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die genauen Positionen der Integration viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren. Dies wird durch eine initiale lineare PCR-Reaktion mit biotinylierten Primern zur Anreicherung von Vektorgenom-Junction-Sequenzen aus genomischer DNA in der Festphase erreicht. In einer Reihe von Reaktionen wird doppelsträngige DNA mit bekannten DNA-Sequenzen an beiden Enden des Produkts erzeugt, was eine exponentielle Amplifikation von Vektorgenom-Junctions ermöglicht. Als nächstes werden Sequenzierungsadapter in Lamm-PCR-Produkte integriert.

Um die unbekannte flankierende DNA mit Tiefensequenzierung zu sequenzieren und zu charakterisieren, zeigen diese Fragmente die genauen Positionen der Vektorintegrationen. Das Ergebnis ist eine Vielfalt von amplifizierten Kontakten, wie sie durch Gelelektrophorese betrachtet werden. Diese Methode gibt Aufschluss über die Verteilung der viralen Vektorintegrationsstelle bei klinischen Gentherapie-Patienten.

Es kann auch auf andere Studien angewendet werden, wie z. B. Insertion, Mutagenese, Screenings, Virusinfektion, Krebs und Stammzellklonalität oder T-Zell-Diversität. Das Verfahren wird von ina RA, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert. Für dieses Verfahren bereiten Sie zunächst die Linkerkassetten vor: Mischen Sie je 40 Mikroliter der beiden LCO-Legos mit 110 Mikrolitern Trishydrochlorid und 10 Mikroliter Magnesiumchlorid in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie die Mischung dann fünf Minuten lang auf einem 95 Grad Celsius heißen Block ein und kühlen Sie sie dann über Nacht langsam auf Raumtemperatur ab.

Geben Sie am nächsten Tag 300 Mikroliter Wasser in den vorbereiteten doppelsträngigen Linker, DNA, und filtrieren Sie sie über ein Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie den Filter herunter, um die konzentrierte Linker-DNA im Ouit zu sammeln. Stellen Sie als Nächstes das Ouit aus dem Filter wieder her.

Geben Sie 80 Mikroliter Wasser in den Ausgang und pipettieren Sie 10 Mikroliter Aliquote in PCR-Röhrchen. Verwenden Sie die PCR, um die Vektorgenomverbindungen in 50-Mikroliter-Reaktionsröhrchen für Lammfleisch vorzu amplifizieren.

Fügen Sie zwischen einem Nanogramm und einem Mikrogramm Proben-DNA pro 50-Mikroliter-Reaktion hinzu. Verwenden Sie für NR-Lammfleisch mindestens 100 Nanogramm DNA. Fügen Sie nicht mehr als 25 Mikroliter hinzu und führen Sie die PCR gemäß Tabelle zwei im Text aus.

Und wenn Sie fertig sind, fügen Sie jeder Reaktion weitere 0,5 Mikroliter Technologie hinzu und führen Sie das PCR-Programm ein zweites Mal durch. Bereiten Sie zunächst die magnetischen Kügelchen vor. Geben Sie 20 Mikroliter Stepp-ENC-beschichtete Magnetkügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur auf den Magnetkügelchenseparator

Lege dann den überstehenden Raise ab. Suspendieren Sie die Kügelchen in 40 Mikrolitern PBS mit BSA und legen Sie die Kügelchen für eine weitere Minute wieder auf den Separator. Ersetzen Sie den Überstand durch eine 20-Mikroliter-Wäsche mit drei molaren Lithiumchloridlösung.

Legen Sie die Perlen erneut für eine Minute auf den Separator. Zum Schluss den Überstand durch 50 Mikroliter sechsmolare Lithiumchloridlösung ersetzen. Geben Sie nun die magnetische Bead-Mischung zum Produkt der PCR-Reaktion und lassen Sie diese Mischung zwei Stunden lang bis über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.

Die biotinylierte DNA und die Streifen-Tava- und beschichteten Kügelchen bilden Komplexe, die bis zu vier Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden können. Fahren Sie mit Lamm oder NR-Lamm aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit fort. L-A-M-P-C-R ist anfällig für Kontaminationen, wenn es sorgfältig ausgeführt wird.

Das ist eine PCR-Umgebung. Und besonderes Augenmerk auf Sauberkeit von größter Bedeutung. Um die unbekannte flankierende DNA erfolgreich zu amplifizieren, ohne die Proben zu kontaminieren, setzen Sie zunächst die Komplexe einer Minute lang dem Separator aus und reanimieren Sie die DNA-Kügelchen in 100 Mikrolitern Wasser.

Machen Sie anschließend die Komplexe eine Minute lang für den Separator verfügbar. Und dieses Mal resuspendieren Sie die DNA-Kügelchenkomplexe in einer Mischung mit 8,25 Mikrolitern Wasser. Ein Mikroliter HEXA-Nukleotidpuffer, ein Viertel Mikroliter D DN NTPs und ein halber Mikroliter Canopolymerase.

Inkubieren Sie diese Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann 90 Mikroliter Wasser hinzu und setzen Sie die Reaktion dem Separator für eine weitere Minute aus. Dann resuspendieren Sie die DNA-Kügelchenkomplexe in einer 100-Mikroliter-Wäsche mit Wasser.

Verwenden Sie den Separator für eine weitere Minute und bereiten Sie die Restriktionsenzymreaktion vor. Nach Entfernen des Überstands. Fügen Sie 8,5 Mikroliter Wasser, einen Mikroliter Restriktionsenzympuffer und einen halben Mikroliter des Restriktionsenzyms hinzu.

Bei der Auswahl des Restriktionsenzyms ist darauf zu achten, dass es keine Stellen in oder hinter der primären Bindungsstelle hat, die in der Preem-Amplifikationsreaktion verwendet wird. Nachdem Sie die Enzyme eine Stunde lang bei der idealen Temperatur reagieren ließen, fügen Sie 90 Mikroliter Wasser hinzu. Verwenden Sie einen Separator für eine Minute und resuspendieren Sie die BDNA-Komplexe in einer Wäsche von 100 Mikrolitern Wasser.

Wiederholen Sie die Trennung und bereiten Sie die Ligationsreaktion vor. Füge den Kügelchen fünf Mikroliter Wasser hinzu, einen Mikroliter 10 x Fast Link Buffer. Ein Mikroliter eines TP, ein Mikroliter Fast-Link-DNA-Ligase und ein Mikroliter der Linkerkassette, die zu Beginn des Eingriffs hergestellt wird.

Lassen Sie diese Reaktion fünf Minuten lang bei Raumtemperatur laufen. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 90 Mikroliter Wasser hinzufügen und die Kügelchen trennen, gefolgt von einem Waschen in 100 Mikrolitern Wasser. Und dann eine weitere Trennung, um die synthetisierte DNA zu denaturieren, die Kügelchen in fünf Mikrolitern 0,1 normalem Natriumhydroxid resuspendieren und die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur schütteln zu lassen.

Trennen Sie dann die Komplexe für eine Minute und sammeln Sie das SUP-Natin, das die preemamplifizierte Vektorgenomverbindung enthält. Fahren Sie sofort mit der exponentiellen Verstärkung fort oder lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Beginnen Sie damit, die Komplexe eine Minute lang dem Separator auszusetzen.

Und Wiederbelebung, bei der die DNA-Kügelchen in 100 Mikrolitern Wasser suspendiert werden. Und trennen Sie sie wieder und entfernen Sie den Überstand. Für die Ligationsreaktion werden 6,5 Mikroliter Wasser, ein Mikroliter circ Ligase, 10 x Reaktionspuffer zugegeben.

Ein halber Mikroliter Magnesiumchlorid, ein halber Mikroliter eines TP, ein Mikroliter SS-Linker-Oligos und ein halber Mikroliter Cir-Ligase. Nach einer Stunde bei 60 Grad Celsius beenden Sie die Reaktion mit 90 Mikrolitern Wasser unter Verwendung des Bead-Separators Resus, suspendieren Sie die Kügelchen in weiteren 100 Mikrolitern von einem, verwenden Sie den Separator erneut und sammeln Sie die Waschkomplexe in 10 Mikrolitern Wasser. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines PCR-Mastermixes, wie in Tabelle drei des Textes beschrieben.

Geben Sie 48 Mikroliter Mastermix zu zwei Mikrolitern Lamm- oder NR-Lammfleischprodukten in 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen und führen Sie die PCR wie im Text beschrieben wie zuvor durch, bereiten Sie weitere in Kügelchen enthaltene Kügelchen vor und resuspendieren Sie sie in sechs molaren Lithiumchlorid. Verwenden Sie 20 Mikroliter für Lamm oder 50 Mikroliter für NR-Lamm. Fügen Sie dann Kügelchen zum gleichen Volumen an PCR-Reaktionsprodukten hinzu und inkubieren Sie sie auf einem Shaker bei 300 U/min für zwei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur, sammeln Sie den DNA-Kügelchenkomplex und waschen Sie ihn mit 100 Mikrolitern Wasser, wie zuvor gezeigt.

Suspendieren Sie nun den Komplex in 0,1 % normalem Natriumhydroxid und inkubieren Sie die Kügelchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Setzen Sie dann die Kügelchen eine Minute lang dem Separator aus und sammeln Sie den Überstand mit der amplifizierten DNA in einem neuen Röhrchen. Verwenden Sie die amplifizierte DNA als Vorlage und verwenden Sie zwei Mikroliter davon, um eine PCR durchzuführen, wie in Tabelle vier des Textes beschrieben.

Visualisieren Sie die Produkte durch Gelelektrophorese, um die Produkte zu reinigen. Mischen Sie 40 Mikroliter davon mit 44 Mikrolitern Raumtemperatur am reinen XP-Magnetkügelchen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Trennen Sie dann die Kügelchen für zwei Minuten auf dem Magneten.

Nach dem Entfernen des Überstands waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern 70 % Ethanol und resuspendieren Sie dann die Kügelchen und 30 Mikroliter Wasser mit 40 Nanogramm DNAA-Fusionsprimer. Die PCR kann verwendet werden, um sequenzierungsspezifische Adapter hinzuzufügen. Einzelheiten sind in der fünften Tabelle aufgeführt.

Überprüfen Sie die Produkte auf einem Gel. Die Betrachtung der Ergebnisse der Lamm-PCR durch hochauflösende Gelelektrophorese ist im Vergleich dazu die beste Wahl für die diagnostische Analyse. 2%aros funktioniert zwar auch, aber nicht so gut.

Die Klonalität von NR LAMB, PCR-Produkten kann nicht visuell diagnostiziert werden. Ein 2%iges Agros-Gel ist jedoch völlig ausreichend, um den Erfolg des Protokolls zu bestimmen. Nach der Sequenzierung der PCR-Produkte kann die Position der Vektoren im Wirtsgenom gefunden werden.

Aus diesen Daten ist es möglich, die Positionen der Insertionsstellen in kodierenden Regionen und in der Nähe der Transkriptionsstartstellen nach ihrer Entwicklung zu protokollieren. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Gentherapie den Weg, um die Biosicherheit von Gentransfervektoren sowohl in präklinischen Modellen als auch in klinischen Gentherapiestudien zu untersuchen.