Ein In-vitro- Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die einzigartige Umwandlung von Mikroglia in GLO-Zellen in Gegenwart des Toxins Cyclin zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem Deckgläser zunächst mit extrazellulären Matrixproteinen beschichtet werden. Im zweiten Schritt werden Gliazellen auf die Deckgläser plattiert, dann werden den Kulturen Cyclin- und Latexkügelchen verabreicht.

Im letzten Schritt werden die Zellen immunchemisch gefärbt. Letztendlich können die Auswirkungen des Cyclins auf die Keimbildung und die phagozytäre Fähigkeit der Mikrogliazellen durch Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Mikrogliazelllinien besteht darin, dass die Verwendung von primären Gliakulturen die hypothetischen Wechselwirkungen zwischen I-Astrozyten und Mikroglia in Gehirnen von Personen mit GLO-Void-Cell-Leukodystrophie oder GLD nachahmt.

Zur Herstellung der extrazellulären Matrix oder der EZM-beschichteten Deckgläser werden die kreisförmigen Deckgläser zunächst in einer sterilen Petrischale mit steriler Salzsäure getränkt. Waschen Sie die Einbezugsbezüge nach 30 Minuten dreimal mit sterilem Wasser und weichen Sie sie dann mindestens 20 Minuten lang in 95%igem Ethanol ein. Nachdem Sie die Deckgläser an der Luft trocknen gelassen haben, geben Sie 150 bis 250 Mikroliter verdünnte ECM-Protein-Beschichtungsmaterialien auf eine Paraform-Folie und verteilen Sie die Tröpfchen so, dass sich die Deckgläser nach dem Platzieren nicht überlappen.

Legen Sie anschließend mit einer Pinzette vorsichtig ein Deckglas auf jedes Tröpfchen und platzieren Sie das Paraform dann nach vier bis sechs Stunden bei geschlossenem Flügel in einer Zellkulturhaube. Legen Sie die Deckgläser mit der ECM-beschichteten Seite nach oben in die einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Waschen Sie dann jede Mulde gut mit sterilem PB S3 ab und lagern Sie die Deckgläser bei vier Grad Celsius. Um die Gliazellen für die Beschichtung auf den Deckgläsern vorzubereiten, aspirieren Sie das Medium aus Gliazellkulturen und waschen Sie die Monoschichten dann dreimal vorsichtig mit 10 Millilitern sterilem PBS.

Trennen Sie die Zellen mit acht bis 10 Millilitern Trypsin EDTA nach fünf bis 10 Minuten. Bei 37 Grad Celsius werden 20 Milliliter des vollständigen Mediums in den Kolben gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Füllen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen 10 Minuten lang herunter.

Bei 300 g und Raumtemperatur verwenden Sie einen P 1000, um den Gaumen in zwei Millilitern frischem, vollständigem Medium sanft zu resuspendieren. Verdünnen Sie die Zellen nach dem Zählen auf etwa einmal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter. Plattieren Sie nun 500 Mikroliter der Zellen auf jeden der ECM-beschichteten Deckgläser.

Geben Sie zusätzliches frisches vollständiges Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte dann drei bis fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, geben Sie frisch zubereitetes Cyclin in jede Vertiefung und schwenken Sie die Kulturplatte vorsichtig, um sie zu mischen. Sammeln Sie nach einer Woche Cyclinbehandlung das Medium und fixieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern kaltem, 4%igem para-Formaldehyd pro Vertiefung bei Raumtemperatur.

Dann jede Platte dreimal gut mit PBS waschen und die Teller bei vier Grad Celsius lagern. Um die GLO-Zellen durch Immun-Zytochemie sichtbar zu machen, ersetzen Sie zunächst das PBS durch einen Blockierungspuffer und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde inkubieren Sie die Zellen in primären Antiseren gegen den Mikroglia-Marker IO one für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur und waschen Sie dann jede Vertiefung dreimal fünf Minuten lang in PBS.

Nach der Inkubation der Zellen mit der entsprechenden Fluoreszenz konjugierten Sekundärantikörper werden die Zellen mit DAPI gegengefärbt, um die Zellkerne zu identifizieren. Nachdem Sie die Zellen wie gerade gezeigt gewaschen haben, verwenden Sie Eindeckmedium, um jedes Deckglas auf einzelne Objektträger zu montieren, und betrachten Sie die Objektträger auf einem Fluoreszenzmikroskop zur visuellen und quantitativen Analyse. Um die phagozytäre Aktivität der mit Cyclin behandelten Mikroglia nach der Cyclinbehandlung, aber vor der Fixierung, zu beurteilen, fügen Sie FITC-markierte Latexkügelchen zu jeder G-OID-Zellkultur gemäß den Anweisungen des Herstellers und der Anweisungen hinzu.

Fixieren Sie die Zellen nach 48 Stunden wie gerade gezeigt in PFA und verarbeiten Sie die Zellen dann wie gezeigt für die Immunchemie. Bestimmen Sie schließlich die Anzahl der positiven IBO-Mikroglia, die mit den fluoreszenzmarkierten Kügelchen durch immunchemische Fluoreszenzmikroskopie kolokalisieren. Die Färbung von Mikroglia mit IO one in Verbindung mit einer nuklearen Gegenfärbung ermöglicht die Identifizierung großer, abgerundeter mehrkerniger Zellen.

Beachten Sie, dass in vielen Fällen die grobe Vergrößerung der Größe des Zellkerns den mehrkernigen Status dieser Zellen widerspiegelt, wie in diesem Bild zu sehen ist. Die Cyclinbehandlung ruft auch eine generalisierte Aktivierung der Mikroglia hervor, die durch eine Erhöhung der sauren PHA-Aktivität der monokernigen Mikroglia sowie der mehrkernigen GLO-Zellen messbar ist. Wie in diesem repräsentativen Bild zu sehen ist, können die PHA-Acidly active-Profile von IBO 1-positiven Mikroglia während der Co-Kultur mit Oligodendrozyten-Vorläuferzellen leicht identifiziert werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von GLD, da die Bildung dieser mehrkernigen Zellen als Reaktion auf die Cyclinbehandlung ein definierendes Merkmal der Neuropathologie von GLD ist und der Beitrag dieser Zellen zu dieser Pathologie bisher nicht auf diese Weise erforscht wurde.