In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, extrinsische afferente Nervenenden im Co-Rektum der Maus in vitro funktionell zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem der kolorektale und der angehängte Becken- oder lumbale Splunk-Halsnerv im Kontinuum entnommen und das Gewebe in eine in vitro Aufzeichnungskammer gebracht wird. In einem zweiten Schritt wird der Becken- oder lumbale Splunk-Halsnervenstamm in feine Filamente gespalten, so dass elektrophysiologische Einzelfaseraufnahmen von einzelnen Nervenaxonen gemacht werden können. Als nächstes werden einzelne kolorektale Nervenenden durch unverzerrte elektrische Stimulation der rezeptiven Felder identifiziert und anhand der Reaktionsprofile auf drei verschiedene mechanische Reize funktionell klassifiziert.

Darüber hinaus können Reaktionen auf Chemikalien, die auf die Nervenenden angewendet werden, getestet werden, indem das rezeptive Feld mit einem Stück Messingschlauch isoliert und die Lösung durch die Lösung ersetzt wird, die die Chemikalie oder das Gemisch von Chemikalien enthält. Die Ergebnisse zeigen, dass kolorektale Mausen von fünf verschiedenen Klassen mechanoempfindlicher ens innerviert werden. Darüber hinaus sind etwa 25 % der kolorektalen Ens mechanisch unempfindliche oder stumme Nozizeptoren.

Diese Methode wird von uns und anderen verwendet, um die sensorische Innervation des kolorektalen Körpers zu untersuchen. Wir sind an diesem Forschungsansatz interessiert, da viele Magen-Darm-Erkrankungen mit einer Sensibilisierung oder einer Veränderung der Erregbarkeit der sensorischen Innervation verbunden sind. Unser Interesse am Verständnis der Mechanismen der Sensibilisierung hängt mit unserem Wunsch zusammen, bei der Entwicklung therapeutischer Strategien zu helfen, die dann nützlich sein könnten, um die Schmerzen und Beschwerden zu modulieren, die typischerweise mit diesen Magen-Darm-Erkrankungen, wie dem Reizdarmsyndrom, verbunden sind.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Gewebedissektion und die nervenspaltenden Schritte sehr schwer zu bewältigen sind. Die Nerven, die innovativ sind. Das distale kolorektale Element kann bei der Dissektion leicht beschädigt werden.

Daher ist eine sorgfältige Sektion und es gibt Spaltschritte wirklich entscheidend für diejenigen, die dieses Experiment wiederholen wollen. Unmittelbar nachdem Sie eine Maus eingeschläfert haben, exsanguinieren Sie sie, schneiden Sie die Brustkammer auf, perforieren Sie den rechten Vorhof und tauchen Sie den Mäusekadaver und etwa einen halben Liter eiskalte Creb-Lösung ein. Entfernen Sie anschließend vorsichtig alle Eingeweide mit Ausnahme des Dickdarms und der Beckenorgane.

Dann wird der Körper der Maus etwa bei T 12 etwas oberhalb des Thoraxdiaphragas durchtrennt und die Kotschelhälfte des Körpers in eine Präparierkammer mit eiskalter Blasencrebs-Lösung überführt. Entfernen Sie unter einem Stereoskop die Blase und die Fortpflanzungsorgane, indem Sie sie an ihren Verbindungsstellen zur Harnröhre durchschneiden. Entfernen Sie auch die absteigende Aorta, bis sie sich in die Arteria iliaca communis gabelt.

Befreien Sie nun die Becken- oder Lendenwirbel-Nackennerven vom umgebenden Gewebe. Folgen Sie den Nerven von außerhalb des Beckenkamms bis zu ihrem Eintrittspunkt in die Wirbelsäule. Die Beckennerven münden in die Wirbelsäule L sechs und S eins und die Nervus lumbalis splank in T 13 und L eins (dargestellt).

Hier ist die Dissektion des linken und rechten Beckennervs. Als nächstes schneiden Sie die Schamsynthese und schneiden die rechten und linken Hüftgelenke. Anschließend den Beckenknochen entfernen Nach der Entfernung des Beckenknochens wird das distale kolorektale mit dem daran befestigten Nerv Free präpariert.

Der anhaftende Nerv aus dem umgebenden Muskel- und Bindegewebe. Der Nerv ist anfällig für mechanische Schäden. Wir sind von seinem umgebenden Gewebe befreit, so dass besondere Vorsicht geboten ist, um ein Ziehen oder Einklemmen des Nervs zu vermeiden.

Übertragen Sie dann das kolorektale mit dem angesetzten Nerv in die Gewebekammer. Öffnen Sie die kolorektale Längsseite entlang der antimesenterialen Grenze und positionieren Sie die kolorektale Schleimhautseite nach oben. Verlängern Sie dann den Nerv in das Aufnahmefach, das durch ein Mauseloch und ein Tor mit dem Wannenfach verbunden ist.

Positionieren Sie den Nervenstamm auf einem kleinen Glasspiegel. Der Spiegel ist hydrophil und der Nerv wird daran haften. Stecken Sie nun neben dem Aufnahmefach den mesenterialen Rand des kolorektalen Gefäßes fest.

Schmelzen Sie nun ein Badewannenfach mit warmer, sauerstoffhaltiger Creb-Lösung und füllen Sie das Aufnahmefach mit Mineralöl, um das Setup abzuschließen. Befestigen Sie die anti-mesenteriale Länge des kolorektalen Mikroskops an einem Hakenrechen, der mit einem Kraftaktuator unter dem Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung verbunden ist. Lösen Sie die Nervenhülle vorsichtig mit einer feinen Pinzette vom isolierten Becken- oder Lendenwirbelnerv ab.

Ziehen Sie den Nervenstamm in fünf bis acht Nervenbündel auf, die jeweils etwa 100 Mikrometer dick sind. Setzen Sie nun die Referenzelektrode in Kontakt mit der Krebslösung in die Gewebekammer. Positionieren Sie dann nacheinander die einzelnen Nervenbündel auf der Aufzeichnungselektrode, um Aktionspotentiale von den kolorektalen ens hervorzurufen.

Streichen Sie mit einem weichen Pinsel vorsichtig über die kolorektale Oberfläche. Identifizieren Sie so das Nervenbündel oder die Nervenbündel, die den Dickdarm innervieren. Teilen Sie nun mit einem Paar 30-Gauge-Nadelspitzen das Nervenbündel weiter in 10 Mikrometer dicke Filamente auf und legen Sie eines der Filamente auf die Aufnahmeelektrode.

Dieser Schritt erfordert ein hohes Maß an Augen-Hand-Koordination und Geschicklichkeit. Um dann die afferenten Nervenenden elektrisch zu erregen, positionieren Sie die runde konzentrische Elektrode senkrecht zur Schleimhautoberfläche und stimulieren Sie mit einer Intensität oberhalb der Schwelle. Dadurch entsteht eine Stromspreizung über einen Radius von zwei Millimetern.

Um rezeptive Enden zu finden, bewegen Sie die Elektrode systematisch in 1,5-Millimeter-Schritten entlang der Länge und Breite des abgeflachten Co-Rektums. Wenn ein afferentes Ende angeregt wird, passen Sie die Elektrodenposition und die Stimulusintensität an, um das rezeptive Feld zu lokalisieren, das die geringste Reizintensität benötigt, um zu reagieren. Wenn die Reizschwelle größer als drei Milliampere ist, verwerfen Sie dieses Nervenende und fahren Sie mit der Untersuchung eines anderen Nervenfilaments fort.

Berechnen Sie nun die Leitungsgeschwindigkeit aus dem Abstand zwischen der stimulierenden Elektrode am rezeptiven Feld und der Aufnahmestelle und aus der Leitungsverzögerung zwischen dem Reizartefakt und dem Einsetzen des Aktionspotentials. Nachdem Sie ein rezeptives Feld durch einen elektrischen Reiz lokalisiert haben, wenden Sie drei mechanische Stimuli an. Wenden Sie zunächst einen Sondierungsreiz an, indem Sie die Spitze eines kalibrierten Von-Frays, wie Nylon-Monofilament, senkrecht zum rezeptiven Feld auf dem abgeflachten kolorektalen Element drücken.

Verwenden Sie Monofilamente, die eine Kraft von 0,4 Gramm und ein Gramm erzeugen. Zweitens, erzeugen Sie einen Streichreiz, indem Sie die kolorektale Schleimhaut sanft mit einem feinen Nylonfilamentstrang streicheln, der eine Kraft von 10 Milligramm erzeugt, um eine kleine Oberflächenscherspannung am rezeptiven Feld zu erzeugen. Drittens: Führen Sie die Umfangsdehnung mit einem computergesteuerten Kraftaktuator durch.

Lassen Sie es eine rampengedehnte Kraft in Umfangsrichtung entlang der antimesenterialen Kante des kolorektalen Randes abgeben. Klassifizieren Sie nun das ENS als seröse Schleimhaut, muskuläre Muskelschleimhaut oder MIAA mechanisch unempfindlicher Afferent. Basierend auf den Ergebnissen der drei Tests.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung einer Ausgangsreaktion auf einen mechanischen Reiz wie im vorherigen Abschnitt durch eine rampierte Umfangs-, Dehnungs- oder senkrechte mechanische Sondierung, um die chemische Empfindlichkeit zu testen. Bestreichen Sie zunächst die Unterkante eines Stücks Messing- oder Edelstahlrohr mit Petroleum und legen Sie es über das Aufnahmefeld auf dem Darm. Saugen Sie nun die Krebs-Lösung aus dem Inneren des Schlauchs ab und ersetzen Sie die Lösung durch 170 Mikroliter Testlösung.

Lassen Sie den Schlauch drei bis fünf Minuten lang in Position, während Sie auf Reaktionen in der Afferente überwachen. Testen Sie unmittelbar nach dem Entfernen des Schlauchs innerhalb von vier bis sechs Minuten die afferente Reaktion auf denselben mechanischen Reiz wie in der Ausgangsreaktion. Nach 15 oder mehr Minuten können die Reagenzien als ausgewaschen betrachtet werden.

Dann wird der mechanische Reiz wieder angelegt. Zum Vergleich mit den Ausgangsameisen wurde ein präparierter Nerv stimuliert, um ein rezeptives Feld zu finden. Das rezeptive Feld wurde durch eine Aktionspotentialantwort unter Verwendung der Leitungsverzögerung des Aktionspotentials identifiziert.

Die berechnete Leitungsgeschwindigkeit betrug Punkt 43 Meter pro Sekunde, was gut im Bereich einer unmyelinisierten C-Faser liegt. Nach der Identifizierung des rezeptiven Feldes wurde es senkrecht mit handgehaltenen von fray-ähnlichen Monofilamenten untersucht und auch sanft von einem handgehaltenen feinen Nylonfilament gestreichelt. Die AFR-Reaktionen auf die Sondierung wurden auch von einem computergesteuerten Kraftaktuator bewertet, der an die gleiche Stelle auf dem kolorektalen Triebwerk eine Reihe von genau getakteten und reproduzierbaren mechanischen Kräften abgibt.

In ähnlicher Weise wurde die umlaufende Dehnung des kolorektalen Bereichs durch die gleiche Aktuatoranstrengung erzeugt. Reaktionen können anhand der Reaktionen auf Sondieren, Streicheln und Dehnungsreaktionen von einem dehnungssensitiven Afferenten unterschieden werden, die durch drei aufeinanderfolgende Umfangsdehnungen im Abstand von fünf Minuten hervorgerufen wurden. Die Spike-Zahlen wurden gleichmäßig gepinnt und als Stimulus-Response-Funktionen angezeigt, was eine hohe Reproduzierbarkeit und sowohl die Antwortgröße als auch die Antwortschwelle zeigt.

Als nächstes wurden Chemikalien aufgetragen. Die direkte Aktivierung von ens erfolgte nach einer Applikation einer sauren hypertonischen Lösung nach Applikation einer Entzündungssuppe auf einen mechanisch unempfindlichen Afferenten. Es kam zu keiner Aktivierung der Endung, aber der Erwerb einer Meno-Sensitivität war offensichtlich.

Ein dehnungsempfindlicher, menosensitiver Afferent wurde auch nach dem Auftragen einer Entzündungssuppe für die mechanische Dehnung des rezeptiven Feldes sensibilisiert. Einmal gemeistert, dauert es in der Regel drei bis vier Stunden, bis die Gewebedissektion abgeschlossen ist und eine Einzelfaseraufzeichnung erreicht ist. Ein typisches Experiment dauert von Anfang bis Ende einen ganzen Tag. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie das kolorektale Element mit angehängten Nerven chirurgisch entfernen und entnehmen können.

Dann können Sie von einzelnen Ahern-Fasern entweder im Beckennerv oder im lumbalen Splank-Nerv aufzeichnen und den Dickdarm mit einer unvoreingenommenen elektrischen Suchstrategie innervieren. Sie sollten dann in der Lage sein, rezeptive Enden im Co-Rektum zu identifizieren und sie auf Mechano-Empfindlichkeit sowie Chemo-Empfindlichkeit zu testen, indem Sie Chemikalien direkt auf die rezeptiven Enden anwenden. Dieses Präparat ist ein leistungsstarkes Präparat, mit dem Sie pathophysiologische Mechanismen sowie grundlegende physiologische Fragen im kolorektalen Bereich untersuchen können.