Name: In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Erfahren Sie die funktionelle Charakterisierung kolorektaler Nervenendigungen bei der Maus mittels Einzelfaser-Elektrophysiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanosensitiver und chemischer Reaktionsprofile.

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Unterstützt durch den NIH-Preis R01 DK093525 (GFG). Wir schätzen die wissenschaftliche Überprüfung und grammatikalische Bearbeitung des Manuskripts durch Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) sehr und danken Michael Burcham für die Unterstützung bei der Erstellung der Abbildungen.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde überprüft und von der University of Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Herstellung von modifiziertem Krebs-Lösung und Test-Arzneimittel Aliquots <ol><li> Make 6 L modifizierte Krebs-Lösung, die (in mM) enthält: 117,9 NaCl, 4,7 KCl, 25 NaHCO 3, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 2,5 CaCl 2, 11.1 D-Glucose, 2 Natriumbutyrat 20 Natriumacetat , 0,004 Nifedipin (spontane Muskelkontraktionen blockieren) und 0,003 Indometacin (die Synthese von endogenem Prostaglandin blockieren). Verwenden eiskalt und warmen Krebs Lösungen für Gewebedissektion und Einzelfaser-Aufnahme auf. </li><li> Bereiten keine chemischen Lösungen (zB, IS, Capsaicin, ATP) in Aliquots bei gewünschten Konzentrationen. </li></ol> 2. Dissektion der Kolorektums-Nervengewebe <ol><li> Betäuben und euthanize männliche Mäuse (6 - 8 Wochen alt, 20 - 30 g) inein CO 2 Kammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die mit 10 verdrängt - 30% des Kammervolumens pro Minute bis Mäusen atmen aufhören vollständig wie durch das Fehlen von Brustbewegung angegeben. </li><li> Unmittelbar nach Euthanasie, exsanguinate durch Aufschneiden der Thoraxkammer, Perforation des rechten Vorhofs und das Eintauchen der Maus Karkasse in einem großen Volumen (~ 500 ml) eiskaltem Krebs (4 ° C) Lösung geblasen mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2). </li><li> Alle inneren Organe, sondern auch die Dickdarm-und Beckenorgane vorsichtig entfernen. Transekt mit der Maus in die Hälfte über dem Wirbelsegment T12 leicht über dem Zwerchfell und übertragen Sie die Schwanz Hälfte zu einer Dissektion Kammer, eiskalt, sprudelte Krebs-Lösung. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie die Blase und die Fortpflanzungsorgane durch Durchtrennung an ihren Verbindungsstellen an der Harnröhre, und entfernen Sie den absteigenden / Bauchaorta, bis sie in gemeinsamen Beckenarterien gabelt. Befreien Sie den PN oder die LSN von ihren surrounding Gewebe stumpf und folgen Sie den Nerv von außerhalb des Beckenkamm bis zu seiner ventralen Einstieg in die L6 und S1 Wirbelsäule (PN) oder T13 und L1 Wirbelsäule (für LSN). </li><li> Schneiden Sie die Symphyse und rechts und links Pfannen Gelenke, und entfernen Sie das Darmbein. Sorgfältig kostenlos entweder die PN oder LSN aus dem beigefügten Muskels und des Bindegewebes aus der Nähe des colorectal, bis wo der Nerv in die Wirbelsäule. </li><li> Sorgfältig Resektion des Darmbein, um den distalen Kolorektums aussetzen. Präparieren Sie die distale Kolorektums mit dem angebrachten PN oder LSN im Kontinuum. </li><li> Übertragen Sie die Kolorektums mit dem Nerv in das Bad Fach der Gewebekammer angebracht. Überschüssiges Bindegewebe durch weitere Dissektion, und öffnen Sie die Kolorektums Längsrichtung entlang des Anti mesenterialen Grenze. </li><li> Mit Schleimhautseite nach oben, stecken Sie die mesenterialen Rand des Kolorektums neben dem Aufnahmeraum in die Silikonbasis der chamber und befestigen Sie den antimesenteriale Länge des Kolorektums an einen Rake von Haken mit einem Kraftstellglied verbunden (in Abbildung 1 veranschaulicht und in 2A fotografiert). </li><li> Erweitere PN oder LSN in die Aufnahmefach, das zu dem Bad Raum durch eine Mausloch und dem Gate verbunden ist. Legen Sie vorsichtig den Nervenstamm auf einen kleinen Glasspiegel im Aufnahmeraum, der eine hydrophile Oberfläche für den Mut, zu halten bietet. Superfuse das Baderaum mit warmem (30 bis 32 ° C), mit Sauerstoff angereicherte Krebs-Lösung und füllt die Aufnahmefach mit Mineralöl. </li></ol> 3. Einzelfaser-Aufnahme und Lokalisierung der rezeptiven Feld <ol><li> Schieben Sie vorsichtig die Epineurium (Nervenscheide) der PN oder LSN unter dem Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung (50 - 60X). Mit einer feinen Pinzette, necken den Nervenstamm in 5-8 Nervenbündel von ~ 100 &amp; mgr; m Dicke. </li><li> Legen Sie die Platin-Iridium-ReferenzElektrode in Kontakt mit dem Krebs-Lösung in das Gewebe Kammer. Sequentielles Platzieren der einzelnen Nervenbündel auf die Aufzeichnungselektrode aus dem gleichen Material hergestellt. </li><li> Mit einem weichen Pinsel, um APs von den Dick Afferenzen durch sanft streichelte oben und unten der kolorektalen Oberfläche hervorrufen. Suchen Sie den Nervenbündels (n), die den Doppelpunkt durch nachweisbare AP (Aktionspotential) Aufnahmen innervieren. HINWEIS: Die PN und LSN auch die Harnblase und andere Beckenorgane innervieren. </li><li> Verwenden Sie ein Paar 30 G Nadelspitzen weiter zu spalten die Nervenbündels in feine Faszikel Filamente ~ 10 &amp; mgr; m Dicke und legen Sie einen individuellen Filament auf die Aufzeichnungselektrode. </li><li> Legen Sie die rund Spitze konzentrischen Elektrode senkrecht zur Schleimhautoberfläche zu afferenten Enden am Überschwellenreizstärke (10 mA Stärke, 0,5 ms Dauer @ 0,3 Hz), die eine mm Radius von aktuellen Ausbreitung ~ 2 produziert elektrisch erregt. Bewegen Sie den Elektroden systematisch (~ 1,5 mm Schritten) Entlang der Länge und Breite des abgeflachten colorectum empfänglich Digungen lokalisieren. </li><li> Wenn ein afferenten Ende ist aufgeregt, stellen Sie die Elektrodenposition, um den Ort der Aktivierung (rezeptiven Feld, HF), die minimale Reizstärke (Reizschwelle) erfordert genau zu bestimmen. Entsorgen Enden mit einer Reizschwelle&gt; 3 mA 19. </li><li> Berechnen der Leitungsgeschwindigkeit (CV) von 1) der Abstand zwischen der Stimulationselektrode an dem Empfangsfeld (RF) und der Aufzeichnungsstelle, und 2) die Leitungsverzögerung (zB, 2B) zwischen dem Reizartefakt und dem Einsetzen des Aktionspotentials . CV (m / sec) = Abstand (mm) / Leitungsverzögerung (msec). </li></ol> 4. Funktions Einstufung mechanosensitiven Colorectal Afferenzen <ol><li> Nach dem Auffinden eines RF durch elektrische Stimulation, gelten die folgenden drei mechanische Reize an den HF: <ol><li> Führen Sie die Sondierung Reiz, indem Sie die Spitze eines calibrated von Frey-like Nylonmonofilament (0,4 und 1 g Kraft), die senkrecht auf die RF auf der abgeflachten Kolorektums. </li><li> Führen Sie den Reiz von streichelte sanft streichelte den kolorektalen Schleimhaut mit einer feinen Nylonfaden Strang (10 mg Kraft), eine kleine Oberflächenscherspannung an der RF zu erzeugen. </li><li> Führen Sie die Umfangsdehnung mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftantrieb, die eine rampenförmige Strecke Kraft liefert (0-170 mN bei 5 mN / sec) in Umfangsrichtung entlang der Anti mesenterialen Rand des Kolorektums über den Rechen des in Schritt 2.8 beschrieben Haken . </li></ol></li><li> Bewerte Afferenzen als Serosa (reagieren nur auf stumpf Sondieren), Schleimhaut (reagieren auf Schleimhaut streicheln und stumpf Sondieren), muskulös (zum Umfangsdehnung reagieren und stumpf Sondieren) Muskel / Schleimhaut (zum Umfangsdehnung, Schleimhaut Streicheln reagieren und stumpf Sondieren), oder MIA (nicht in Reaktion auf jede der drei mechanischen Reizen). </li><li> Für mesenterialen Afferenzen (nur indie LSN Innervation), die schwierig sind, um selektiv durch elektrische Stimulation zu aktivieren, suchen ihre rezeptiven Enden durch mechanische Streicheln / Sondierung des Mesenteriums. </li><li> Für Stretch-sensitive Afferenzen (Muskel-und Muskel-Schleimhaut), bestimmen die Ansprechschwelle, die als die Kraft, die die erste AP während der geneigte Strecke erinnert definiert ist. </li><li> Für serösen Afferenzen, notieren ihre Antworten auf aufsteigend Ebenen der punktförmige Sondieren des rezeptiven Feldes durch die computergesteuerte Kraftstellglied angetrieben. </li></ol> 5. Chemische Anwendung / Modulation der Empfang Endings <ol><li> Zeichnen Sie eine Baseline-Reaktion auf einen mechanischen Reiz (dh Reaktion auf geneigten Strecke, punktförmige Sondieren oder Schleimhaut Streicheln). </li><li> Bestreichen Sie die Unterkante eines Schlauchstück (Messing oder Edelstahl, 10 mm Höhe und 4 x 4 mm 2 quadratisch oder 4-5 mm Durchmesser) mit Vaseline und legen Sie es über dem rezeptiven Feld auf der Kolorektums. </li><li> Entfernendie Krebs-Lösung im Inneren des Schlauchs, und setzen die aufnahme Endung für 3 - 5 min zu 170 ul der Lösung, die die Chemikalie (n) zu prüfen. </li><li> Beobachten Sie die Reaktion des afferenten bei der chemischen Anwendung (einige Afferenzen sind chemosensitiven). </li><li> Entfernen Sie die chemische Lösung und die Schläuche, die Wirkung der chemischen beenden. In 4 - 6 min, testen die afferenten Reaktion auf denselben mechanischen Stimulus, wie in der Grundreaktion. </li><li> Wenden Sie die mechanischen Reiz wieder nach ausreichenden Zeitraum Auswaschen (&gt; 15 min). </li></ol> 6. Aufnahme und Diskriminierende AP Spikes <ol><li> Digitalisieren der elektrischen Signale von Axonen bei 20 kHz aufgenommen und speichern Sie die Daten auf einen Computer. Überwachen Sie die Signal online durch eine Audio-Überwachung. </li><li> Analysieren Sie die AP Spitzen off-line und diskriminieren einzelne Einheiten basierend auf der Hauptkomponentenanalyse einzelner Dorn 25 Wellenformen. HINWEIS: Ein Datensatz sollte nicht mehr th enthaltenein zwei leicht unterscheidbar aktiven Einheiten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier beschriebene in vitro-Nerven Kolorektums Vorbereitung hat sich als leistungsfähiges Konzept für neuronale Kodierung Funktionen einzelner kolorektalen Afferenzen, die schön ergänzt andere nicht-funktionale Ansätze (zB Zell-, Molekular- und histologische Untersuchungen) auf viszeralen sensorischen Neuronen (studieren siehe Bewertung 27 für Details). Neuronalen Mechanismen Beitrag zur Nozizeption und langfristig colorectal Überempfindlichkeit festgestellt worden sind und pharmakologisc...

Schmerzüberempfindlichkeit sind die vorherrschenden Beschwerden von Patienten mit funktionellen gastrointestinalen Störungen einschließlich Reizdarmsyndrom (IBS), die in Abwesenheit des sichtbaren pathobiologischen Ursache oder Gewebeschäden vorliegen. Zum Beispiel weisen IBS-Patienten Überempfindlichkeit, einschließlich erhöhter Antworten auf rektale Ballon Spannungsgefühl und erhöhte Empfindlichkeit während des normalen Darmfunktion sowie Überempfindlichkeit der somatischen Weisung (dh Druckschmerz im Bauchbereich) 1. Da Targeting kolorektalen Afferenzen hat sich als wirksam bei der Linderung von Schmerzen und Überempfindlichkeit in IBS-Patienten (zB intrarektale Einträufeln von Lokalanästhetika 2,3; orale Aufnahme des Guanylatzyklase-C-Agonisten linaclotide 4-6) sein, ein besseres Verständnis der afferenten Innervation Kolorektum ist wichtig. Visceral Afferenzen, darunter Dickdarm- AfferenzenIn der Lage sind zu reagieren, um chemische / Nähr- und thermischen Behandlungsformen (zum Beispiel 7-9). Allerdings viszerale Afferenzen Reaktion auf mechanische Reize (dh mechanosensitive Afferenzen) waren die am besten untersuchte, weil mechanische Reize (zB Lumen Blähungen, Dehnung) sind diejenigen, die in der Regel führen zu bewussten Empfindungen, einschließlich Beschwerden und Schmerzen 10-16. Darüber hinaus werden die Eingeweide auch mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) innerviert, allgemein als stille oder Schlaf Nozizeptoren 17. Unter normalen physiologischen Bedingungen, müssen MIAs nicht auf mechanische Reize reagieren und haben eine sehr hohe Ansprechschwellen 18, sondern kann aktiv werden und erwerben Mechanosensitivität in pathophysiologischen Bedingungen und dazu beitragen, Überempfindlichkeit. Unter Verwendung der in vitro Herstellung und hier beschriebene Protokoll, entwickelt und verwendet ein elektrisches Stimulus-Strategie in See wir<html> rch für aufnahmeEnden und ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung der beiden mechanosensitive und MIA Enden in der Kolorektums 19. Das kolorektale Innervation aus Lenden splanchnischen (LSN) und Beckennerv (PN) Wege abgeleitet und enthält kolorektalen Afferenzen, die in fünf mechanosensitive Klassen (seröse, Schleimhäute, muskulös, Muskel-Schleimhaut, mesenterialen) und eine MIA-Klasse 20 eingestuft werden können. Mit dieser In-vitro-Vorbereitung, fanden wir, dass kolorektalen MIAs erworben Mechanosensitivität (Sensibilisierung) nach kurzzeitiger ihres rezeptiven Felder zu einer entzündlichen Suppe (IS), die 71% der MIAs in der PN-Bahn und 23% der MIAs im LSN Weg sensibilisiert 19. Wir haben auch dokumentiert Langzeitsensibilisierung (bis 28 Tage) von MIA in Zusammenhang mit langanhaltenden Verhaltens viszerale Hypersensitivität (dh in Mäusen intrakolische Behandlungen mit Zymosan 21 oder 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; Unter mechanosensitive Afferenzen, muskulös und Muskel-Schleimhaut-Afferenzen sind die einzigen Klassen, die tonisch kodieren Umfangsdehnung des colorectal (dh sind Stretch-und Kleinschreibung) und dienstbar die Kodierung der schädlichen kolorektale Dehnung 23,24. Mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftaktuator wir mit einem Standard, homogene und reproduzierbare gefahren Dehnung in der Umfangsrichtung des abgeflachten kolorektales Gewebe und weiter kategorisiert dehnungsempfindlichen Afferenzen als Niedrigschwellenwert und hohem Schwellenwert 23. Darüber hinaus den Zeitverlauf der Sensibilisierung von Dehnungs sensitive Afferenzen nach intrakolische Zymosan 21 oder TNBS 22 Behandlung entspricht der Beginn, Ausdauer, und / oder Wiederherstellung von Verhaltens viszerale Hypersensitivität, was auf eine Rolle von Dehnungsempfindlichen Dick Afferenzen in viszeralen Schmerzen und Überempfindlichkeit.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop Leica MZ16</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica IC D Kamera</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Rauscharmer Differenzverstärker</td></tr><tr><td>Zweikammer-Gewebekammer</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Datenerfassung, analoger Signaleingang/-ausgang</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Softwarepaket, das mit dem Power1401</td></tr><tr><td>Audiomonitor</td><td>Natus</td><td>Am funktioniert </td><td></td>8</tr><tr><td>Rechteckpulsstimulator</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>Zur Abgabe elektrischer Reize</td></tr><tr><td>Photoelektrische Isolationseinheit</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Stimulusisolierung zur Reduzierung des Rauschens</td></tr><tr><td>Konzentrische bipolare Mikroelektrode</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>Zur Abgabe elektrischer Reize</td></tr><tr><td>Dual-Mode-Hebelsystem</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Serie 300C</td><td>Zur Abgabe mechanischer Reize</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Pinzetten mit feinen Spitzen</td></tr></tbody></table>

in-vitro-funktionelle charakterisierung von maus colorectal afferente endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Dieses Video zeigt im Detail ein in vitro-Einzelfaser elektrophysiologische Ableitung Protokoll mit einer Maus Kolorektums-Nerven Vorbereitung. Der Ansatz ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einzelner kolorektalen Afferenzen. Extrazelluläre Ableitungen von propagierten Aktionspotentiale (APs), die von einem oder wenigen afferenten stammen (dh Einzelfaser) rezeptiven Felder (RFS) in Kolorektum aus gehänselt Nervenfaser Faszikel gemacht. Die Kolorektums ist entweder mit dem Becken (PN) oder Lenden splanchnischen (LSN) Nerven befestigt und in Längsrichtung geöffnet entfernt. Das Gewebe wird in einer Aufnahmekammer gebracht, fixiert flach und mit Sauerstoff angereichertem Krebs-Lösung perfundiert. Brenn elektrischen Stimulation verwendet, um die kolorektale afferenten Endungen, die durch drei verschiedene mechanische Stimuli getestet lokalisieren (blunt Sondieren, Schleimhaut Streichen und Umfangsdehnung) funktionell zu kategorisieren Afferenzen in fünf mechanosensitive Klassen. Endings Reaktion auf keine dieser mechanische Reize werden als mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) kategorisiert. Sowohl mechanosensitive und MIAs kann Sensibilisierung (dh, verbesserte Reaktion, reduziert Schwelle und / oder Erwerb von Mechanosensitivität) bewertet werden, indem die lokale Exposition des RFs Chemikalien (zB entzündliche Suppe (IS), Capsaicin, Adenosintriphosphat (ATP)). Wir beschreiben die Geräte und Kolorektums-Nerven Aufnahme Vorbereitung, Ernte Kolorektums mit angeschlossenem PN oder LSN, die Identifizierung von RFs im Kolorektums, Einzelfaser-Aufnahme von Nervenfaszikel und lokalisierte Anwendung von Chemikalien auf die RF. Außerdem werden Probleme der Herstellung und Anwendung von standardisierten mechanischen Stimulation ebenfalls diskutiert.

Der Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt ist. Es umfasst eine maßgeschneiderte Gewebekammer, die die colorectum in einem Silikon-Bad ausgekleideten Kammer und der beigefügten Nerv in einem zusammenhängenden Mineralöl gefüllten Abteil untergebracht ist. Die Zwei-Kammer-Kammer wurde aus einem massiven Block aus Acrylkunststoff mit einer CNC-Maschine bearbeitet; der Boden der beiden Kompartimenten wurde anschließend mit festen Silikon ausgekleidet, um einfach Stift nach unten des kolorektalen Gewebe ermög...

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die funktionelle Charakterisierung extrinsischer afferenter Nervenendigungen im Rektum der Maus in vitro durchzuführen. Dies wird erreicht, indem das Kolorektum zusammen mit dem daran befestigten Becken- oder Lenden-Splunk-Halsnerv kontinuierlich entnommen und das Gewebe in eine in vitro-Aufzeichnungskammer überführt wird. Als zweiter Schritt wird der Stamm des Becken- oder Lenden-Splunk-Halsnervs in feine Fasern aufgeteilt, sodass elektrophysiologische Einzelfaser-Aufzeichnungen einzelner Nervenaxonen möglich sind. Anschließend werden einzelne kolorektale Nervenendigungen durch eine unvoreingenommene elektrische Stimulation der Rezeptfelder identifiziert und funktionell anhand der Reaktionsprofile auf drei unterschiedliche mechanische Reize klassifiziert.Außerdem können Reaktionen auf Chemikalien, die auf die Nervenenden wirken, getestet werden, indem das rezeptive Feld mit einem Stück Messingrohr isoliert und die Lösung durch eine Lösung ersetzt wird, die die Chemikalie oder eine Mischung von Chemikalien enthält. Die Ergebnisse zeigen, dass das kolorektale Gewebe der Maus von fünf verschiedenen Klassen mechanosensitiver ENs innerviert ist. Zusätzlich sind etwa 25 % der kolorektalen ENs mechanisch insensitiv oder stille Nozizeptoren.Diese Methode wird von uns und anderen Forschern verwendet, um die sensorische Innervation des Kolorektums zu untersuchen. Wir interessieren uns für diesen Forschungsansatz, da viele gastrointestinale Erkrankungen mit einer Sensibilisierung oder einer Veränderung der Erregbarkeit der sensorischen Innervation assoziiert sind. Unser Interesse am Verständnis der Mechanismen der Sensibilisierung hängt mit unserem Ziel zusammen, zur Entwicklung therapeutischer Strategien beizutragen, die möglicherweise nützlich sein könnten, um die Schmerzen und Beschwerden zu modulieren, die typischerweise mit diesen gastrointestinalen Erkrankungen wie dem Reizdarmsyndrom verbunden sind.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Gewebepräparation und das Aufspalten der Nerven äußerst schwierig zu beherrschen sind. Die Nerven, die das distale Kolorektum versorgen, können während der Präparation leicht beschädigt werden.Daher sind eine sorgfältige Dissektion und die Aufspaltungsschritte entscheidend für alle, die dieses Experiment replizieren möchten. Unmittelbar nach der Tötung eines Mäuses exsanguinieren Sie es, öffnen die Brusthöhle, perforieren den rechten Vorhof und tauchen den Mäusekadaver in etwa einen halben Liter eiskalte Creb-Lösung. Entfernen Sie danach vorsichtig sämtliche Eingeweide mit Ausnahme des Kolons und der Beckenorgane.Danach den Körper der Maus etwa auf Höhe von T 12 knapp oberhalb des Zwerchfells durchtrennen und die Bauchhälfte in eine Präparationskammer mit eiskalter, gespritzter Krebslösung überführen. Unter einem Stereomikroskop die Blase und die Fortpflanzungsorgane entfernen, indem man sie an ihren Verbindungsstellen zur Harnröhre durchtrennt. Außerdem die absteigende Aorta entfernen, bis diese sich in die gemeinsamen Beckenarterien (Arteriae iliacae communes) aufteilt.Lösen Sie nun die Becken- oder Lendenwurzelnerven aus dem umgebenden Gewebe. Verfolgen Sie die Nerven vom äußeren Darmbeinkamm bis zu ihrer Eintrittsstelle in die Wirbelsäule. Die Beckennerven treten in die Wirbelkörper L6 und S1 ein, und die Lendenwurzelnerven treten in T13 und L1 ein, wie dargestellt.Hier erfolgt die Präparation der linken und rechten Beckennerven. Anschließend schneiden Sie die Schambeinfuge und die rechte sowie linke Hüftgelenkpfanne durch. Danach entfernen Sie den Darmbein. Nach Entfernung des Darmbeins präparieren Sie das distale Kolorektum zusammen mit dem daran befestigten Nerv frei.Der Nerv wurde vom umgebenden Muskel- und Bindegewebe gelöst. Der Nerv ist mechanischen Schäden empfindlich. Wir lösen ihn vorsichtig von seinem umgebenden Gewebe, weshalb besondere Sorgfalt darauf verwendet werden muss, das Ziehen oder Quetschen des Nervs zu vermeiden.Überführen Sie dann das Kolorektum mit dem angehefteten Nerv in die Gewebekammer. Öffnen Sie das Kolorektum entlang der antimesenterialen Grenze longitudinal und positionieren Sie es mit der Mukosa-Seite nach oben. Führen Sie anschließend den Nerv in das Ableitungskompartiment, das über eine Mauselücke und ein Tor mit dem Badkompartiment verbunden ist. Platzieren Sie den Nervenstrang auf einem kleinen Glasobjektträger. Der Objektträger ist hydrophil, und der Nerv wird daran haften. Befestigen Sie nun neben dem Ableitungskompartiment den mesenterialen Rand des Kolorektums mit Nadeln.Jetzt einen Badekompartiment mit warmer, mit Sauerstoff angereicherter Creb-Lösung überströmen und das Ableitkompartiment mit Mineralöl füllen, um den Versuchsaufbau abzuschließen. Das antimesenterische Längenstück des Kolorektums an einen Hakenkamm anschließen, der mit einem Kraftaktuator unter dem Stereomikroskop bei hoher Vergrößerung verbunden ist. Die Nervenscheide vorsichtig von dem isolierten pelvinen oder lumbalen Splanchnikusnerv mit feinen Pinzetten ablösen.Zerlegen Sie den Nervenstrang in fünf bis acht Nervenbündel, die jeweils etwa 100&nbsp;Mikrometer dick sind. Bringen Sie nun die Referenzelektrode mit der Krebs-Lösung in der Gewebekammer in Kontakt. Positionieren Sie dann nacheinander die einzelnen Nervenbündel auf der Ableitelektrode, um Aktionspotentiale aus dem kolorektalen Plexus zu erzeugen.Streichen Sie vorsichtig mit einem weichen Pinsel über die kolorektale Oberfläche. Identifizieren Sie so das oder die Nervenbündel, die den Darm innervieren. Spalten Sie das Nervenbündel nun mit einer Pinzette aus 30-Gauge-Nadeln in 10&nbsp;Mikrometer dicke Fäden auf und legen Sie einen dieser Fäden auf die Ableitelektrode.Dieser Schritt erfordert ein hohes Maß an Koordination zwischen Auge und Hand sowie Geschicklichkeit. Um die afferenten Nervendigungen elektrisch zu reizen, positionieren Sie die rundliche konzentrische Elektrode senkrecht zur Schleimhautoberfläche und stimulieren mit einer über der Schwellenintensität liegenden Stärke. Dies erzeugt eine Stromausbreitung über einen Radius von zwei Millimetern.Um rezeptive Endigungen zu finden, bewegen Sie die Elektrode systematisch in 1,5-Millimeter-Schritten entlang der Länge und Breite des abgeflachten Kolorektums. Wenn eine afferente Endigung erregt wird, passen Sie die Position der Elektrode und die Reizintensität an, um das rezeptive Feld genau zu lokalisieren, das die geringste Reizintensität zur Antwort erfordert. Falls die Reizschwelle größer als drei Milliampere ist, verwerfen Sie diese Nervenendigung und fahren Sie mit der Untersuchung eines anderen Nervenfilaments fort.Berechnen Sie nun die Leitungsgeschwindigkeit anhand des Abstands zwischen der stimulierenden Elektrode am Rezeptfeld und der Ableitstelle sowie anhand der Leitungsverzögerung zwischen dem Stimulationsartefakt und den Beginn der Aktionspotentiale. Nachdem ein Rezeptfeld mittels elektrischer Stimulation lokalisiert wurde, wenden Sie drei mechanische Reize an. Wenden Sie zunächst einen abtastenden Reiz an, indem Sie die Spitze eines kalibrierten von-Frey-Haar-Monofaments senkrecht auf das Rezeptfeld am abgeflachten Kolorektum drücken.Verwenden Sie Monofile, die eine Kraft von 0,4 Gramm und eine Kraft von einem Gramm erzeugen. Zweitens erzeugen Sie einen Streichreiz, indem Sie die kolorektale Mukosa vorsichtig mit einem feinen Nylonfaden, der eine Kraft von 10 Milligramm erzeugt, streichen, um eine geringe Oberflächen-Scherbelastung im Rezeptorfeld zu erzeugen. Drittens führen Sie die zirkumferentielle Dehnung mit einem computergesteuerten Kraftaktuator durch.Lassen Sie eine rampeartig ansteigende Kraft in zirkumferentialer Richtung entlang der antimesenterischen Kante des Kolorektums aufbringen. Klassifizieren Sie nun das ENS als serös, muskuloseros, muskuloseros, oder MIAA (mechanisch insensitive Afferenz) basierend auf den Ergebnissen der drei Tests.Beginnen Sie mit der Aufzeichnung einer Basisantwort auf einen mechanischen Reiz wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, indem Sie eine gesteigerte zirkumferenzielle, dehnende oder senkrechte mechanische Stimulation durchführen, um die chemische Empfindlichkeit zu testen. Bestreichen Sie zunächst den unteren Rand eines Stückes Messing- oder Edelstahlrohrs mit Vaseline und platzieren Sie es über das rezeptive Feld am Kolorektum. Saugen Sie nun die Krebs-Lösung aus dem Inneren des Rohrs ab und ersetzen Sie die Lösung durch 170 Mikroliter Testlösung.Lassen Sie die Kanüle drei bis fünf Minuten lang an Ort und Stelle, während Sie auf Reaktionen im afferenten Nerv überwachen. Unmittelbar nach dem Entfernen der Kanüle innerhalb von vier bis sechs Minuten testen Sie die afferente Reaktion auf denselben mechanischen Reiz wie bei der Basislinienreaktion. Nach 15 oder mehr Minuten können die Reagenzien als ausgespült betrachtet werden.Dann wird der mechanische Reiz erneut angewendet. Zum Vergleich mit den Baseline-Ameisen wurde ein präparierter Nerv stimuliert, um ein Rezeptorfeld zu finden. Das Rezeptorfeld wurde anhand einer Aktionspotentialantwort unter Verwendung der Leitungsverzögerung des Aktionspotentials identifiziert.Die berechnete Leitungsgeschwindigkeit betrug 0,43 Meter pro Sekunde, was gut in den Bereich einer unmyelinisierten C-Faser fällt. Nach Identifizierung des rezeptiven Feldes wurde dieses senkrecht mit handgehaltenen, von-Frey-ähnlichen Monofilamenten abgetastet und außerdem sanft mit einem handgehaltenen feinen Nylonfilament gestrichen. AFR-Antworten auf das Abtasten wurden ebenfalls mittels eines computerkontrollierten Kraftaktuators bewertet, der an derselben Stelle des Kolorektums eine Serie präzise zeitgesteuerter und reproduzierbarer mechanischer Kräfte appliziert.Auf ähnliche Weise wurde eine zirkumferenzielle Dehnung des Kolorektums durch denselben Aktuator erzeugt. Die Antworten können anhand der Reaktionen auf Abtasten, Streicheln und Dehnen unterschieden werden; von einem dehnungsempfindlichen afferenten Neuron wurden Antworten durch drei aufeinanderfolgende zirkumferenzielle Dehnungen ausgelöst, die jeweils durch fünf Minuten getrennt waren. Die Spikanzahlen wurden gleichmäßig erfasst und als Stimulus-Antwort-Funktionen dargestellt, was eine hohe Reproduzierbarkeit sowie sowohl die Antwortamplitude als auch die Antwortschwelle offenbarte.Als Nächstes wurden folgende Chemikalien appliziert. Eine direkte Aktivierung von Ens erfolgte nach Applikation einer sauren hypertonen Lösung, nachdem ein entzündlicher Cocktail auf eine mechanisch unempfindliche Afferenz aufgebracht worden war. Es trat keine Aktivierung des Endes auf, jedoch war eine Erwerbung von Mechanoempfindlichkeit erkennbar.Eine dehnungsempfindliche, ursprünglich wenig empfindliche Afferenz wurde ebenfalls gegenüber mechanischer Dehnung des Rezeptfeldes sensibilisiert, nachdem ein entzündliches „Suppengemisch“ appliziert worden war. Sobald die Methode beherrscht ist, dauert es gewöhnlich drei bis vier Stunden, um die Gewebedissektion durchzuführen und die Einzelfaserableitung zu erreichen. Ein typisches Experiment erstreckt sich über einen ganzen Tag von Anfang bis Ende. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man das Kolorektum mit anhängenden Nerven chirurgisch entfernt und entnimmt.Anschließend sollten Sie in der Lage sein, von einzelnen Ahern-Fasern entweder im Nervus pelvinus oder im lumbarer Splanknerv, der den Kolon innerviert, mittels einer unvoreingenommenen elektrischen Suchstrategie Ableitungen vorzunehmen. Danach sollten Sie rezeptive Endigungen im Kolorektum identifizieren und mittels direkter Applikation von Chemikalien auf die rezeptiven Endigungen auf mechanische sowie chemische Empfindlichkeit testen können. Diese Versuchsanordnung ist eine leistungsfähige Methode, die es ermöglicht, pathophysiologische Mechanismen sowie grundlegende physiologische Fragestellungen im kolorektalen Bereich zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife oder eines pcLoop-Segments der Maus, gefolgt von einer intraluminalen Injektion von fluoreszierenden Markern in das Segment, um die intestinale Epithelpermeabilität zu untersuchen.

Generierung eines proximalen Dickdarmschleifenmodells der Maus: ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife und zur Messung der intestinalen Permeabilität durch Nachweis von Fluoreszenzmarkern im Serum nach intraluminaler Injektion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Aufzeichnung der Aktivität von zuvorkommenden Nervus des Dickdarms in einem ex-vivo-Dickdarm einer Ratte, die an beiden Enden kanüliert und mit Kochsalzlösung infundiert wurde, um den intraluminalen Druck zu erhöhen. Wenn der Druck steigt, steigt das Nervensignal an, was auf seine Stimulation hinweist.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von zuvorkommenden Nervus des Dickdarms in einem ex vivo Dickdarm der Ratte

Dieses Video zeigt den Prozess der Aufzeichnung elektrischer Signale von mesenterialen afferenten Nerven in einem präparierten Jejunalsegment der Maus, um die Auswirkungen von Gewebedruck und Bewegungsänderungen auf die Aktivität des afferenten Nervs zu untersuchen.

Aufzeichnung der Aktivität des Nervus mesenterialis afferent in einem ex vivo Jejunumsegment der Maus

Quelle: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+{{}} Bildgebung des enterischen Nervensystems. J. Vis. Exp.  (2015){{}}Dieses Video demonstriert Kalzium Bildgebung zur Visualisierung und Analyse der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Präparaten des myenterischen Plexus colon der Maus.

Calcium-Bildgebung von enterischen Neuronen- und Gliaaktivitäten in einem myenterischen Plexus des Dickdarms der Maus

Wir demonstrieren ein Zellkulturprotokoll für die direkte Untersuchung von neuronalen und glialen Komponenten des enterischen Nervensystems. Eine Neuron/Glia-Mischkultur auf Deckgläsern wird aus dem myenterischen Plexus einer adulten Maus hergestellt und bietet die Möglichkeit, die Funktion einzelner Neuronen und Gliazellen elektrophysiologisch, immunhistochemisch usw. zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

In den vergangenen Jahren wurden neue Generation Endoskope wichtige diagnostische Forschung Hilfsmittel zum Auswerten murinen Colitis und kolorektalen Tumoren entwickelt. Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für endoskopische Beurteilung von Entzündungen und kolorektalen Tumoren in Mäusen, sowie eine neuartige Bewertungssystem, das Dezimal-Identifikatoren verwendet, um die Schwere der endoskopischen ulcerosa und kolorektalen Tumoren dokumentiert.

Flexible Koloskopie in der Maus, um die Schwere der Colitis und kolorektalen Tumoren auswerten mit einem validierten Endoskopische Scoring System

Wir beschreiben Methoden zur longitudinalen Überwachung der Wirksamkeit von Therapeutika zur Behandlung von Dickdarmpathologien bei Mäusen mit einem starren Endoskop. Dieses Protokoll kann leicht für die Charakterisierung des therapeutischen Ansprechens eines einzelnen Tumors bei lebenden Mäusen und auch für die Überwachung eines möglichen Krankheitsrückfalls verwendet werden.

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

Dieser Artikel beschreibt eine Videobildgebungstechnik und hochauflösende raumzeitliche Kartierung, um Veränderungen in der neuronalen Regulation der Dickdarmmotilität bei erwachsenen Mäusen zu identifizieren. Subtile Auswirkungen auf die gastrointestinale Funktion (GI) können mit diesem Ansatz in isolierten Gewebepräparaten nachgewiesen werden, um unser Verständnis von GI-Erkrankungen zu verbessern.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Mesenteriale afferente Nerven übermitteln Informationen aus dem Magen-Darm-Trakt zum Gehirn bezüglich der normalen Homöostase sowie der Pathophysiologie. Die Aktivität des gastrointestinalen afferenten Nervs kann beurteilt werden, indem isolierte Darmsegmente mit angeschlossenen afferenten Nerven in ein Organbad eingebaut, der Nerv isoliert und die basale sowie stimulierte Aktivität beurteilt werden.

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Anormale sensorische Funktion zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome von funktionellen und entzündlichen Darmerkrankungen. Ein Protokoll für die elektrophysiologische Aufzeichnung der Kolon afferenten Nerven in eine ex Vivo Ratte Colorectum Vorbereitung wird hier vorgestellt.

In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Erfahren Sie die funktionelle Charakterisierung kolorektaler Nervenendigungen bei der Maus mittels Einzelfaser-Elektrophysiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanosensitiver und chemischer Reaktionsprofile.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

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