In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, die in vitro Aktivität splanchnischer afferenter Nerven aus einem einzelnen jejunalen oder kolonischen Nervenbündel in Reaktion auf rampenförmige Dehnungen und die Applikation von Substanzen aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, ob afferente Nerven, die den Gastrointestinaltrakt versorgen, bei verschiedenen Krankheitszuständen überempfindlich oder unterempfindlich werden. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie die Aufzeichnung der Nervenentladung in vitro ermöglicht und es erlaubt, die Nervenaktivität quantitativ zu erfassen, ohne Modulationen oder Einflüsse des zentralen Nervensystems.

Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie oder Diagnose mehrerer Schmerzsyndrome, wie zum Beispiel des Reizdarmsyndroms, hinein, da eine Nervensensibilisierung bei der Pathogenese eine wesentliche Rolle spielt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Präparation von Nervenbündeln und die Einzel-Einheiten-Analyse des aufgezeichneten Signals eine erhebliche Trainingszeit erfordern. Um dieses Verfahren zu beginnen, bringen Sie die getötete Maus in Rückenlage.

Führen Sie einen medianen Bauchschnitt durch Haut und Bauchmuskulatur mit einem Skalpell von der Schwertfortsatz bis zum Schambein durch. Danach spülen Sie die Bauchhöhle mit kalter Krebs-Lösung aus, um zu verhindern, dass die intraabdominalen Gewebe austrocknen. Entfernen Sie anschließend schnell den gesamten Dünndarm mit einer scharfen Schere, indem Sie etwa 20 Zentimeter des Dünndarms ab dem Duodenojejunalbogen entfernen.

Vermeiden Sie es sorgfältig, die umliegenden Strukturen zu beschädigen, und bewahren Sie das Mesenterium des Darms, das jejunale Blutgefäße und afferente Nerven enthält, intakt. Anschließend wird das entfernte Jejunum in kalte Krebs-Lösung auf Eis gelegt, während es kontinuierlich mit Carbigen belüftet wird. Danach schneiden Sie das Jejunum in etwa drei Zentimeter lange Schleifen.

Suchen Sie das mesenteriale Bündel mit den Gefäßen und dem splanchnischen Nerv in der Mitte der jeweiligen Schleife, um die Montage der Schleife in der Messkammer zu erleichtern. Spülen Sie anschließend jedes Segment mit einer stumpfen Kanüle mit Krebs-Lösung aus, um die luminalen Inhalte und den Chymus zu entfernen, da diese Verdauungsenzyme enthalten, die den Zerfall der Gewebeprobe in vitro beschleunigen würden. Danach wählen Sie ein Segment zur Messung der afferenten Nervenaktivität aus und platzieren Sie es in der Messkammer, die mit einer Silikonelastomerschicht gekennzeichnet ist.

Halten Sie die Krebs-Temperatur in der Aufzeichnungskammer bei 34 Grad Celsius. Befestigen Sie dann das jejunale Segment im Organtrog, sodass das orale Ende mit dem Spritzenantrieb verbunden ist, der den luminalen Fluss bereitstellt, und das aborale Ende mit dem Ausfluss verbunden ist. Spannen Sie das Segment leicht an, achten Sie jedoch darauf, keine übermäßige Zugkraft auszuüben.

Befestigen Sie beide Enden mit Seidenligaturen an den Ein- und Ausflussanschlüssen. Anschließend befestigen Sie den Spritzenpumpenantrieb am oralen Ende und perfundieren das Jejunalsegment intraluminal mit Krebs-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 Millilitern pro Stunde. Heften Sie das Mesenterium des montierten Darmsegments flach gegen die untere Silikonelastomerschicht.

Streichen Sie anschließend das Mesenterium, um die Visualisierung des mesenterialen Gefäßbündels zu optimieren. Führen Sie danach einen Test zur Rampendehnung durch, indem Sie den Auslass verschließen, bis der intraluminale Druck des Darmabschnitts 60 Millimeter Quecksilber erreicht, um sicherzustellen, dass keine intraluminale Krebs-Lösung aus dem montierten Segment austritt. Achten Sie auf einen gleichmäßigen Anstieg des intraluminalen Drucks ohne Unterbrechungen.

Erwarten Sie kleine Kontraktionen des Segments während der anfänglichen Dehnungsphase. Falls erforderlich, blockieren Sie die peristaltische Aktivität durch Zugabe von einem Mikromol des L-Typ-Calciumkanalblockers Nifedipin zur Krebs-Lösung. Unter einem Stereomikroskop beginnen Sie vorsichtig, das Fettgewebe vom Mesenterium abzulösen, indem Sie mit zwei kleinen Pinzetten vorsichtig daran ziehen, wobei Sie darauf achten, die in dem Fettgewebe liegenden Gefäße und den afferenten Nerv nicht zu beschädigen.

Beginnen Sie damit, das Fettgewebe in einigem Abstand vom Jejunum abzulösen, um beide Blutgefäße im mesenterischen Bündel freizulegen. Identifizieren Sie den afferenten jejunalen Nerv zwischen beiden Gefäßen als dünnen, weißen Faden, der im Fettgewebe eingekapselt ist. Lösen Sie ihn anschließend weiter proximal in Richtung Jejunum, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette das Fettgewebe entfernen.

Als Nächstes dissezieren Sie den mesenterialen Nerv des Jejunalsegments, indem Sie das am Nerv anhaftende Fettgewebe entfernen. Durchtrennen Sie den Nerv mit einer scharfen Schere. Falls erforderlich, lösen Sie vorsichtig das verbleibende Fett- und Bindegewebe sowie die epineurale Hülle durch vorsichtiges Ziehen.

Bei diesem Verfahren senken Sie mit einem Mikromanipulator die Spitze der Saugelektrode in das Organgefäß ab. Saugen Sie dann vorsichtig etwas Krebs-Lösung aus dem Organgefäß, sodass die Spitze der Elektrode in der Krebs-Lösung eingetaucht ist. Stellen Sie sicher, dass die Krebs-Lösung die Drahtelektrode innerhalb der Saugelektrode bedeckt.

Positionieren Sie anschließend die Spitze der Saugelektrode unmittelbar neben dem durchtrennten afferenten Nervenstrang und ziehen Sie den durchtrennten Nervenstrang über seine gesamte Länge in die Kapillare hinein. Führen Sie die Elektrodenspitze in Richtung des Fettgewebes und saugen Sie dieses mit dem Kolben in die Glas­kapillare ein, wodurch der Nerv mechanisch innerhalb der Kapillare gegenüber dem Inhalt des Organtanks abgedichtet wird. Eine ausreichende Abdichtung der Glas­kapillare gegenüber der Ableitkammer durch Aspiration von umliegendem Fettgewebe in die Kapillare ist entscheidend, um störendes Hintergrundrauschen zu minimieren, das letztlich die endgültige Analyse beeinträchtigen würde.

Um die Aufzeichnung der afferenten Nervenaktivität zu überprüfen, führen Sie eine rampenförmige Dehnung durch, die zu einem Anstieg der afferenten Feuertätigkeit führt, indem Sie den Auslass verschließen, wodurch sich der Druck im Darmabschnitt allmählich erhöht. Führen Sie das gewünschte experimentelle Protokoll erst dann durch, wenn drei aufeinanderfolgende rampenförmige Dehnungen eine reproduzierbare multieinheitliche Entladung ergeben. Stabilisieren Sie das Präparat nach der Nervenisolation 15 Minuten lang, um eine stabile spontane afferente Nervenaktivität zu erzielen, bevor die eigentlichen Experimente durchgeführt werden.

Hier ist eine schematische Darstellung verschiedener afferenter Fasereinheiten basierend auf ihrem mechanosensitiven Profil gezeigt. Fasern mit niedriger Schwelle zeigen überwiegend eine erhöhte Nervenaktivität bei geringen Dehnungsdrücken, was zu einem LT-Prozentsatz von über 55 % führt. Fasern mit hoher Schwelle hingegen zeigen erst bei nozizeptiven Drücken eine Zunahme der Feuerrate. Fasern mit großem dynamischen Bereich zeigen einen allmählichen Anstieg der Nervenaktivität während der gesamten Dehnung, während mechanisch inempfindliche Fasern nicht auf zunehmende Dehnungsdrücke reagieren.

Diese Abbildung zeigt die afferente Nervenaktivität im Mesenterium von Wildtyp-Mäusen während einer rampenförmigen Dehnung. Beachten Sie, dass im zweiphasigen Dehnungsprofil der anfängliche Anstieg der Nervenaktivität auf Fasern mit niedriger Schwelle und weitem dynamischen Bereich zurückzuführen ist, während Fasern mit hoher Schwelle und weitem dynamischen Bereich zum zweiten Anstieg der Aktivität beitragen. Sobald die Methode beherrscht ist, können die Isolation des jejunalen Nervs und die erste Grundlinienaufzeichnung, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden, in weniger als einer Stunde abgeschlossen sein.

Mehr Zeit ist erforderlich, wenn die Wirkung von in das Organgefäß verabreichten Verbindungen untersucht wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, einen gut standardisierten Ansatz beizubehalten, beispielsweise durch die konsistente Identifizierung desselben Segmentes für alle Experimente. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Isolierung von dorsalen Wurzelganglien mit anschließender Kalzium-Bildgebung durchgeführt werden, um zu untersuchen, welche Relaisstationen im gastrointestinalen Nervensystem an der Pathogenese mehrerer Erkrankungen beteiligt sind.

Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik es Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften ermöglicht, die Pathogenese mehrerer Schmerzsyndrome in der gastrointestinale Forschung zu erforschen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man afferente Nerven des Jejunums aus dem gastrointestinalen Trakt der Maus isoliert und ihre Aktivität während rampenförmiger Dehnungen aufzeichnet.