In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, in vitro die Aktivität des afferenten Nervus splanchnicus von einem einzelnen Bündel des Jejunalnervs oder des Dickdarmnervs als Reaktion auf Rampendehnungen und die Applikation von Verbindungen aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. ob afferente Nerven, die den Magen-Darm-Trakt versorgen, während verschiedener Krankheitszustände hypersensibilisiert oder desensibilisiert sind. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Aufzeichnung von Nervenentladungen in vitro ermöglicht und dass sie es ermöglicht, die Nervenaktivität ohne Modulation oder Eingaben des Zentralnervensystems zu quantifizieren.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose verschiedener Schmerzsyndrome, wie z. B. des Reizdarmsyndroms, da die Nervensensibilisierung eine wichtige Rolle bei der Pathogenese spielt. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Sezieren von Nervenbündeln und die Analyse des aufgezeichneten Signals in einer einzelnen Einheit einen erheblichen Schulungsaufwand erfordert. Um diesen Vorgang zu starten, platzieren Sie die geopferte Maus in Rückenlage.

Führen Sie mit einem Skalpell, das sich vom Xiphoid-Prozess bis zum Schambein erstreckt, einen Schnitt durch die Bauchmittellinie durch die Haut und die Bauchmuskelschicht durch. Spülen Sie anschließend die Bauchhöhle mit kalter Krebslösung aus, um ein Austrocknen des intraabdominalen Gewebes zu verhindern. Entfernen Sie dann schnell das gesamte Jejunum mit einer scharfen Schere, indem Sie etwa 20 Zentimeter des Dünndarms entfernen, beginnend unmittelbar von der Zwölffingerdarmflexur.

Achten Sie darauf, die umliegenden Strukturen nicht zu beschädigen, und halten Sie das Mesenterium des Darms, in dem sich die jejunalen Blutgefäße und afferenten Nerven befinden, intakt. Legen Sie anschließend das herausgeschnittene Jejunum in kalte Krebslösung auf Eis, während Sie es kontinuierlich mit Carbigen sauerstoffreichern. Schneide dann das Jejunum in etwa drei Zentimeter lange Schlaufen.

Lokalisieren Sie das Mesenterialbündel, das die Gefäße und den Nervus splanchnicus enthält, in der Nähe des Zentrums der jeweiligen Schleife, um die Montage der Schleife in der Aufnahmekammer zu erleichtern. Spülen Sie anschließend jedes Segment mit Krebslösung mit einem stumpfen Katheter, um den luminalen Inhalt und den Speisebrei zu entfernen, da sie Verdauungsenzyme enthalten, die die Verschlechterung der Gewebeprobe in vitro beschleunigen. Wählen Sie danach ein Segment zur Messung der Aktivität des afferenten Nervs aus und platzieren Sie es in der Aufzeichnungskammer, die mit einer Silikonelastomerschicht codiert ist.

Halten Sie die Krebstemperatur in der Aufnahmekammer bei 34 Grad Celsius. Montieren Sie dann das Jejunalsegment in das Organbad, so dass das orale Ende mit dem Spritzentreiber verbunden ist, der den luminalen Fluss liefert, und das aborale Ende mit dem Ausfluss verbunden ist. Dehnen Sie das Segment leicht, aber achten Sie darauf, keine übermäßige Spannung auszuüben.

Befestigen Sie beide Enden mit Seidenligaturen fest an den Ein- und Auslassöffnungen. Befestigen Sie anschließend den Spritzentreiber an der oralen Seite und perfundieren Sie das Jejunalsegment intraluminös mit Krebslösung bei 10 Millilitern pro Stunde. Stecken Sie das Mesenterium des montierten Darmsegments flach gegen die untere Schicht des Silikonelastomers.

Dehnen Sie dann das Mesenterium, um die Visualisierung des Mesenterialbündels zu optimieren. Führen Sie anschließend einen Test der Rampendehnung durch, indem Sie die Ausgangsöffnung schließen, bis der intraluminale Druck des Darmsegments 60 Millimeter Quecksilbersäule erreicht, um sicherzustellen, dass keine intraluminale Krebslösung aus dem montierten Segment austritt. Beobachten Sie einen sanften Anstieg des intraluminalen Drucks ohne Unterbrechungen.

Erwarten Sie kleine Kontraktionen des Segments während der anfänglichen Dehnungsphase. Blockieren Sie bei Bedarf die peristaltische Aktivität, indem Sie der Krebs-Lösung ein Mikromol des L-Typ-Kalziumkanalblockers Nifedipin hinzufügen. Beginnen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig, das Fettgewebe vom Mesenterium abzulösen, indem Sie vorsichtig mit zwei kleinen Pinzetten daran ziehen, wobei Sie darauf achten, die Gefäße und den afferenten Nerv, die im Fettgewebe vergraben sind, nicht zu beschädigen.

Beginnen Sie, das Fettgewebe in einiger Entfernung vom Jejunum abzuziehen, um beide Blutgefäße im Mesenterialbündel freizulegen. Identifizieren Sie den afferenten Nervus jejunalis zwischen beiden Gefäßen als einen dünnen weißen Faden, der im Fettgewebe eingekapselt ist. Präparieren Sie es dann proximal in Richtung Jejunum, indem Sie das Fettgewebe vorsichtig mit einer Pinzette abziehen.

Als nächstes wird der Nervus mesenterica jejunus des Segments präpariert, indem das am Nerv haftende Fettgewebe entfernt wird. Durchschneiden Sie den Nerv mit einer scharfen Gewebeschere. Schälen Sie bei Bedarf das restliche Fett und Bindegewebe sowie die epineurale Hülle durch leichtes Ziehen ab.

Bei diesem Verfahren wird die Spitze der Saugelektrode mit einem Mikromanipulator in das Organbad abgesenkt. Saugen Sie dann vorsichtig etwas Krebslösung aus dem Organbad ab, so dass die Spitze der Elektrode in die Krebslösung eingetaucht wird. Stellen Sie sicher, dass die Krebslösung die Drahtelektrode in der Saugelektrode bedeckt.

Positionieren Sie anschließend die Spitze der Saugelektrode unmittelbar neben dem durchtrennten afferenten Nervenstrang und ziehen Sie den durchtrennten Nervenstrang über seine gesamte Länge in die Kapillare hinein. Manövrieren Sie die Spitze der Elektrode in Richtung des Fettgewebes und saugen Sie sie mit dem Kolben in die Glaskapillare ab, wodurch der Nerv in der Kapillare mechanisch gegen den Inhalt des Organbads abgedichtet wird. Die adäquate Abdichtung der Glaskapillare von der Aufzeichnungskammer durch Ansaugen eines Teils des umgebenden Fettgewebes in die Kapillare ist entscheidend, um das redundante Hintergrundrauschen zu minimieren, das letztendlich die endgültige Analyse behindert.

Um die Aufzeichnung der Aktivität des afferenten Nervs zu verifizieren, führen Sie eine durch Rampendehnung induzierte Erhöhung des afferenten Feuerns durch, indem Sie die Ausgangsöffnung schließen, um zu einem allmählichen Druckanstieg im Darmsegment zu führen. Führen Sie das gewünschte Versuchsprotokoll nur durch, wenn drei aufeinanderfolgende Rampendehnungen zu einer reproduzierbaren Entladung mehrerer Einheiten führen. Nach der Nervenisolierung stabilisieren Sie das Präparat für 15 Minuten, um eine gleichmäßige spontane Aktivität des afferenten Nervs zu erhalten, bevor Sie die eigentlichen Experimente durchführen.

Hier ist eine schematische Darstellung verschiedener afferenter Fasereinheiten basierend auf ihrem mechanosensitiven Profil dargestellt. Niederschwellige Fasern weisen überwiegend bei niedrigen Dehnungsdrücken eine erhöhte Nervenaktivität auf, was zu einem LT-Anteil von über 55 % führt. Hochschwellige Einheiten zeigen dagegen nur bei schädlichen Drücken eine Erhöhung der Feuerrate. Fasern mit großem Dynamikbereich zeigen eine allmähliche Zunahme der Nervenaktivität während der gesamten Dehnung, während mechanisch unempfindliche Fasern nicht auf steigende Dehnungsdrücke reagieren.

Diese Abbildung zeigt die Entladung des Nervus mesenterialis afferentus bei den Wildtyp-Mäusen während der Rampendehnung. Es ist zu beachten, dass im biphasischen Dehnungsprofil der anfängliche Anstieg der Nervenentladung auf Fasern mit niedriger Schwelle und großem Dynamikbereich zurückzuführen ist, während Fasern mit hoher Schwelle und breitem Dynamikbereich zur zweiten Zunahme der Entladung beitragen. Einmal gemeistert, kann die Isolierung des Nervus jejunalis und die erste Baseline-Aufzeichnung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei der Untersuchung der Wirkung von Verbindungen, die in das Organbad verabreicht werden, ist mehr Zeit erforderlich. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, einen gut standardisierten Ansatz beizubehalten, z. B. die konsistente Identifizierung desselben Segments für alle Experimente. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Isolierung von Spinalganglien mit anschließender Kalziumbildgebung durchgeführt werden, um zu beurteilen, welche Relaisstationen im gastrointestinalen Nervensystem an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen beteiligt sind.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Pathogenese verschiedener Schmerzsyndrome in der Magen-Darm-Forschung zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie jejunale afferente Nerven aus dem Magen-Darm-Trakt der Maus isolieren und die Aktivität von ihm während der Rampendehnung aufzeichnen können.