Name: In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Aufnahme mesenterialer afferenter Nervenaktivität in Mäusen. Diese Methode erfasst Reaktionen auf Dehnung und chemische Stimuli im Jejunum und Kolon. Sie hilft Forschern, Nervenfunktionen bei gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.

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SN führte die oben beschriebenen Experimente durch, führte die Datenanalyse durch und verfasste das Manuskript. AD und JDM implementierten die Technik in unseren Forschungseinrichtungen und halfen bei der Datenanalyse. HC half bei der Durchführung der Experimente. WJ, CK und DG halfen bei der Implementierung der afferenten Messtechnik in unserem Labor, der Datenanalyse und der Interpretation der Ergebnisse. SF, JDM und BDW haben die Studie konzipiert. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript kritisch gelesen und genehmigt. SN ist Aspirant des Fonds für wissenschaftliche Forschung (FWO), Flandern (11G7415N). Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der FWO (G028615N und G034113N).

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt eine reproduzierbare Labortechnik mesenteric afferenten Nervenaktivität bei Nagetieren zu studieren als 3,4,7,8,12,20,21,31 von unserer Gruppe und andere. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls gehören die schnelle Isolierung des Gewebes, das Streben des Nervenstrang in die Saugelektrode und die angemessene &quot;Versiegelung&quot; der Glaskapillare aus dem Organbad durch umgebende Fettgewebe in die Kapillare abgesaugt. Die Öffnung der Glaskapillare sollte gena...

Sensory-Signalisierung und die Schmerzwahrnehmung ist ein komplexer Prozess, der zwischen afferenten Nerven, Rücken Neuronen, auf- und absteigende fazilitierenden und hemmenden Bahnen und verschiedene Hirnregionen aus einem komplizierten Zusammenspiel ergibt. Als solche Änderungen an einer oder mehreren dieser Stufen in veränderte sensorische Signalgebung und viszeralen Schmerzen bei Krankheitszuständen führen können. Um all diese verschiedenen Aspekte der sensorischen Signal mehrere Techniken studieren wurden von Einzelzellexperimenten entwickelt Bereich (zB Kalzium - Imaging auf Neuronen) auf ganze Tiermodellen (zB Verhaltensreaktionen wie die viszeromotorische Antwort). Die Technik , die in diesem Papier beschrieben ermöglicht es den Forschern , um spezifisch zuführenden Nervenaktivität in vitro aus einem isolierten Segment des Dünndarms oder Dickdarms bei Nagetieren zu bewerten. Kurz gesagt, ein isoliertes Magen-Darm-Segment (in der Regel Jejunum oder Kolon) in einem eigens errichteten Aufnahmekammer mit einer physiologischen K durchbluteten montiertrebs Lösung. Der Splanchnicus wird freipräpariert und mit einer Elektrode verbunden Registrierung von afferenten neuronalen Aktivität in splanchnic oder Becken afferenten Nerven ermöglicht. Nervenaktivität kann basal oder als Reaktion auf zunehmenden intraluminalen Druck und / oder pharmakologische Verbindungen aufgezeichnet werden , die entweder direkt in die Aufnahmekammer eingesetzt werden kann (serös), oder über die intraluminale Perfusat (mukosal) ihre Wirkung auf afferenten Entladung zu bewerten 1-6 . Zu beachten ist, splanchnici enthalten auch Efferenzen und viscerofugal afferents zusätzlich zu den sensorischen Afferenzen. Einer der wichtigsten Vorteile von ex vivo Splanchnicus Aufnahme ist die Tatsache , dass die Forscher die Nervenaktivität ohne Modulation oder Input aus dem zentralen Nervensystem zu quantifizieren, so dass man die direkte Wirkung von lokal applizierten Verbindungen auf die Nervenaktivität zu untersuchen. Weiterhin Überwachung von Vitalparametern, wie notwendig ist , die in vivo - Ansatz (siehe unten), ist no mehr relevant. In - vitro - splanchnic Aufnahme ist schließlich viel weniger zeitaufwendig als die in - vivo - Pendant. Zuführenden neuronalen Aktivität in Reaktion auf andere Reize, wie Schleimhaut Streicheln, Sondieren mittels von Frey Haare oder Dehnen des Segments können in einer modifizierten Versuchsaufbau untersucht werden, in denen das Darmgewebe ist festgenagelt und in Längsrichtung geöffnet (die im Gegensatz zu unser Setup ein intaktes Segment) verwenden, wie es in einer früheren Ausgabe 7,8 beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde erst kürzlich eine Technik beschrieben colonic afferenten Nervenaktivierungs in der Kolonwand selbst über Calcium Bildgebung zu studieren, wieder festgenagelt Verwendung longitudinal geöffnet Segment 9. Eine alternative Version dieser in vivo - Technik besteht aus neuronale Aktivierung in der Nähe der Eintrag des afferenten in das Rückenmark zu messen. Kurz gesagt, wird die sedierten Tier in der Bauchlage, e platziertxposing lumbosakralen Rückenmark ein Paraffin gefüllt und mit der Haut des Einschnitts an dem die afferente von Interesse Projekte durch Laminektomie, den Bau und die dorsale rootlet über eine Platin bipolaren Elektrode 10,11 drapieren. Diese Technik erlaubt zudem Forscher Fasern zu charakterisieren basierend auf ihrer Leitungsgeschwindigkeit und unterscheiden unmyelinated C-Fasern, die aus dünn myelinisierten A &amp; dgr-Fasern. Weiterhin dorsalen Wurzelfasern enthalten ausschließlich sensorischen afferenten Fasern, im Gegensatz zu den gemischten und abführenden splanchnici zuvor erwähnt. Aufnahme afferenten Nervenentladung in vitro aus isolierten Darmsegmente können auch unter Verwendung von humanen Proben durchgeführt werden, als zwei Forschergruppen unabhängig veröffentlicht first-in-man Manuskripte Kolon afferenten Nervenaktivität in menschlichen Resektionsproben 12,13 Aufnahme. Die Umsetzung dieser Technik in einem mehr führen könnte leicht translatiauf der Maus-Daten an den humanen Zustand und könnte den Forschern ermöglichen, auf einfache Weise Medikamente zu identifizieren, die sensibilisiert sensorischen Nerven Targeting. Die klinische Bedeutung der zuführenden Nervenaktivität zu charakterisieren, sowie die Entdeckung neuer therapeutischer Reagenzien , die exorbitant afferenten Nervenaktivität Ziel, wurde von vielen Experten auf dem Gebiet 14-19 ausführlich diskutiert. Die zuvor genannte In - vitro - Technik ergänzt die am häufigsten in vivo - Messung von afferenten Nervenaktivität bekannt. Während in vivo kann neuronalen Aktivitätsmessung, Nervenaktivität direkt im sediert Tieres gemessen werden , während der das interessierende Segment identifiziert wird und anschließend intubiert und ein flüssiges Paraffin gefüllt und wird mit Hilfe der Bauchdecke und die Haut 20 des Nagetier konstruiert. Der afferente von Interesse wird dann identifiziert, geschnitten und auf einer bipolaren Platinelektrode gelegt, die neuronale Aktivität ermöglicht Messung!t. Diese Technik erlaubt es dem Forscher afferenten Nervenaktivität zu modulieren, wenn auch sediert Tiere in lebenden; als solche kann man reagieren neuronale Aktivität zu Störungen wie luminalen Distension oder intravenöser Verabreichung einer Verbindung studieren. Translationale Forschung heutzutage konzentriert sich hauptsächlich auf die Anwendung von Menschen stammenden Überstände (z. B. aus Kolonbiopsien, kultivierten peripheren mononukleären Blutzellen, etc.) auf jejunal und / oder Kolon - Maus Afferenzen 21,22. Die Forscher können direkt Stände gelten entweder in das Organ Bad oder in die intraluminale Lösung, die das Darmsegment perfundiert, so dass die unterschiedlichen Wirkungen von serösen gegen Schleimhaut-Anwendung kann auf afferenten Nervenentladung untersucht werden. Als solches war es, dass Kolon-Schleimhaut-Biopsie supernatans von Patienten mit Reizdarmsyndrom gezeigt, Überempfindlichkeit in Maus Kolon Afferenzen, Meerschweinchen submucöse Neuronen und Maus dorsalen Wurzel verursachenGanglionneuronen 21,23,24. Schließlich wird die neuronale Aktivität der Aufnahme nicht auf die mesenterialen eingeschränkt und / oder Becken Neuronen Innervation des Magen-Darm-Trakt. Andere haben gezeigt, dass Nerven Aufnahmen können in afferents Versorgung des Kniegelenks 25 durchgeführt werden, während andere Blase afferenten Nervenaktivität gekennzeichnet sind und 26-28, und zeigte , dass Becken Afferenzen aus der Blase als auch den Magen - Darm - Trakt zusammenlaufen, was möglicherweise zu neuronalen Übersprechens 29.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>VWR Chemicals</td><td>27.810.295</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4)</td><td>VWR Chemicals</td><td>1.063.461.000</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.063.291.000</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>1.058.861.000</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>23.811.000</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>VWR Chemicals</td><td>1011175P</td><td>Verbindung Krebs Lösung</td></tr><tr><td>Destillierte</td><td></td><td></td><td>Wasserverbindung Krebslösung</td></tr><tr><td>PVC-Schläuche</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf</td><td></td><td>Das Darmsegment sollte über PVC-Schläuchen montiert werden</td></tr><tr><td>Silikonschläuche</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf</td><td></td><td>Der Rest des Schlauchs, idealerweise auf Silikonbasis - leichteres Entfernen von Schmutz im Schlauch</td></tr><tr><td>Seidenfaden</td><td>Pearsall Limited</td><td>10B15S220</td><td>Befestigung des Segments über dem PVC-Schlauch</td></tr><tr><td>Spritzentreiber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-2222</td><td>Intraluminale Infusion von Krebs</td></tr><tr><td>Binokular - inkl. 10-facher Vergrößerung im Oculair</td><td>Zeiss STEMI 2000</td><td></td><td>Optimale Visualisierung für die Dissektion des Nervus afferentus</td></tr><tr><td>Hoötherme Decke Steuereinheit</td><td>Harvard Apparat</td><td>507214</td><td>Erwärmung der Organkammer</td></tr><tr><td>Maßgeschneidertes Organbad mit Sylgard überzogenem Boden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spike2 Software</td><td></td><td></td><td>Aufzeichnung und Analyse der Daten</td></tr><tr><td>Insektenstifte, 500 Stück, Edelstahl, Durchmesser 0,2 mm</td><td>Austerlitz Insektenstifte minutiens</td><td>Präparierung des Nervus afferentus</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5 Inox 11 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>Dissektion des Nervus</td></tr> <tr><td>afferentusSchere, Feder, 14 cm</td><td>World Precision Instrument</td><td>15905</td><td>Dissektion des afferenten Nervs</td></tr><tr><td>DB digitimer&nbsp;</td><td>NL 108T2/10</td><td></td><td>Druckmessumformer</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-3333</td><td>3D-Manipulation der Saugelektrode</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>X-4 rotierender Block</td><td></td><td>3D-Manipulation der Saugelektrode</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>GJ-8 magnetischer Ständer</td><td></td><td>3D-Manipulation der Saugelektrode</td></tr><tr><td>LightSource</td><td>Euromex Mikroskope Holland EK-1</td><td></td><td>Optimale Visualisierung für die Dissektion des Nervus afferent</td></tr><tr><td>CED 1401 Aufzeichnungsapparat</td><td></td><td></td><td>Aufzeichnung der Aktivität des Nervus afferent</td></tr><tr><td>Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator</td><td>Quest Scientific Instruments</td><td></td><td>Eliminierung von Hintergrundgeräuschen</td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td><td>Gibson Minipuls 2</td><td></td><td>Infusion der Organkammer, in der das Segment montiert ist</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenhalter Halbzellen 1,5 mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>MEH2SW</td><td>Saugelektrode zur Isolierung der afferenten Faser</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillaren, 300 Stück; 1,5/0,84 OD/ID</td><td>World Precision Instrument</td><td>1B150-4</td><td>Kapillare zur Isolierung des Nervus afferent</td></tr></tbody></table>

in - vitro - aufnahme von mesenteriale afferenten nervenaktivität in maus - jejunal und kolon - segmente

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferenten Nerven nicht nur Informationen über die normale Physiologie vermitteln, sondern auch die Signal gestörter Homöostase und pathophysiologischen Prozessen der verschiedenen Organsysteme von der Peripherie in Richtung des zentralen Nervensystems. Als solche hat die erhöhte Aktivität oder &quot;Sensibilisierung&quot; von mesenterischen afferenten Nerven wurde eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der viszerale Hypersensitivität und Bauchschmerzsyndromen zugeordnet. Mesenteriale afferenten Nerven - Aktivität in vitro in einem isolierten Darm-Segment gemessen werden , die in einem eigens errichteten Organbad montiert ist und aus dem die Splanchnicus isoliert ist, so dass die Forscher direkt Nervenaktivität neben dem Magen - Darm - Segment zu beurteilen. Aktivität kann in standardisierten Bedingungen an der Basislinie aufgezeichnet werden, während der Aufblähung des Segments oder nach der Zugabe von pharmakologischen Verbindungen geliefert intraluminal oder serös. Diese Technik ermöglichtdie Forscher leicht die Wirkung von Medikamenten untersuchen das periphere Nervensystem in Kontrollproben ausgerichtet sind; Außerdem liefert es wichtige Informationen darüber, wie die neuronale Aktivität während der Krankheit verändert. Es sollte jedoch beachtet werden , dass nur afferente neuronale Aktivität Messung der Aktivität einer Relaisstation in der komplexen neuronalen bildet Signalkaskade, und Forscher sollten bedenken , nicht auf die neuronale Aktivität auf anderen Ebenen (zB Dorsalwurzelganglien, Rückenmark oder das zentrale Nervensystem übersehen ), um die komplexen neuronalen Physiologie in Gesundheit und Krankheit vollständig aufzuklären. Häufig verwendete Anwendungen umfassen die Untersuchung der neuronalen Aktivität in Reaktion auf die Verabreichung von Lipopolysaccharid und das Studium der afferenten Nerven-Aktivität in Tiermodellen von Reizdarmsyndrom. In einem translationalen Ansatz kann der isolierten Maus intestinalen Segment colonic Überständen von IBS-Patienten ausgesetzt werden. Weiterhin ist eine Modifikationdieser Technik in menschlichen Kolon-Proben vor kurzem anwendbar erwiesen hat.

Jejunal afferenten Nervenaktivität wurde zu Beginn der Studie gemessen und als Reaktion OF-1-Mäusen Aufblähung in 9 acht Wochen alte männliche Rampe. Die Tiere wurden in Gruppen in standardisierten Bedingungen (6 Tiere pro Käfig, 20-22 ° C, Luftfeuchtigkeit 40 - 50%, 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus) untergebracht ist mit unbegrenzten Zugang Wasser und regulärem Futter zu erschließen. Jejunumsegmenten der Mäuse zeigten unregelmäßige spontane afferente Entladung zu Beginn der Studie bei ein...

Mesenteriale afferente Nerven übermitteln Informationen aus dem Magen-Darm-Trakt zum Gehirn bezüglich der normalen Homöostase sowie der Pathophysiologie. Die Aktivität des gastrointestinalen afferenten Nervs kann beurteilt werden, indem isolierte Darmsegmente mit angeschlossenen afferenten Nerven in ein Organbad eingebaut, der Nerv isoliert und die basale sowie stimulierte Aktivität beurteilt werden.

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, die in vitro Aktivität splanchnischer afferenter Nerven aus einem einzelnen jejunalen oder kolonischen Nervenbündel in Reaktion auf rampenförmige Dehnungen und die Applikation von Substanzen aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, ob afferente Nerven, die den Gastrointestinaltrakt versorgen, bei verschiedenen Krankheitszuständen überempfindlich oder unterempfindlich werden. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie die Aufzeichnung der Nervenentladung in vitro ermöglicht und es erlaubt, die Nervenaktivität quantitativ zu erfassen, ohne Modulationen oder Einflüsse des zentralen Nervensystems.Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie oder Diagnose mehrerer Schmerzsyndrome, wie zum Beispiel des Reizdarmsyndroms, hinein, da eine Nervensensibilisierung bei der Pathogenese eine wesentliche Rolle spielt. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Präparation von Nervenbündeln und die Einzel-Einheiten-Analyse des aufgezeichneten Signals eine erhebliche Trainingszeit er

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Dieses Video zeigt eine Methode zur Aufzeichnung der Aktivität von zuvorkommenden Nervus des Dickdarms in einem ex-vivo-Dickdarm einer Ratte, die an beiden Enden kanüliert und mit Kochsalzlösung infundiert wurde, um den intraluminalen Druck zu erhöhen. Wenn der Druck steigt, steigt das Nervensignal an, was auf seine Stimulation hinweist.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von zuvorkommenden Nervus des Dickdarms in einem ex vivo Dickdarm der Ratte

Dieses Video zeigt den Prozess der Aufzeichnung elektrischer Signale von mesenterialen afferenten Nerven in einem präparierten Jejunalsegment der Maus, um die Auswirkungen von Gewebedruck und Bewegungsänderungen auf die Aktivität des afferenten Nervs zu untersuchen.

Aufzeichnung der Aktivität des Nervus mesenterialis afferent in einem ex vivo Jejunumsegment der Maus

Quelle: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+{{}} Bildgebung des enterischen Nervensystems. J. Vis. Exp.  (2015){{}}Dieses Video demonstriert Kalzium Bildgebung zur Visualisierung und Analyse der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Präparaten des myenterischen Plexus colon der Maus.

Calcium-Bildgebung von enterischen Neuronen- und Gliaaktivitäten in einem myenterischen Plexus des Dickdarms der Maus

Wir demonstrieren ein Zellkulturprotokoll für die direkte Untersuchung von neuronalen und glialen Komponenten des enterischen Nervensystems. Eine Neuron/Glia-Mischkultur auf Deckgläsern wird aus dem myenterischen Plexus einer adulten Maus hergestellt und bietet die Möglichkeit, die Funktion einzelner Neuronen und Gliazellen elektrophysiologisch, immunhistochemisch usw. zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Dieser Artikel beschreibt eine Videobildgebungstechnik und hochauflösende raumzeitliche Kartierung, um Veränderungen in der neuronalen Regulation der Dickdarmmotilität bei erwachsenen Mäusen zu identifizieren. Subtile Auswirkungen auf die gastrointestinale Funktion (GI) können mit diesem Ansatz in isolierten Gewebepräparaten nachgewiesen werden, um unser Verständnis von GI-Erkrankungen zu verbessern.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Anormale sensorische Funktion zugrunde liegt, viszerale Schmerzen und andere Symptome von funktionellen und entzündlichen Darmerkrankungen. Ein Protokoll für die elektrophysiologische Aufzeichnung der Kolon afferenten Nerven in eine ex Vivo Ratte Colorectum Vorbereitung wird hier vorgestellt.

In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet...

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

Wir zeigen Varianten der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechnik, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen in den ersten drei Stufen der wirbellosen olfaktorischen charakterisieren. Diese Techniken können leicht an ensemble Aktivität in anderen neuronalen Systemen sowie zu untersuchen.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Lernen Sie die In-vitro-Aufnahme mesenterialer afferenter Nervenaktivität in Mäusen. Diese Methode erfasst Reaktionen auf Dehnung und chemische Stimuli im Jejunum und Kolon. Sie hilft Forschern, Nervenfunktionen bei gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

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