Name: Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Lernen Sie die gerichtete Migration von neuralen Vorläuferzellen in elektrischen Feldern in 2D- und 3D-Umgebungen kennen. Diese Methode ermöglicht die Live-Beobachtung von Zellbewegungen in Richtung Kathode.

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Diese Arbeit wurde von der Royal Society URF Zuschuss UF051616, Großbritannien und den European Research Council StG Zuschuss 243261 BS unterstützt. Die Arbeit im Labor MZ wird auch durch eine California Institute of Regenerative Medicine Zuschuss RB1-01417 unterstützt.

1. Neurale Vorläuferzellen Zellisolation <ol><li> Sezieren ganze Gehirne von E14-16-Mäusen und in kaltem DMEM/F12 Basismedium. Entfernen Sie alle Meningen unter einem Mikroskop anatomischen und Transfer Gehirne in eine 35 mm Petrischale. </li><li> Verwenden feinen Pinzette mechanisch zu distanzieren Gehirne in Gewebefragmente und übertragen Sie sie auf einem 15 ml-Tube, dann zentrifugieren Proben bei 800 rpm für 3 Minuten, um Verschmutzungen zu entfernen. </li><li> Add DMEM/F12 mit bFGF und EGF und verreiben mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein Sieb, um Zelle eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. </li><li> Platte Zellen in Kolben bei 2-5 x 10 4 Zellen / ml, führen Sie eine vollständige Medium alle 3 Tage und den Durchgang Zellen alle 6 Tage. </li><li> Nach mindestens 5 Passagen, Digest Neurosphären, um einzelne Zellen unter Verwendung von Trypsin und EDTA und wachsen auf poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic Kammern (hergestellt wie unter Punkt 2 beschrieben). Mit dem wachsenden Medium mit N2-Supplement,bFGF und EGF zu jeder Zeit zu pflegen Eigenschaften der NPCs. </li></ol> 2. Herstellung der Kammer electrotactic <ol><li> Planen 22 x 11 mm Glasstreifen durch Teilen autoklaviert 22 x 22 mm Dicke Nr.1 ​​Deckgläser in der Mitte mit einem Diamant-Stift. </li><li> Erstellen Sie eine frei stehende Glas auch von Innenmaßen 22 x 10 mm miteinander verklebt, vier vertikal stehend 22 x 11 mm Streifen mit Hochvakuum-Silikonfett. Lassen Sie die Wells vollständig trocknen und aushärten über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag legen zwei 22 x 11 mm Glas-Streifen, die parallel zueinander, wobei ein Spalt von 10 mm, auf der Basis eines 100 mm Kulturschale mit Silikonfett. Abdichten den Bereich zwischen diesen Streifen, indem eine 22 x 22 mm Deckglas an jedem Ende, an der Unterseite der Schale mit Fett auf drei Seiten, aber nicht dem Zentrum am nächsten. </li><li> Das Glas gut in Schritt 2.2 auf den Deckel rutscht vorbereitet, so dass die Innenwände einen geschlossenen Raum zu schaffen für die Aussaatdie Zellen auf der Unterseite der Platte. Wasserdichte alle Fugen mit Silikon einfetten. Coat diese Region beschränkt nacheinander mit Poly-D-Lysin dann Laminin: 1 ml Poly-D-Lysin in die Kammer zu verlassen und für 5 Minuten, damit das Poly-D-Lysin an der Unterseite der Platte zu binden; waschen Sie die Kammer mit sterilem PBS zweimal, dann verdünnt Laminin in sterilem PBS auf 20 ug / ml zu erhalten und zu verwenden, um die Unterseite der Platte bestimmt. Lassen Sie bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag, Ernte-Zellen und bereiten 1 ml Suspension mit 1 x 104 Zellen. Entfernen Sie Laminin aus dem Glas gut, so dass es an der Luft trocknen vollständig und ersetzen mit 1 ml Zellsuspension. Die Schale im Inkubator bei 37 ° C für mindestens 4 Stunden zur Befestigung zu ermöglichen. </li><li> Sobald die Zellen konfluent sind ausreichend entfernen Medium aus der Kammer. Entfernen Sie vorsichtig das Glas gut. Bilden ein Dach über den Zellen durch vorsichtiges Befestigung, mit Silikonfett, einer autoklavierten 22 x 22 mm DeckglasBrückenschlag zwischen den beiden 22 x 11 mm Streifen. Die Zellen mit ein paar Tropfen des Mediums zu vermeiden Austrocknen. </li><li> Bilden eine isolierte Mediumspeicher an jedem Ende der Kammer durch die Schaffung von zwei wasserdichte Silikonfett Barrieren, die von einem Rand der Schale zur anderen laufen, über die Kammer Dach. Füllen der Kammer mit frischem Medium, wodurch eine Durchströmung von einem Medium Reservoir zu dem anderen. Senden Sie das Gericht in den Inkubator für 12 Stunden auf die Erholung der Zellen zu ermöglichen. </li></ol> 3. Anwendung eines elektrischen Feldes an die Kammer electrotactic <ol><li> Bereiten Sie einen Deckel auf die Schüssel durch das Bohren Sie zwei Löcher, eins über jedem Behälter der Migration Kammer positioniert zu decken. </li><li> Ersetzen Sie alle Medium in der Kammer mit Kulturmedium mit 25 mM HEPES-Puffer und die Schale in der temperaturgeführten Imaging-System. Richten Sie die experimentellen Parameter für Zeitraffer-und Multi-Positions-Aufnahme. Richten der Kammer, so dass die Kathode und Anodeauf der linken und rechten festgelegt, um sicherzustellen, dass die EF-Vektor horizontal verläuft, wie sie das Mikroskop betrachtet und in das Abbildungssystem. </li><li> Füllen Sie zwei Bechergläser mit Steinberg-Lösung (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2 · 4H 2 0, 1,3 mM MgSO 4 · 7H 2 0 und 4,6 mm Trizma Base, pH 7,4). Eine separate Becher auf jedes Medium Behälter unter Verwendung vorgefertigter Glasbrücken (Glasröhren ~ 13 cm lang und ca. 3 mm im Durchmesser, und Biegen zu einer U-Form durch Erhitzen in einem Bunsenbrenner), mit 2% (w / gefüllt v) Steinberg's-Agar-Lösung, die durch die Löcher im Deckel. Füllen Sie den Stromkreis, indem Ag / AgCl-Elektroden verbunden mit einer DC-Stromversorgung in jedem Becher der Steinberg-Lösung. </li><li> Stellen Sie die Spannung Regler an der Stromversorgung auf 0 und schalten Sie ein. Messen der Spannung über dem electrotactic Kammer beim Einschalten die Spannung Zifferblatt, mit einem Voltmeter, und Anpassung an die experimentellen Anforderungen. </li><li> Start Zeitraffer-Aufnahme. Führen Sie ein Mediumwechsel und justieren Sie die Spannung, je nach Bedarf, jede Stunde. Frisches Medium, Drogen oder chemische Mittel können zu den Stauseen hinzugefügt werden, wie erforderlich. Wenn durchführen Medium ändern, können zwei Optionen, wie unten in Betracht gezogen werden: <ol><li> Option Nr.1 ​​- Zum Anhalten der Zeitraffer-Aufnahme vorübergehend, entfernen Sie vorsichtig Glas Brücken von Kammer zu vermeiden störende Deckelklappe, verwenden Sie einen sterilisierten Pasteurpipette vorsichtig ersetzen alle Medium durch frisches Medium und stellte das Glas wieder Brücken, dann die Aufnahme fortzusetzen. </li><li> Option Nr.2 - Alternativ, custom made Deckel Deckel mit 4 Löchern (zwei über jedem Reservoir der Migration Kammer positioniert) kann auch für mittlere Veränderung Zweck verwendet werden. Zwei für Glasbrücken Verbindung, die beiden anderen für Medienwechsel. Option 2 ermöglicht eine kontinuierliche Aufzeichnung ohne Störungen während Mediumwechsel. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung des organotypischen Rückenmarks Slice <ol><li> Sezieren Lumbar Rückenmark von 2 Wochen alten C57 BL / 6 Mäuse. </li><li> In Scheiben schneiden Rückenmark in 500 pm dicke Schnitte mit einem McIlwain Gewebe Chopper. </li><li> Separate Scheiben unter einem Mikroskop anatomischen und wählen Scheiben mit intakten sagittal / axial Rückenmark Struktur. </li><li> Teller Scheiben in einer 35 mm Petrischale mit 30 ul Matrigel und legen Sie sie in der Mitte erscheint wie möglich zu schließen und pflegen sie in einem 5% CO 2-Inkubator bei 37 ° C für mindestens 30 min, bis das Matrigel Proteine ​​selbst zusammen zu produzieren ein dünner Film, der die Oberfläche des Rückenmarks Schicht umfasst. Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass Matrigel wurde komplett zusammengebaut, inkubieren Sie die Petrischale bei 37 ° C für weitere 30 min, wenn nötig. </li><li> Fügen Sie 4-6 ml DMEM/F-12-Medium mit 25 mM HEPES-Puffer und 15 bis 20% fötalem Kälberserum sehr schonend, so dass mittel fließen direkt auf die Scheibe zu vermeiden. Sicherstellen, dass die Scheibe nicht vollständig in Medium eingetaucht, so dass die Oberfläche der Explantate gut ausgesetztdie Luft. Ändern Medium zweimal wöchentlich. </li></ol> 5. Die Injektion von Hoechst 33342 beschriftet NPCs in den organotypischen Rückenmark Scheibe <ol><li> Bereiten Sie den NPC Suspension bei 1 × 10 6 Zellen / ul. </li><li> Pre-Inkubation der Zellsuspension in Medium mit 5 uM Hoechst 33342 für 30 min. </li><li> Verwenden Sie kapillaren Glasröhre bis 2 ul Suspension in das Rückenmark Scheibe langsam microinject unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, Kapillar-Glasrohr geht durch den Matrigel (rosa Teil unter dem Mikroskop) und erreichen an der Innenseite der Scheibe des Rückenmarks (graue Gewebe unter dem Mikroskop), im Inneren des Rückenmarks Slice für mindestens 30 Sekunden bleiben, um Zellsuspension überfahren zu vermeiden. Legen Sie die Petrischale mit Rückenmark Scheibe in Inkubator (37 ° C 5% CO 2) und lassen Sie es über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, wenden eine EF von 500 mV / mm des Rückenmarks Schicht mit Hoechst 33342-markierten NPCs in der electrotactic Kammer (unter Verwendung der Verfahren beschrieben3). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wenn NPCs wurden auf einen Bereich von physiologischen EF zeigten sie stark gerichtete Wanderung in Richtung der Kathode (1) ausgesetzt ist. Die gleiche Beobachtung wurde auch bei einer einzelnen Zelle auf der organotypischen Rückenmarks Slice ex vivo-Modell, eine 3D-Umgebung in vivo Bedingungen nachahmen (Abbildung 2). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. NPCs zeigen gerichtete Wanderung in EFs. PCs zeigten hoch gerichtete Wanderung zur Kathode, wenn EFS ausgesetzt sind, repräsentieren roten Linien und blauen Pfeile Flugbahnen und die Richtung der Bewegung der Zellen (A). B zeigt die Migrationswege von NPCs. Bar: 50 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die transplantierten NPCs für gerichtete Wanderung in Richtung der Kathode in der organotypischen Rückenmarks Slice

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Protokolle verwenden wir auf der Basis früherer Studien 5,11. Mit Hilfe dieser Methoden stabilen Kultur und elektrischer Strom Bedingungen aufrecht erhalten, während ein EF-Agar über Brücken, Steinberg-Lösung und Ag / AgCl-Elektroden, um Zellen oder in Scheiben individuell gestaltet electrotactic Kammern von standardisierten und präzise Abmessungen kultiviert werden. Die Tiefe der Kammern kann eingestellt werden, um Platz für verschiedene Dicken Probe 11 zu, und im Falle von Zellen, Kammergröße...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> FGF-basic Rekombinantes humanes </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> Rekombinantes humanes EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0311 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> N2-Supplement (100X) Flüssigkeit </td><td> Invitrogen </td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12-Medium (high Glucose) </td><td> Invitrogen </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td></td></tr><tr><td> Natürliche Mauslaminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> Wachstumsfaktor reduziert Basalmembran-Matrix (Matrigel) </td><td> BD Biosciences </td&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Puffer </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> McIlwain Gewebe Chopper </td><td> Die Mickle Laboratory Engineering Co Ltd </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> Dow Corning Hochvakuum-Silikonfett </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

electric field-gesteuerte gerichtete wanderung von neuralen vorläuferzellen in 2d-und 3d-umgebungen

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogene elektrische Felder (EF) kommen natürlicherweise in vivo und spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewebe / Organ Entwicklung und Regeneration, einschließlich der des zentralen Nervensystems 1,2. Diese endogenen EF durch zellulären Regulation der Ionentransport mit dem elektrischen Widerstand von Zellen und Geweben kombiniert erzeugt. Es wurde berichtet, dass EF angewandte Behandlung kann der funktionellen Wiederherstellung von Verletzungen des Rückenmarks bei Tieren und Menschen 3,4 zu fördern. Insbesondere hat EF-gerichtete Wanderung in einer Vielzahl von Zelltypen 5,6, einschließlich neuralen Vorläuferzellen (NPC) 7,8 nachgewiesen. Anlegen eines Gleichstroms (DC) EF ist nicht eine allgemein verfügbare Technik in den meisten Laboratorien. Wir haben detaillierte Protokolle für die Anwendung von DC EFs beschrieben, um Zell-und Gewebekulturen zuvor 5,11. Hier präsentieren wir eine Video-Demonstration der Standard-Methoden auf einem berechneten Feldstärke einzurichten 2D-Basis eind 3D-Umgebungen für NPCs und zu zellulären Reaktionen auf EF Stimulation in beiden einzigen Zelle Wachstumsbedingungen in 2D, und der organotypischen Rückenmark Scheibe in 3D untersuchen. Die Wirbelsäule ist ein idealer cordslice Empfänger Gewebe zum Studium NPC ex vivo Verhalten, nach der Transplantation, weil die zytoarchitektonischen Gewebeorganisation wird auch in diesen Kulturen 9,10 erhalten. Darüber hinaus ist diese ex vivo-Modell ermöglicht auch Verfahren, die derzeit technisch nicht möglich, Zellen in vivo mittels Zeitraffer-Aufnahme auf der Ebene einzelner Zellen zu verfolgen. Es ist von entscheidender Zelle muss auf das Verhalten nicht nur in einer 2D-Umgebung zu bewerten, sondern auch in einer 3D-organotypischen Bedingung, die die in vivo-Umgebung imitiert. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung mit Deckglas-basierte Gerichte im Gewebe oder Organ Kultur mit 3D-Tracking einzelner Zellmigration in vitro und ex vivo und kann ein Zwischenschritt, bevor sie auf in sein vivo Paradigmen.

Dieses Protokoll zeigt Methoden verwendet werden, um 2D-und 3D-Umgebungen in speziell angefertigten electrotactic Kammern einzurichten, die Zellen verfolgen können<em&gt; In vivo / ex vivo</em&gt; Verwendung von Zeitraffer-Aufnahme an der Ebene einzelner Zellen, um Galvanotaxis / electrotaxis und andere zelluläre Reaktionen untersuchen zu Gleichstrom (DC) elektrische Felder (EF) zu lenken.

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Endogene elektrische Felder (EFs) treten natürlich in vivo auf und spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewebe- und Organentwicklung sowie der Regeneration, einschließlich der des ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung angelegter elektrischer Felder auf die Migration von neuronalen Vorläuferzellen in 2D-Kulturen und 3D-ex vivo-Modellen aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zuerst neuronale Vorläuferzellen in vitro isoliert und expandiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine Einzelzell-Suspension aus neuronalen Vorläuferzellen herzustellen.Anschließend werden für die Vorbereitung der 2D-Kultur neurale Vorläuferzellen in speziell konzipierten elektrischen Taxis-Kammern ausgesät. Alternativ werden für die Vorbereitung des 3D-ex-vivo-Modells neurale Vorläuferzellen mit Haken 3, 3, 3, 4, 2 markiert und in ein organspezifisches Schnittmodell des Rückenmarks injiziert. Schließlich wird ein elektrisches Feld auf die Elektrokammern angewendet, und eine Zeitrafferaufnahme wird durchgeführt, um zu zeigen, dass sich die Vorläuferzellen in sowohl 2D- als auch 3D-Umgebungen in Richtung der Kathode des elektrischen Feldes bewegen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine neuartige Methode zur Live-Verfolgung der elektrischen Feld-induzierten Migration einzelner Zellen nach deren Transplantation in ein 3D-organotypisches Modell bietet, das der natürlichen Umgebung stark ähnelt. Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die Elektrotechnik und die Migration von neuralen Zellen gewähren, die in Schnittpräparate des Rückenmarks transplantiert wurden, sondern lässt sich auch auf andere Systeme anwenden, wie beispielsweise kleine Gehirnschnittmodelle. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie 22 mal 11 Millimeter große Glasstreifen vor, indem Sie das Autoklav 22 mal 22 Millimeter teilen.Teilen Sie Deckgläser der Nummer eins mit einem Diamantschreiber zur Hälfte. Erstellen Sie anschließend eine freistehende Glaswanne mit inneren Abmessungen von 22 mal 10 Millimetern, indem Sie vier senkrecht stehende Streifen der Größe 22 mal 11 Millimeter mit hochvakuumtauglichem Silikonfett miteinander verkleben. Lassen Sie die Wanne über Nacht vollständig trocknen und aushärten. Am nächsten Tag befestigen Sie zwei Glasstreifen der Größe 22 mal 11 Millimeter parallel zueinander mit einem Abstand von 10 Millimetern auf dem Boden einer 100-Millimeter-Kulturschale unter Verwendung von Silikonfett.Dann versiegeln Sie den Bereich zwischen diesen Streifen, indem Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckgläser mit Silikonfett befestigen. Stellen Sie das Glasgefäß auf die Deckgläser, sodass die Innenwände einen begrenzten Raum für die Zellansaat bilden. Dichten Sie alle Verbindungsstellen wasserdicht mit Silikonfett ab.Überziehen Sie diesen begrenzten Bereich nacheinander mit Poly-D-Lysin und anschließend mit Laminin, wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben. Gewinnen Sie in diesem Verfahren die Gehirne von Mäusen im Zeitraum E14 bis E16 und legen Sie sie in kaltes D-MEM-F12-Grundmedium. Entfernen Sie danach die Hirnhäute unter einem anatomischen Mikroskop.Anschließend überführen Sie die Gehirne in eine 35-Millimeter-Petri-Schale. Zerlegen Sie die Gehirne mit feinen Pinzetten in Gewebefragmente. Danach überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Proben bei 800 U/min für drei Minuten, um A-Trümmer zu entfernen. Danach A-D-M-E-M-F 12 mit BFDF und DGF zu den Proben geben. Vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette ansetzen und mischen.Dann gewinnen Sie die Einzelzell-Suspension mithilfe eines Zellfilters. Impfen Sie die Zellen in die Kolben mit 20.000 bis 50.000 Zellen pro Milliliter aus. Führen Sie anschließend alle drei Tage einen kompletten Mediumwechsel durch, bei dem die Zellen fünf Minuten lang bei 1.300 U/min zentrifugiert werden.Entfernen Sie das Überstand-Medium, suspendieren Sie den PT in frischem Medium und geben Sie die Zellen alle sechs Tage nach mindestens fünf Tagen erneut in den Kolben zurück. Überführen Sie die NEUROSPHÄREN in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.500 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.Suspendieren Sie das Pellet erneut in EDTA, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Bereiten Sie vor der Zellzählung ein Milliliter Suspension mit 10.000 Zellen vor. Entfernen Sie anschließend Laminin aus der Glasvertiefung und lassen Sie diese vollständig trocknen.Ersetzen Sie es durch ein Milliliter Zellsuspension. Danach stellen Sie die Schale für mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, um die Anheftung zu ermöglichen. Sobald die Zellen ausreichend konfluent sind, entfernen Sie das Medium aus der Kammer.Entfernen Sie vorsichtig das Glas. Bilden Sie dann einen Überzug über die Zellen, indem Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckglaskörper mit Hilfe von Silikonfett vorsichtig zwischen zwei 22 mal 11 Millimeter große Streifen befestigen. Denken Sie daran, die Zellen mit einigen Tropfen Medium zu bedecken, um Austrocknung zu vermeiden.Bilden Sie dann an jedem Ende der Kammer ein isoliertes Mediumreservoir, indem Sie zwei wasserdichte Barrieren aus Silikonfett anlegen, die von einem Ende der Schale zum anderen reichen. Füllen Sie die Kammer mit frischem Medium und sorgen Sie dafür, dass ein Durchfluss von einem Mediumreservoir zum anderen entsteht. Anschließend stellen Sie die Schale für 12 Stunden in den Inkubator, um die Zellen regenerieren zu lassen.Bereiten Sie im nächsten Schritt einen Deckel zur Abdeckung der Schale vor, indem Sie zwei Löcher bohren, wobei sich jedes Loch über einem Reservoir der Migrationskammer befindet. Danach ersetzen Sie das Medium in der Kammer durch kultiviertes Medium, das 25 Millimeter Hippies-Puffer enthält. Anschließend überführen Sie die Schale in das temperaturgesteuerte Abbildungssystem.Stellen Sie die experimentellen Parameter für die Zeitrafferaufnahme und die Mehrpositionsaufnahme ein. Richten Sie die Kammer so aus, dass die Kathode links und die Anode rechts liegt, um sicherzustellen, dass der elektrische Feldvektor horizontal verläuft, wie unter dem Mikroskop sichtbar und im Abbildungssystem aufgezeichnet. Füllen Sie anschließend zwei Bechergläser.Mit Steinbergs Lösung. Verbinden Sie einen separaten Becher mit jedem Mediumreservoir unter Verwendung der vorbereiteten Glasbrücken, die mit einer 2 %igen Steinbergs Agar-Lösung gefüllt sind. Dann bringen Sie die mit einer Gleichstromquelle verbundenen Silberelektroden in die Steinberg-Lösung ein.Stellen Sie an jedem Becher das Spannungsregler am Netzteil auf null ein und schalten Sie es ein. Messen Sie die Spannung über der Elektrotaxis-Kammer mit einem Spannungsmessgerät, während Sie den Spannungsregler hochdrehen. Anschließend stellen Sie die Spannung gemäß den experimentellen Anforderungen ein.Danach die Zeitrafferaufnahme starten. Bei Bedarf Medium wechseln und die Spannung erneut einstellen. Stündlich können frische Medien, Wirkstoffe oder chemische Substanzen je nach Bedarf den Reservoirs hinzugefügt werden.Unter Verwendung zusätzlicher Löcher, die in den Deckel der Kulturschale gebohrt wurden, wobei sich jeweils eines über jedem Mediumreservoir befindet. In diesem Schritt dissezieren Sie die lumbalen Rückenmarkstücke von zweiwöchigen Mäusen. Anschließend schneiden Sie die Rückenmarkstücke unter einem anatomischen Mikroskop mit einem Machel-Wane-Gewebeschneider in 500 Mikrometer dicke Schnitte.Trennen Sie die Schnitte und wählen Sie diejenigen mit intakter sagittaler axialer Rückenmarksstruktur aus. Anschließend geben Sie die Schnitte in eine 100 Millimeter große Petrischale, die 30 Mikroliter MA-Gel enthält. Platzieren Sie sie so nah wie möglich am Zentrum.Sie in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius mindestens 30 Minuten lang inkubieren. Damit die Matri-Gel-Proteine sich selbst zu einer dünnen Schicht zusammenlagern können, die die Oberfläche der Schnittpräparate des Rückenmarks bedeckt, ist es sehr wichtig, dass die Matri-Gel-Vernetzung vollständig abgeschlossen ist. Gegebenenfalls die Petrischale weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, dann vier bis sechs Milliliter D-MEM/F12-Medium, das 25 Millimolar HEPES-Puffer und 15 bis 20 % Fötales Kälberserum enthält, hinzufügen.Sehr vorsichtig, um zu vermeiden, dass das Medium direkt auf die Schnitte fließt, sicherstellen, dass die Schnitte nicht vollständig im Medium eingetaucht sind, sodass die Oberfläche der Auberginen gut der Luft ausgesetzt bleibt. Das Medium zweimal wöchentlich wechseln. Nun die Suspension der neuronalen Vorläuferzellen in dem Medium mit fünf Mikromolar Hooks inkubieren.3, 3, 3, 4, 2 für 30 Minuten. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Kapillarglaskolben, um zwei Mikroliter der Suspension in den Rückenmarkschnitt einzuspritzen. Achten Sie darauf, dass die Kapillarglaskolbe langsam durch das Matrigel hindurchgeht und in das Innere des Rückenmarkschnitts vordringt.Halten Sie das Glasröhrchen mindestens 30 Sekunden lang in der Rückenmarkscheibe, um eine Zellsuspension zu vermeiden. Überfahren Sie es anschließend und stellen Sie die Petrischale mit der Rückenmarkscheibe über Nacht in den Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid. Am nächsten Tag bauen Sie eine elektrotaktische Kammer um die Rückenmarkscheibe herum auf, die Haken mit 3 3 3 4 2 markierten Neurogenese-Zellen enthält, bevor Sie ein elektrisches Feld mit einer Stärke von 500 Millivolt pro Millimeter anlegen.Hier zeigen die neuronalen Vorläuferzellen eine stark gerichtete Migration in Richtung der Kathode, wenn sie elektrischen Feldern ausgesetzt werden; rote Linien und blaue Pfeile stellen jeweils die Trajektorien und die Richtung der Zellbewegung dar. Und hier ist die Darstellung der gezeigten Migrationspfade. Hier sind die neuronalen Vorläuferzellen markiert mit Hooks 3 3, 3, 4 2.Sie wurden zum Beginn der elektrischen Feldbehandlung in die organspezifischen Schnitte des Rückenmarks transplantiert. Nachdem sich die neuronalen Vorläuferzellen 2,5 Stunden lang gezielt in Richtung der Kathode bewegt hatten, wurde die Polarität des elektrischen Feldes umgekehrt. Die geänderte Polarität des elektrischen Feldes löste eine deutliche Umkehrung der Axonrichtung in Richtung der neuen Kathode aus.Hier ist ein Bild der transplantierten neuronalen Vorläuferzellen im Schnitt des Rückenmarks. Am Ende der Zeitrafferaufnahme wird eine 3D-Rekonstruktion der transplantierten neuronalen Vorläuferzellen im Schnitt des Rückenmarks gezeigt. Masse gemeistert.Diese Technik kann innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, sofern sie nach ihrer Entwicklung ordnungsgemäß angewendet wird. Die Technik ebnet nun Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um die Migration neuraler Vorläuferzellen in 2D- und 3D-Kultursystemen in Reaktion auf und unter Anwendung elektrischer Felder zu untersuchen.

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Research

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JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines extrazellulären Matrix-beschichteten Mikrofluidik-Chips zur Unterscheidung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen oder NPCs durch elektrische Stimulation. Nach der Aussaat und dem Anhaften an der beschichteten Region wachsen NPCs, und die Anwendung eines Gleichstroms löst ihre Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten aus.

Elektrostimulationsinduzierte Differenzierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neuroblast Migration ist ein entscheidender Schritt in der postnatalen Neurogenese. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Regulatoren der Neuroblast Kandidat Migration durch den Einsatz von DNA / kleine Haarnadel-RNA (shRNA) Nukleofektion und eine 3D-Migrationsassay mit Neuroblasten aus dem Nagetier postnatale rostralen Migrationsstrom getrennt zu untersuchen.

Nucleofection von Nagerneuroblasten zu Neuroblast Migrationsstudie<em&gt; In-vitro-</em

Wir stellen eine Methode vor, um ein physiologisches elektrisches Feld an wandernde, immortalisierte Prostatazellen in einer speziell angefertigten Galvanotaxiskammer anzulegen. Mit dieser Methode zeigen wir, dass 2 Linien von nicht-tumorigenen Prostatazellen im Feld unterschiedliche Grade der Migrationsrichtung aufweisen.

Verwendung Maßgeschneiderte Galvanotaxis Chambers zu Directional Migration Studie von Prostatazellen

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese "lebende Gerüste", präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.

Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie die gerichtete Migration von neuralen Vorläuferzellen in elektrischen Feldern in 2D- und 3D-Umgebungen kennen. Diese Methode ermöglicht die Live-Beobachtung von Zellbewegungen in Richtung Kathode.

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

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