Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung der angelegten elektrischen Felder auf die Migration von neuronalen Vorläuferzellen in 2D-Kultur- und 3D-ex vivo-Modellen zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst neuronale Vorläuferzellen in vitro isoliert und expandiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine Einzelzellsuspension von neuralen Vorläuferzellen herzustellen.

Als nächstes werden für die Vorbereitung der 2D-Kultur die neuralen Vorläuferzellen in speziell entwickelten elektrotaktischen Kammern plattiert. Alternativ werden für die 3D-Ex-vivo-Modellvorbereitung neuronale Vorläuferzellen mit den Haken 3, 3, 3, 4, 2 markiert und in ein organotypisches Modell des Rückenmarksschnitts injiziert. Letztendlich wird ein elektrisches Feld an die Elektrokammern angelegt und eine Zeitrafferaufnahme durchgeführt, um zu zeigen, dass Vorläuferzellen sowohl in 2D- als auch in 3D-Umgebungen zur Kathode des elektrischen Feldes wandern.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine neuartige Methode zur Live-Verfolgung der durch elektrische Felder induzierten Migration einzelner Zellen nach der Transplantation in ein organotypisches 3D-Modell bietet, das der natürlichen Umgebung sehr ähnlich ist. Diese Methode kann nicht nur die Einfügung in die Elektrotechnik, die Migration von Neurozellen, die in den Rückenmarksschnitt transplantiert werden, ermöglichen, sondern kann auch auf die anderen Systeme angewendet werden, die als Gehirnschnittmodelle klein sind. Um diesen Vorgang zu beginnen, bereiten Sie 22 x 11 Millimeter große Glasstreifen vor, indem Sie den Autoklaven 22 x 22 Millimeter teilen.

Der Einband mit der Dicke Nummer eins lässt sich mit einem Diamantstift in zwei Hälften gleiten. Erstellen Sie als Nächstes einen freistehenden Glasschacht mit Innenabmessungen von 22 x 10 Millimetern, indem Sie vier vertikal stehende, 22 x 11 Millimeter große Streifen zusammen mit Hochvakuum-Silikonfett kleben, lassen Sie die Vertiefung über Nacht vollständig trocknen und aushärten. Befestigen Sie am nächsten Tag 2 22 x 11 Millimeter große Glasstreifen parallel zueinander und lassen Sie mit Silikonfett einen Abstand von 10 Millimetern zum Boden einer 100-Millimeter-Kulturschale.

Versiegeln Sie dann den Bereich zwischen diesen Streifen, indem Sie einen 22 x 22 Millimeter großen Deckslip mit Silikonfett anbringen. Platzieren Sie die Glasmulde auf den Deckgläsern, so dass die Innenwände einen engen Raum für die Aussaat der Zellen schaffen. Imprägnieren Sie alle Fugen mit Silikonfett.

Diese eingegrenzte Region wird nacheinander mit Poly de Lycine bestigt, gefolgt von Laminin, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Bei diesem Verfahren werden die Gehirne von Mäusen E 14 bis E 16 entnommen und in kaltes Basalmedium D-M-E-M-F 12 gelegt. Als nächstes entfernen Sie die Hirnhäute unter einem anatomischen Mikroskop.

Übertragen Sie danach die Gehirne in eine 35-Millimeter-Petrischale. Verwenden Sie die feine Pinzette, um das Gehirn in Gewebefragmente zu dissoziieren. Dann werden sie in eine 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge umgefüllt.

Die Proben werden drei Minuten lang bei 800 U/min gemessen, um D-Schmutz zu entfernen. Als nächstes wird A-D-M-E-M-F 12 mit BFDF und DGF zu den Proben gegeben. Tritrat aß sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette.

Anschließend erhalten Sie die einzellige Suspension mit einem Zellsieb. Die Zellen werden mit 20.000 bis 50.000 Zellen pro Milliliter in die Kolben gefüllt. Führen Sie dann alle drei Tage einen vollständigen Mediumwechsel durch, bei dem die Zellen fünf Minuten lang bei 1.300 U/min zentrifugiert werden.

Verwerfen Sie das Supinat-Resus, suspendieren Sie das PT in frischem Medium und geben Sie die Zellen alle sechs Tage nach mindestens fünf Tagen in den Kolben zurück. Übertragen Sie die NEUROSPHERES fünf Minuten lang auf eine 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 1.500 U/min. Verwerfe das Supinat.

Das Pellet wird bei Auslösungen in EDTA erneut suspendiert, um eine einzellige Suspension herzustellen. Bevor Sie eine Zellzählung durchführen, bereiten Sie einen Milliliter Suspension mit 10.000 Zellen vor. Entfernen Sie anschließend das Laminin aus der Glasmulde und lassen Sie es vollständig trocknen.

Ersetzen Sie es durch einen Milliliter Zellsuspension. Stellen Sie die Schale danach für mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, um Aufsätze zu ermöglichen. Sobald die Zellen ausreichend kofluent sind, nehmen Sie das Medium aus der Kammer.

Entferne das Glas vorsichtig. Na dann bilden Sie ein Dach über den Zellen, indem Sie vorsichtig einen Autoklaven 22 mal 22 Millimeter Glasdeckglas zwischen 2, 22 mal 11 Millimeter großen Streifen mit Silikonfett befestigen. Denken Sie daran, die Zellen mit ein paar Tropfen Medium zu bedecken, um ein Austrocknen zu vermeiden.

Bilden Sie dann an jedem Ende der Kammer ein isoliertes Mediumreservoir, indem Sie zwei wasserdichte Silikonfettbarrieren schaffen, die von einem Ende der Schale zum anderen verlaufen. Füllen Sie die Kammer mit frischem Medium und sorgen Sie für einen Durchfluss von einem Mediumbehälter zum anderen. Stellen Sie die Schale anschließend für 12 Stunden wieder in den Inkubator, damit sich die Zellen erholen können.

Bereiten Sie im nächsten Schritt einen Deckel vor, um die Schale abzudecken, indem Sie zwei Löcher bohren, von denen eines über jedem Reservoir der Migrationskammer positioniert ist. Ersetzen Sie dann das Medium in der Kammer durch ein Kulturmedium mit 25 Millimeter Hippies-Puffer. Übertragen Sie danach die Schale in das temperaturgesteuerte Bildgebungssystem.

Stellen Sie die experimentellen Parameter für Zeitraffer- und Mehrpositionsaufnahmen ein. Richten Sie die Kammer so aus, dass sich Kathode und Anode links bzw. rechts befinden, um sicherzustellen, dass der elektrische Feldvektor horizontal verläuft, wie er unter dem Mikroskop betrachtet und im Bildgebungssystem aufgezeichnet wird. Als nächstes füllst du zwei Becher.

Mit der Lösung von Steinberg. Schließen Sie ein separates Becherglas an jedes Mediumreservoir an, indem Sie die vorbereiteten Glasbrücken verwenden, die mit 2%Steinberg-Agarlösung gefüllt sind. Platzieren Sie dann die Silberelektroden, die an eine Gleichstromversorgung angeschlossen sind, in die Steinberg-Lösung.

Stellen Sie in jedem Becherglas den Spannungsregler am Netzteil auf Null und schalten Sie es ein. Messen Sie die Spannung in der elektrotaktischen Kammer mit einem Spannungsmesser, während Sie den Spannungsregler aufdrehen. Passen Sie dann die Spannung an die experimentellen Anforderungen an.

Starten Sie danach die Zeitrafferaufnahme. Führen Sie einen Medienwechsel durch und stellen Sie die Spannung nach Bedarf nach. Stündlich können je nach Bedarf frische, mittlere Medikamente oder chemische Mittel in die Behälter gegeben werden.

Mit zusätzlichen Löchern, die in den Deckel der Kulturschale gebohrt werden, eines über jedem Mediumbehälter. In diesem Schritt präparieren Sie das lumbale Rückenmark von zwei Wochen alten Mäusen. Schneiden Sie dann das Rückenmark mit einem Machel-Zerkleinerer unter einem anatomischen Mikroskop in 500 Mikrometer dicke Abschnitte.

Trennen Sie die Scheiben und wählen Sie diejenigen mit intakter sagittaler axialer Rückenmarksstruktur aus. Als nächstes die Scheiben in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 30 Mikrolitern MA-Gel geben. Platzieren Sie sie so nah wie möglich an der Mitte.

Halten Sie sie mindestens 30 Minuten lang in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Damit sich die Matri-Gel-Proteine selbst zusammensetzen können, um einen dünnen Film zu erzeugen, der die Oberfläche der Rückenmarksschnitte bedeckt, ist es sehr wichtig, dass das Matri-Gel vollständig zusammengesetzt wurde. Inkubieren Sie die Petrischale bei Bedarf weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann vier bis sechs Milliliter D-M-E-M-F 12 Medium mit 25 millimolaren Heis-Puffer und 15 bis 20 % fötales Kälberserum hinzu.

Um zu vermeiden, dass das Medium direkt auf die Scheiben gelangt, achten Sie darauf, dass die Scheiben nicht vollständig in Medium getaucht werden und die Oberfläche der Auberginen gut der Luft ausgesetzt ist. Wechseln Sie das Medium zweimal wöchentlich. Inkubieren Sie nun die Suspension der neuralen Vorläuferzellen im Medium mit fünf mikromolaren Haken.

3, 3, 3, 4, 2 für 30 Minuten. Verwenden Sie unter einem Mikroskop ein Kapillarglasröhrchen, um zwei Mikroliter Suspension in die Rückenmarksscheibe zu injizieren. Stellen Sie langsam sicher, dass das Kapillarglasrohr durch das Matrigel hindurchläuft und die Innenseiten der Rückenmarksscheibe erreicht.

Halten Sie das Glasröhrchen mindestens 30 Sekunden lang in der Rückenmarksscheibe, um eine Zellsuspension zu vermeiden. Überfahren und dann die Petrischale mit dem Rückenmarksschnitt über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 Cent Kohlendioxid in den Inkubator stellen. Konstruieren Sie am nächsten Tag eine elektrotaktische Kammer um den Rückenmarksschnitt mit Haken 3 3 3 4 2 markierten Neurogenesezellen, bevor Sie ein elektrisches Feld von 500 Millivolt pro Millimeter anlegen.

Hier zeigen die neuralen Vorläuferzellen eine stark gerichtete Migration in Richtung Kathode, wenn sie den elektrischen Feldern ausgesetzt sind, rote Linien und blaue Pfeile stellen die Flugbahnen bzw. die Richtung der Zellbewegung dar. Und hier ist das Diagramm der gezeigten Migrationspfade. Hier sind die neuralen Vorläuferzellen, die mit den Haken 3, 3, 3, 4, 2 markiert sind.

Sie wurden in den organotypischen Rückenmarksschnitt am Ausgangspunkt der elektrischen Feldbehandlung transplantiert. Nachdem die neuralen Vorläuferzellen 2,5 Stunden lang in Richtung Kathode gewandert waren, wurde die Polarität des elektrischen Feldes umgekehrt. Die sich ändernde Polarität des elektrischen Feldes löste eine scharfe Umkehrung von Axxis zur neuen Kathode aus.

Hier ist ein Bild der transplantierten neuralen Vorläuferzellen innerhalb des Rückenmarksschnitts. Zum Abschluss der Zeitrafferaufnahme ist hier eine 3D-Rekonstruktion der transplantierten neuralen Vorläuferzellen innerhalb des Rückenmarksschnitts zu sehen. Messe gemeistert.

Diese Technik kann in zwei Wochen durchgeführt werden, wenn sie nach ihrer Entwicklung richtig durchgeführt wird. Diese Technik ebnet nun Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Migration neuronaler progener Zellen in 2D- und 3D-Kultursystemen als Reaktion darauf zu erforschen und auf elektrische Felder anzuwenden.