Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gleichzeitig das kardiale Myosin-bindende Protein C und das kardiale Troponin I in Serumproben zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine 96-Well-Platte mit einem kardialen Myosin-bindenden Protein-C-Antikörper für einen Plex-Assay beschichtet wird, oder indem ein vorkodierter Threeplex-Assay verwendet wird. Im zweiten Schritt werden die beschichteten Platten mit Kalibratoren und Serumproben inkubiert.

Als nächstes werden markierte Detektionsantikörper zugegeben, im letzten Schritt wird ein Chemilumineszenzsignal erzeugt, das vom Plattenleser detektiert wird. Letztendlich können die in Serumproben vorhandenen Spiegel der interessierenden kardialen Proteine durch Einzel- oder Multiplex-Immunoassays bestimmt werden. Pipettieren Sie am Tag vor dem Experiment 30 Mikroliter gelatinefreies monoklonales Maus-Anti-Herz-Myosin-bindendes Protein C-Antikörper in die untere Ecke jeder Vertiefung einer 96-Well-Miso-Skala-Entdeckungs-nackten Standardplatte.

Klopfen Sie dann auf die Seiten der Platte, um die Antikörperlösung auf dem Boden jeder Vertiefung zu verteilen. Nach dem Versiegeln die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, ohne sie zu schütteln. Am nächsten Morgen klopfst du die Lösung über einem Waschbecken und dann auf einen Stapel Papiertücher ab.

Geben Sie dann 150 Mikroliter 1%Blocker A in PBS in jede Vertiefung, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Inkubieren Sie die versiegelte Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur, während Sie während des Blockierungsschritts bei 700 U/min schüttelt und verdünnen Sie das rekombinante kardiale Myosin-bindende Protein C-Fragment auf eine Ausgangskonzentration von 2000 Nanogramm pro Milliliter in 1%Blocker A in PBS. Verdünnen Sie diese Lösung dann seriell um den Faktor fünf für insgesamt sieben Standards.

Entfernen Sie nun die Blockierungslösung wie gerade gezeigt und waschen Sie die Platte dreimal mit 150 Mikrolitern 0,05% Tween 20 in PBS. Nach dem dritten Waschgang schnippen Sie den Teller kräftig über ein Waschbecken und tupfen Sie den Teller dann fest auf eine Schicht Papiertücher, bis er vollständig trocken ist. Pipettieren Sie anschließend 25 Mikroliter jedes Standards und geben Sie die Probe in die entsprechenden Vertiefungen.

Während die versiegelte Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf dem Shaker inkubiert, verdünnen Sie dann einen speziell angefertigten kardialen Myosin-bindenden Protein-C-Nachweis-Antikörper, der mit Sul Oag markiert ist, auf ein Mikrogramm pro Milliliter in 1 %-Blocker A in PBS. Nachdem Sie die Platte wie gerade gezeigt sorgfältig gewaschen haben, fügen Sie 25 Mikroliter Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die versiegelte Platte dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur, während Sie während der Inkubationszeit geschüttelt werden. Lassen Sie die Demoplatte mit LED-Leuchten laufen, um die ordnungsgemäße Funktion des Sektor-Imagers sicherzustellen, und verdünnen Sie den Reid-Puffer auch zu diesem Zeitpunkt. Nachdem Sie die Platte wie zuvor gezeigt sorgfältig gewaschen haben, fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter Reid-Puffer in jede Vertiefung hinzu, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden, und scannen Sie die Platte dann sofort im Sektor-Imager, bevor Sie mit dem Threeplex-Assay beginnen.

Lassen Sie die 96-Well-Threeplex-Platte und die Verdünnungslösungen auf Raumtemperatur ausgleichen. Geben Sie dann 25 Mikroliter 1%Blocker A in PBS auf die Platte, stellen Sie sicher, dass die gesamte Vertiefung mit Lösung bedeckt ist, und inkubieren Sie die versiegelte Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln. In der Zwischenzeit verdünnen Sie das rekombinante kardiale Myosin-bindende Protein C-C-K-M-B und das kardiale Troponin I zusammen in 1%-Blocker A in PBS, um einen Standard zu erzeugen, der 2000 Nanogramm pro Milliliter kardiales Myosin-bindendes Protein C, 100 Nanogramm pro Milliliter CKMB und 25 Nanogramm pro Milliliter kardiales Troponin enthält.

Ich verdünne diese Mischung dann seriell um den Faktor fünf auf ein Endvolumen von mindestens 100 Mikrolitern für jede Standardprobe und verdünne die Proben zweimal mit 1%Blocker A in PBS. Als nächstes fügen Sie 2 25-Mikroliter-technische Repliken der Standards sowie die Proben zu den 25 Mikrolitern Blockierungspuffer hinzu, die bereits in den Vertiefungen der Drei-Plex-Platte vorhanden sind, fügen Sie einen Rohling mit Verdünnungsmittel erst nach Inkubation der versiegelten Platte unter Schütteln hinzu und verdünnen Sie die drei SUL oag-Nachweisantikörper zusammen auf eine Endkonzentration von jeweils einem Mikrogramm pro Milliliter in 1%iger Lösung Blocker A und PBS nach zwei Stunden. Waschen Sie die Platte wie gerade gezeigt und fügen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette jeweils 25 Mikroliter Nachweisantikörperlösung hinzu.

Inkubieren Sie die versiegelte Platte eine Stunde lang gut, während Sie sie während der Inkubationszeit bei 700 U/min schütteln. Führen Sie die Demoplatte aus und verdünnen Sie den Reid-Puffer wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Platte mit 0,05 % Tween 20 in PBS gewaschen haben, verwenden Sie die Mehrkanalpipette, um 150 Mikroliter Reid-Puffer in jede Vertiefung zu geben, um Luftblasen zu vermeiden, und scannen Sie die Platte sofort im Sektor-Imager.

In dieser Abbildung wird die Standardkurve des kardialen Myosin-bindenden Proteins C im Plex-Assay mit der des kardialen Myosin-Bindungsproteins C im Three-Plex-Assay verglichen. Beide Assays zeigen eine sehr hohe Sensitivität und einen hohen Dynamikbereich. Der Nachweisbereich des Assays wird grau dargestellt, sowohl Plex als auch Three Plex.

Die Standardkurven des kardialen Myosin-Bindungsproteins C sind ähnlich. Die untere Nachweisgrenze, die untere Bestimmungsgrenze und die obere Bestimmungsgrenze sind sowohl im Plex- als auch im Threeplex-Assay vergleichbar. Diese Diagramme zeigen die kardialen Troponin-I- und CKMB-Standardkurven der Threeplex-Platte.

Beide Kalibratoren zeigten eine hohe Empfindlichkeit und einen großen Dynamikbereich. Der Nachweisbereich des Assays wird grau dargestellt. Die Kreuzreaktivität der Detektionsantikörper mit den beiden anderen Kalibratoren wurde untersucht, indem die einzelnen Standardkurven aller drei Kalibratoren mit einzelnen Detektionsantikörpern inkubiert wurden; es wurde nur eine geringe Menge an Kreuzreaktivität zwischen dem CKMB-Kalibrator und sowohl kardialen Troponin-I- als auch kardialen Myosin-bindenden Protein-C-Detektionsantikörpern beobachtet.

Während keine Kreuzreaktivität zwischen den anderen Kalibratoren und Nachweisantikörpern als Beweis für die Anwendbarkeit des Assays zum Nachweis von Herzschäden beobachtet wurde, wurden die Serumspiegel von 16 Probanden mit Myokardinfarkt mit einer Kontrollgruppe verglichen, die die Serumspiegel des kardialen Myosin-bindenden Proteins C-C-K-M-B und des kardialen Troponins verwendete. Es wurde festgestellt, dass alle drei Biomarker bei den Patienten mit Myokardinfarkt im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht waren.