Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Die Bearbeitung von Genen in humanen pluripotenten Stammzellen ist eine Herausforderung. Dieses Protokoll bietet das detaillierte Verfahren für die Genomeditierung in diesen Zellen unter Verwendung eines gepaarten Cas-90-Falls in Kombination mit dem Zielvektor. Es ist zuverlässig und einfach zu befolgen.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es sich um eine nahtlose Genombearbeitung handelt. Die zweistufige Selektion trägt dazu bei, die Anzahl der Zielzellen zu erhöhen und hat das Genotypisierungs-Screening effizienter gemacht. Bewahren Sie humane pluripotente Stammzellen auf rekombinanten Laminin-21-kodierten Oberflächen in mTeSR1-Medium auf.

Die Zellen sollten 72 Stunden nach einem Split-Verhältnis von eins zu drei eine Konfluenz von 70 bis 85 % erreichen. Am Tag der Transfektion beschichten Sie genügend Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 300 Mikrolitern der Laminin-521-Lösung und inkubieren Sie die Platte mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation die Beschichtungslösung vorsichtig entfernen und sofort 300 Mikroliter frisches mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, in jede Vertiefung geben.

Legen Sie die Platte dann wieder in den Inkubator. Nehmen Sie die Stamm-humanen pluripotenten Stammzellen aus dem Inkubator. Entfernen Sie verbrauchtes Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter sterilem DPBS.

Geben Sie dann einen Milliliter sanftes Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie es sechs bis acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu dissoziieren. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen leicht lösen können. Verwenden Sie dann eine P1000-Spitze, um die Zellen durch Auf- und Abpipettieren anzuheben.

Geben Sie zwei Milliliter mTeSR1-Medium mit ROCK-Inhibitor hinzu, um die Dissoziation zu beenden. Die Suspension gut vermischen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Die Zellen werden drei Minuten lang bei 200 g zentrifugiert.

Anschließend wird der Überstand entfernt und die Zellen in zwei Millilitern mTeSR1-Medium mit ROCK-Inhibitor resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau. Für jede Nukleofektionsreaktion werden 800.000 bis 1 Million Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und drei Minuten lang bei 200 g zentrifugiert.

Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig an. Mischen Sie drei Mikrogramm der gepaarten Cas-9n-Singleguide-RNA-Expressionsplasmide und fünf Mikrogramm des Targeting-Vektorplasmids in 100 Mikrolitern gemischter Nukleofektionslösung aus dem Nukleofektionskit für menschliche Stammzellen. Bereiten Sie auch eine GFP-Kontrollplasmidmischung vor.

Resuspendieren Sie die Zellen mit dem DNA-Mix und übertragen Sie sie in eine Elektroporationsküvette, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen entstehen. Elektropopolieren Sie die Zellen mit dem Nukleofektionsgerät unter Verwendung der für humane pluripotente Stammzellen optimierten Bedingungen. Geben Sie sofort 500 Mikroliter frisches und warmes mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, in die elektroporierten Zellen.

Übertragen Sie dann die Mischung in zwei Vertiefungen der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platte. Legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, der mit 5 % Kohlendioxid versorgt ist, damit sich die Zellen erholen können. Ersetzen Sie das Zellerhaltungsmedium nach 12 bis 16 Stunden und ziehen Sie den ROCK-Inhibitor zurück, wenn die Zellen Zell-zu-Zell-Kontakt herstellen.

Nach 24 bis 48 Stunden ist die Nukleofektionseffizienz zu überprüfen, indem die GFP-Expression in den Kontrollzellen untersucht wird. Beginnen Sie mit der Zellauswahl, indem Sie das mTeSR1-Medium 48 Stunden nach der Nukleofektion mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin ergänzen. Nach 72 Stunden ergänzen Sie das Medium mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin.

Wenn die Zellkonfluenz weniger als 30% beträgt, ergänzen Sie das Medium auch mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren. Vier bis sechs Tage nach der Nukleofektionspassage werden die Puromycin-resistenten Zellen auf 10 bis 15 96 Well-Platten mit einer Konzentration von 0,8 Zellen pro Well aufgefüllt. Achten Sie darauf, das Medium mit ROCK-Inhibitor und Puromycin zu ergänzen.

Halten Sie die Zellen 10 bis 12 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid, um aus einzelnen Zellen abgeleitete Kolonien zu bilden. Füllen Sie das Medium sieben Tage nach der Aussaat auf. Markieren Sie Vertiefungen, die eine einzelne Kolonie enthalten, und ersetzen Sie das Medium durch frisches mTeSR1-Medium, das 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin, aber keinen ROCK-Inhibitor enthält.

Züchten Sie die Zellen zwei weitere Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie dann das Medium für Vertiefungen mit undifferenzierten Kolonien. Kratzen Sie die Kolonien vorsichtig ab und überführen Sie die Zellsuspension von einer Kolonie in zwei neue Vertiefungen auf separaten 96-Well-Platten.

Einen für die Genotypisierung und einen für die Erhaltung. Sobald die Konfluenz der Genotypisierungszellen 50 % oder mehr erreicht, entleeren Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS. Lysieren Sie die Zellen mit Bradley Lysis Buffer und isolieren Sie genomische DNA aus jeder Vertiefung

Nach der PCR mit drei Primer-Junctions und der Sequenzierung der Produkte behalten Sie die Kolonien mit dem richtigen Genotyp und verwerfen Sie den Rest. Erweitern Sie die korrekten Kolonien unter kontinuierlicher Puromycin-Selektion und frieren Sie sie zum frühestmöglichen Zeitpunkt ein. Dieses Protokoll wurde verwendet, um zwei Punktmutationen in Exon8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Gens einzuführen.

Eine auf drei Primern basierende PCR-Methode wurde verwendet, um nach korrekt anvisierten Zellen zu suchen, und eine Sanger-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die PCR-Ergebnisse zu bestätigen. Nach der Entnahme der Selektionskassette wurde die modifizierte Region erneut sequenziert, um die korrekte Einführung der gewünschten Punktmutationen zu bestätigen. Kolonien mit dem richtigen Genotyp wurden ausgewählt und die Zellen vor der weiteren Analyse charakterisiert.

Die editierten Zellen besitzen die gleiche Morphologie wie die Elternzellen und exprimieren repräsentative humane pluripotente Stammzellmarker, darunter die Transkriptionsfaktoren Nanog und Oct4 sowie die Zelloberflächenmarker SSEA-4 und TRA-160. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellkonfluenz nach der Puromycin-Auswahl während der ersten 24 Stunden zu überprüfen. Es ist wichtig, den Median mit einem ROCK-Inhibitor zu ergänzen.

Wenn die Zellkonfluenz niedriger als 30% ist, um die Zellen am Laufen zu halten. Sobald die genomeditierten pluripotenten Stammzelllinien etabliert sind, können sie zur Untersuchung der Genfunktion oder der gerichteten Differenzierung verwendet werden. Diese Technik ebnet Forschern den Weg, verschiedene Fragen zu untersuchen, wie z. B. die spezifische Funktion von Genen oder die gezielte Genkorrektur bei genetischen Krankheiten.