Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

Das übergeordnete Ziel der PSmOrange Photo Conversion Technology ist es, Zellen im lebenden Tier während der Embryonalentwicklung und der Krankheit zu verfolgen. Diese Methode kann zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie beantworten, wie z.B. die Aufdeckung der Herkunft von Zellen, die sich zu Geweben und Organen entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in GFP-transgenen Hintergründen angewendet werden kann.

Diese Methode kann auch in verschiedenen Forschungsbereichen wie Regeneration, Tumorprogression und Invasion eingesetzt werden. Nach der Erzeugung und Einbettung von PSmOrange- und GFP-exprimierenden Embryonen gemäß dem Textprotokoll legen Sie den Embryo unter das konfokale Mikroskop und verwenden Sie das 20-fache Luftobjektiv und 488- und 561-Nanometer-Laser, um die Probe zu scannen und einen Bereich zu identifizieren, der photokonvertiert werden soll. Um das PSmOrange-Protein vor der Photokonversion zu detektieren, verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser mit einer Leistung von 0,74 Milliwatt, gemessen in der Fokusebene über dem Objektiv, und passen Sie die Laserleistung nach Bedarf an.

Passen Sie die Zoomfaktoren an, um den interessierenden Bereich hervorzuheben und die Bildaufnahmezeit und die Fototoxizität zu reduzieren. Mit den 488- und 561-Nanometer-Lasern im sequentiellen Modus und einem Z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 Mikrometern erhalten Sie einen Z-Stapel, der die interessierenden Strukturen abdeckt. Passen Sie den Zeilendurchschnitt und die Scanfrequenz an, um die Bildqualität zu optimieren.

Scannen Sie dann die Probe und wählen Sie den Interessenbereich oder das ROI-Werkzeug aus, um den Bereich für die Fotokonvertierung hervorzuheben, bevor Sie den ROI als Stimulationsbereich festlegen. Wählen Sie das Photoaktivierungs-Bleaching-Modul aus, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um den 488-Nanometer-Laser zu aktivieren, und stellen Sie dann den 488-Nanometer-Laser auf 80 % und die Scangeschwindigkeit auf 0,5 Sekunden pro Bild ein. Öffnen Sie anschließend das Fotokonvertierungsprogramm und klicken Sie auf Hinzufügen'um das Fotokonvertierungsprotokoll anzugeben.

Stellen Sie im Menü für die Aufnahmestimulation Phase Eins auf Aufnahme ein und geben Sie im Menü "Schleifen" die Anzahl der Bilder an, die vor der Fotokonvertierung aufgenommen werden sollen. Stellen Sie Phase Zwei auf Stimulation ein und geben Sie die Anzahl der durchzuführenden Stimulationsereignisse ein. Passen Sie Phase drei an, wie für Phase Eins beschrieben.

Optional können Sie nach Phase zwei eine Wartephase einfügen, indem Sie die Wartezeit bis zur letzten Runde der Bildaufnahme eingeben. Sobald die Parameter eingestellt sind, wenden Sie die Stimulationseinstellung an und führen Sie die Fotokonvertierung durch. Miskroskopische Einstellungen sind für die PSmOrange-Fotokonvertierung von entscheidender Bedeutung.

Um eine erfolgreiche Photokonversion zu gewährleisten, wird der Embryo direkt nach dem Experiment abgebildet, um das photokonvertierte PSmOrange-Protein nachzuweisen. Wenn die Konvertierung nicht erfolgreich war, wird der Vorgang wiederholt. Wenn Sie die Laser mit 488, 561 und 640 Nanometern verwenden und den 640-Nanometer-Laser auf eine hohe Leistung von bis zu 4,5 Milliwatt einstellen, erhalten Sie einen endgültigen Z-Stapel mit den gerade beschriebenen Einstellungen.

Um den Embryo zu demontieren, nehmen Sie die Kammer aus dem Mikroskop und verwenden Sie eine Pinzette, um den Embryo aus der Agarose zu entfernen. Übertragen Sie den Embryo in eine neue sterilisierte Petrischale aus Kunststoff oder eine sterilisierte 6-Well-Platte, die 0,2 Millimolare PTU in E3 enthält. Inkubieren Sie den Embryo bei 28 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Um das Schicksal der photokonvertierten PSmOrange-Protein-exprimierenden Zellen zu analysieren, betten Sie den Embryo gemäß dem Textprotokoll wieder ein.

Scannen Sie die Probe unter dem konfokalen Miscroskop, um photokonvertierte Zellen in der interessierenden GFP-transgenen Struktur zu identifizieren. Verwenden Sie die Laser mit 488, 561 und 640 Nanometern, um einen Z-Stapel mit einem festen Stapel von 1 bis 2 Mikrometern im sequentiellen Modus zu erfassen, der die Strukturen abdeckt. Identifizieren Sie mit der Image J Fiji-Software Zellen, die GFP und das photokonvertierte Protein koexprimieren.

Duplizieren Sie den Originalstapel, verwenden Sie das Gaußsche Weichzeichnungs-Plugin und den Bildrechner, um die glatten Stapel vom Original zu subtrahieren. Wenden Sie bestimmte Schwellenwerte auf die Kanäle Grün und Fernrot an, um die fotokonvertierten Zellen hervorzuheben. Verwenden Sie dann das Werkzeug Partikel analysieren, um die Schwellenwertbereiche im grünen Kanal mit einer geeigneten Einstellung zu erkennen.

Wiederholen Sie diesen Schritt für den Kanal "Far Red". Öffnen Sie das Bildrechner-Plugin, um die co-lokalisierenden Zellen zu erkennen. Zeigen Sie die überlappenden ROIs im grünen oder fernen roten Kanal mit dem Werkzeug "Partikel analysieren" in Gelb an.

Führen Sie mit der Software NIS-Elements eine 3D-Datumsauswertung durch und stellen Sie den Stapel mit der Option Volumenansicht anzeigen in 3D dar. Verwenden Sie dann die grafische Oberfläche, um die Kanäle Grün, Rot und Fernrot auszuwählen, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an und schneiden Sie den 3D-Stapel zu, um den fotokonvertierten Bereich hervorzuheben. Hier sehen Sie ein Beispiel für das PSmOrange-Photokoversionssystem in Zebrafisch-transgenen FOXD3-Schwimmkopf-GFP-Embryonen.

26 Stunden nach der Befruchtung wurden zwei Zellcluster im vorderen Teil der Zirbeldrüse photokonvertiert und sofort abgebildet. Das Protein wurde mit einem 640 Nanometer großen fernroten Laser nachgewiesen, nicht jedoch mit einem 561 Nanometer Laser. In diesen Zellen war die GFP-Expression aufgrund des Photobleachings zunächst reduziert.

Bei 52 HPF wurden GFP und H2B PSmOrange in den photokonvertierten H2B PSmOrange Protein exprimierenden Zellen nachgewiesen. Einige dieser Zellen bildeten das Parapineal auf der linken Seite des Gehirns. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten über den Ursprung der parapinealen Zellen in der vorderen Zirbeldrüse überein und zeigt die Anwendbarkeit der PSmOrange-Technik im lebenden GFP-transgenen Wirbeltierembryo.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann die Zellverfolgungsanalyse an genetisch manipulierten Embryonen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den molekularen Hierarchien zu beantworten, die der Zellentwicklung zugrunde liegen.