Name: Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Zellverfolgung in vivo mit dem photokonvertierbaren PSmOrange-System in GFP-transgenen Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht Entwicklungsbiologen die Untersuchung von Zellursprüngen während der Embryogenese.

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Wir danken O. Subach für die Bereitstellung des originalen H2B-PSmOrange-Plasmids und unserem Fischeinrichtungsteam für die Fischpflege. Wir danken dem Nikon Imaging Center an der Universität Heidelberg für den Zugang zu Mikroskopiegeräten und Analysesoftware. Wir danken der Core Facility Live Cell Imaging Mannheim am CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG) für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Raum-zeitliche Koordination von Signalprozessen (EcTop 2), Universität Heidelberg bis C.A.B. und die Medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg und die DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 und 298/6-1) bis M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro-Transkription und mRNA Purification <ol><li> Linearisieren die H2B-PSmOrange enthält pCS2 + Plasmid, das die NotI-Restriktionsenzym unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Führen Sie die nächsten Schritte mit geeigneten Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Kittel mRNA Verschmutzung und Verschlechterung zu verhindern. </li><li> Reinige den linearisierten DNA einer PCR Purification Kit oder Phenol-Chloroform-basierte Verfahren nach Herstellerprotokollen. </li><li> Verwenden 1 ug linearisierte Matrizen-DNA für Sp6-mRNA-Transkription nach Herstellerangaben. </li><li> Entfernen DNA durch Zugabe von 1,0 U RNase freie DNaseI für 10-20 min bei 37 ° C. </li><li> Clean up the mRNA eine RNA bereinigen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Zur Erhöhung der mRNA Reinheit und Konzentration, fallen die mRNA durch Zugabe von 6 ul Natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) und 150 &amp; mgr; l 96% Ethanol. Inkubieren Sie die mixed Lösung bei -20 ° C für mindestens 30 min und bis zu 24 Stunden. </li><li> Sammeln Sie die mRNA, indem die Lösung bei 18,407 xg Zentrifugieren für 45 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren die mRNA in 150 ul 70% Ethanol. Mischen und Zentrifugieren der Lösung für weitere 15 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit, trocknet das Pellet für 5 Minuten auf Eis und resuspendieren die mRNA in 20 ul ultrareinem RNase freies Wasser. </li><li> Bewerten Sie die Konzentration und Reinheit der mRNA durch photometrische Messung einer 1: 100-mRNA-Verdünnung (1 ul mRNA in 99 &amp; mgr; l ultrareinem RNase freies Wasser). </li><li> Für kurzzeitige Lagerung, halten Sie die mRNA-Lösung bei -20 ° C. Für die langfristige Lagerung, halten Sie die mRNA bei -80 ° C. </li></ol> 2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroinjektion in Zebrafischembryonen <ol><li> Richten Sie Paare in der Nacht vor der Injektion Paarung mit tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppelt transgenen Fisch (oder jede andere GFP transgenen Fische). Lassen Sie den Fisch getrennt durch einen Abstandshalter platzierenzwischen ihnen die Zeit der Paarung zu steuern. </li><li> Entfernen Sie die Abstandshalter am Morgen der Einspritzung und lassen die Fische Kumpel für 20 min. </li><li> Während der Zeit der Paarung, verdünnte die H2B-PSmOrange mRNA zur endgültigen Konzentration von 130 pg / nl (in RNase freies Wasser) und Transfer 6 ul Injektionslösung in einem Mikroinjektion Kapillare eine Micro Trick. Schauen Sie sich die Einspritzmenge mit einem kalibrierten Glasträger. Stellen Sie den Einspritzdruck zu injizieren 2 nl mRNA-Lösung (260 pg). </li><li> Sammeln Sie die Eier in eine sterilisierte Kunststoffpetrischale mit 1x Embryo (E3) Medium. </li><li> Übertragen Sie 20 bis 30 Embryonen zu einem Einspritzschale mit einem Kunststoffpasteurpipette. </li><li> Injizieren 2 nl mRNA Lösung in der Zelle enthalten oder direkt unter der Zelle in das Eigelb an der Ein-Zell-Stadium 11. </li><li> Transfer injizierten Embryonen in eine Petrischale 1x E3-Medium, das Entfernen unbefruchtete oder nicht normal Embryonen und wachsen sie bei 28 ° C zu entwickeln. Hinweis: Lichtschutz of den Embryonen nicht während des ganzen Experiments erforderlich. </li><li> Heben Zebrafischembryonen in 1x E3 Medium und fügen 0,2 mM PTU (1-Phenyl-2 Thioharnstoff) nach gastrulation Pigmentierung zu hemmen. Ändern Sie das Medium zweimal pro Tag, um die Gefahr von bakteriellen Kontaminationen zu minimieren. </li></ol> 3. Embryo Einbetten <ol><li> Wählen Sie das GFP (grün) und PSmOrange (orange / rot) co-exprimierenden Embryonen ein Binokular mit einem Fluoreszenz-Lampe und angemessene Emissionsfiltern. Übertragen Sie die positiven Embryonen in eine sterile Petrischale mit 1x E3 Medium. </li><li> Dechorionate Embryonen unter einem Stereomikroskop Pinzette 12. </li><li> Transfer eines Embryos in ein 1,5 ml Röhrchen mit 1,0 ml vorgewärmten 1,0% niedrig schmelzender Agarose (LMA) in ultrareinem Wasser hergestellt, indem ein Cut-Spitze Pipette (P200) verwendet. Hinweis: Wärmen Sie die LMA bis 80 ° C und Abkühlung für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur, bevor der Embryo Einbettung. </li><li> Übertragen Sie die Embryos in 150 ul LMA in einemKammerdeckgläser und passen Sie die Ausrichtung des Embryos, zum Beispiel Rückenseite nach unten in das Experiment für den invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + (oder einem anderen geeigneten Mikroskop) beschrieben, eine feine Spitze aus Kunststoff verwenden. Wenn die LMA polymerisiert wird, füllen Sie die Kammer mit Fisch Wasser, das 0,2 mM PTU und 0,02% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat (Tricaine) für die Anästhesie. </li><li> Bevor die Probe Bildgebung, warten Sie 15 Minuten, um die Wirkung von Tricaine zu ermitteln. Die Anästhesie verhindert Embryo Bewegungen, die ein Stereomikroskop mit Hellfeldbeleuchtung überwacht werden kann. Anmerkung: Die Kammern zweimal wiederverwendet werden kann. </li></ol> 4. PSmOrange Photokonversion <ol><li> Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe um den Bereich zu identifizieren, um photoconvert mit 488 nm und 561 nm Laser zur Abbildung GFP und PSmOrange sind. Hinweis: Mit der umgekehrten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + auf dem umgekehrten stage TiEcontrolled durch das Mikroskop Imaging-Software und ausgestattet mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser für die Photokonversion und Bildgebung. Jedoch ist die Anwendung sicher nicht auf diese beschränkt Mikroskop solange die Laserlinien zur Umwandlung und Bild verfügbar sind. <ol><li> Setzen Sie den 20X Luft Objektiv ein (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm). </li><li> Verwenden Sie die folgenden Einstellungen des Mikroskops die PSmOrange Protein vor Photokonversion zu erkennen: 561-nm-Laser, 0,74 mW bei der Fokusebene über dem Ziel gemessen. Hinweis: Diese auf diesem System bis zu 40% entspricht (in der Fokusebene messen, ist der einzige Weg, um die Wirkleistung zu bestimmen). Stellen Sie die Laserleistung nach experimentellen Anforderungen wie die Effizienz der H2B-PSmOrange Injektionen variieren. </li><li> In Zoomfaktoren den Bereich von Interesse zu markieren. Höhere Vergrößerungen reduzieren Bildaufnahmezeit und damit Phototoxizität. </li></ol></li><li> Erwerben Sie eine Z-Stack für den Aufbaus von Interesse unter Verwendung von 488 nm und 561 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-&gt; 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren. </li><li> Scannen Sie die Probe und wählen Sie die Region of Interest (ROI) Werkzeug, um den Bereich zu markieren, um photoconvert. Befestigen Sie den ROI als Stimulationsbereich. Wählen Sie das Foto Aktivierung / Bleaching-Modul, aktivieren Sie die 488-nm-Laser durch das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren und stellen Sie die 488-nm-Laser bis 80% (1 mW Laserleistung auf dem Ziel gemessen). Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit bis 0,5 sec / Frame. </li><li> Öffnen Sie die Photo Dienstprogramm (ND Stimulation) und die Photo Einstellungen angeben. <ol><li> Klicken Sie auf den Befehl &quot;Hinzufügen&quot; die Photo Protokoll anzugeben. </li><li> Stellen Sie &quot;Phase&quot; ein in der &quot;Erwerb / Stimulation&quot; -Menü auf &quot;Übernahme&quot; und geben Sie die Anzahl der Bilder vor Photo erworben werden in der &quot;Loops&quot; -Menü. </li><li> Stellen Sie &quot;Phase&quot; 2 auf &quot;St.imulation &quot;und die Anzahl der Stimulationsereignisse geben durchgeführt werden. </li><li> Stellen Sie &quot;Phase&quot; 3 wie für &quot;Phase&quot; 1. Optional beschrieben, legen Sie eine Warte &quot;Phase&quot; nach der &quot;Phase&quot; 2 durch die Zeit vor der letzten Runde der Bildaufnahme zu warten eingeben. </li><li> Sobald alle Parameter eingestellt werden, gelten die Stimulation Einstellung und die Photo laufen. Hinweis: Die Laserleistung, die Frequenz des Scannens und der Anzahl der Wiederholungen für jede Runde von Photo variieren und unterscheiden sich von Embryos Embryos. Eine Einstellung zu beginnen, ist in Tabelle 1 gezeigt. </li></ol></li><li> Erwerben Sie eine endgültige Z-Stapel mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser, wie oben die Einstellungen zu übernehmen. Stellen Sie die 640-nm-Laser die konvertierte PSmOrange mit hoher Laserleistung (bis zu 4,5 mW) zu visualisieren. </li></ol> 5. Demontieren Embryo aus LMA <ol><li> Entfernen Sie den Embryo aus dem Mikroskop enthaltenden Kammer. Entfernen Sie vorsichtig den Embryo aus der Agarose usingen Zange. </li><li> Bringen Sie den Embryo in eine neue sterilisierte Kunststoffpetrischale oder in eine sterilisierte 6-Well-Platte mit 1x E3 und 0,2 mM PTU. Inkubieren des Embryos bei 28 ° C, bis die gewünschte Stufe der Entwicklung. </li></ol> 6. Die Analyse der Fate of photokonvertiertem PSmOrange Protein exprimierenden Zellen <ol><li> Re-einbetten den Embryo als 3.3 und 3.4 unter den Punkten beschrieben. </li><li> Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe zu photokonvertiertem Zellen (640 nm) in der GFP transgenen Struktur von Interesse (488 nm) zu identifizieren. </li><li> Erwerben Sie eine Z-Stapel Abdecken der Strukturen von Interesse unter Verwendung von 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-&gt; 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren. </li><li> Verwenden Sie eine der folgenden Methoden, um Zellen zu identifizieren, die Co-express GFP und die photokonvertiertem Protein. <ol><li> Maß automatische Fidschi BildJ Makro 3 <ol><li> Convolve der Originalstapel die &quot;Weichzeichnen&quot; Plugin (→ Bearbeiten → Filter → Weichzeichnen) und subtrahieren die glatten Stapel von der ursprünglichen Verwendung der &quot;Bild Rechner&quot; Plugin (→ Prozess → Bildrechner) verwenden. Verwenden Sie diesen Schritt, um die Strukturen von Interesse zu visualisieren und zur Verringerung der Rechenzeit für die Analyse. </li><li> Übernehmen bestimmte Schwellenwerte zu den grünen und dunkelroten Kanäle, um die photokonvertiertem Zellen zu markieren (→ Bild → → Stellen Threshold). Verwenden Sie den &quot;Analyze Particles&quot; Werkzeug, um die Schwelle Bereiche mit einem passenden Rahmen zu erkennen (→ Analysieren → Analysieren Partikel). </li><li> Öffnen Sie die &quot;Bild Rechner&quot; Plugin und zeigen die überlappenden ROIs im grünen und dunkelroten Kanal in gelb (→ Prozess → Bildrechner). </li></ol></li><li> Microscope Imaging-Software für 3D-Datenauswertung <ol><li> Zeigen Sie den Stapel in3D die Show Volumen Ansichtsoption (→ 3D-Visualisierung Menü → Show Volume anzeigen) verwenden. Verwenden Sie die grafische Schnittstelle, um die grünen, roten und dunkelrotes Kanäle, die Helligkeit, den Kontrast und die Ernte der 3D-Stapel zu wählen Sie die photokonvertiertem Bereich (Abbildung 1) zu markieren. Hinweis: Ähnliche Verfahren werden die Daten sind in den meisten der gemeinsamen Software zur Bildanalyse zu analysieren. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Transgene Embryonen fluoreszierenden Reporter trägt grundlegend zu verstehen, die embryonale Entwicklung geholfen. Es besteht jedoch immer noch die wesentliche Notwendigkeit für Promotoren die spezifische Visualisierung von besonderen Strukturen zu erleichtern. In ihrer Abwesenheit, verlassen sich die Forscher auf Techniken wie die Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen über den Ursprung und die Entwicklung ihrer Struktur von Interesse zu erfahren. Dies wiederum ist eine wesentliche Voraussetzung, die molekulare...

Exponentiell verbesserte bildgebende Verfahren ermöglichen es, Entwicklungsprozesse über Zeiträume von bis zu vier aufeinanderfolgenden Tagen zu verfolgen3. Im Zebrafisch und vielen anderen Tiermodellsystemen werden bestimmte Zellen, Gewebe, axonale oder vaskuläre Strukturen durch transgene grüne oder manchmal rot oder gelb fluoreszierende Proteine markiert, um die Visualisierung zu erleichtern. In den meisten transgenen Linien wird das Transgen jedoch nicht spezifisch in den interessierenden Zellen exprimiert, sondern auch in zusätzlichen Strukturen, was die genaue Verfolgung von beispielsweise einzelnen Zellen oder Zellgruppen erschwert.
Fluoreszierende photokonvertierbare Proteine eignen sich gut für die Zellverfolgung während der Embryonalentwicklung. Die Voraussetzungen für die Anwendung solcher Proteine sind eine lange Lebensdauer, ein gut getrennter Emissionsbereich bei der Umwandlung und eine helle Fluoreszenz. Zu den verfügbaren photokonvertierbaren Proteinen gehören solche, die ihren Emissionsbereich bei der Umwandlung ändern, wie Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 oder Dendra27 und andere, die nur bei Photoaktivierung fluoreszieren (PAmCherry8, PAGFP9 oder PATagRFP10). Ihre Anwendungen zur Verfolgung von Zellen in bestehenden FP-transgenen Tieren sind jedoch begrenzt, da sie oft einen grün fluoreszierenden Zustand aufweisen oder nicht alle oben genannten Kriterien erfüllen. Erst kürzlich berichteten Subach und Kollegen über das PSmOrange-Protein, das seine Emission bei der Photokonversion von orange/rot zu dunkelrot ändert und erfolgreich in Zellen in Kultur und kultivierten Zellen angewendet wurde, die in Mäuse injiziert wurden2.
Um die Eignung des Proteins für die Zellverfolgung in einem lebenden Embryo zu untersuchen, haben wir ein Expressionskonstrukt für die Mikroinjektion von nuklear-markiertem H2B-PSmOrange in Zebrafischembryonen generiert. Wir stellen fest, dass das Protein alle Voraussetzungen für eine erfolgreiche Zellverfolgung in GFP-transgenen Hintergründen während der ersten 4 (und möglicherweise mehr) Tage der Embryonalentwicklung von Zebrafischen erfüllt. Während dieser Zeit werden die meisten Zellmigrationsereignisse in Fischen abgeschlossen, was das PSmOrange-System zu einer hervorragenden Ergänzung des Zebrafisch-Toolkits macht.

<table><tbody><tr><td>PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff Pasteur</td><td>alpha laboratories</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Original H2B-PSmOrange Plasmid</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>Das in der Arbeit beschriebene Plasmid ist erhältlich im Carl lab</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 Deutsches Deckglassystem&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Deutschland</td><td>Nr</td>. Nummer <td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; 20X Luftobjektiv&nbsp;</td><td>Nikon GmbH Deutschland</td><td>No Number</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td><td>No Number</td><td></td></tr></tbody></table>

tracking-zellen in gfp-transgenen zebrafisch mit dem photokonvertierbare psmorange-system

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Die schnelle Entwicklung von transparenten Zebrafischembryonen (Danio rerio) in Kombination mit fluoreszierenden Markierungen von Zellen und Geweben ermöglicht es, Entwicklungsprozesse zu visualisieren, wie sie im lebenden Tier ablaufen. Interessante Zellen können markiert werden, indem ein gewebespezifischer Promotor verwendet wird, um die Expression eines fluoreszierenden Proteins (FP) für die Erzeugung transgener Linien zu steuern. Die Verwendung von fluoreszierenden photokonvertierbaren Proteinen zu diesem Zweck ermöglicht es zusätzlich, definierte Strukturen innerhalb der Expressionsdomäne genau zu verfolgen. Wenn das Protein in der interessierenden Region beleuchtet wird, ändert sich sein Emissionsspektrum und eine bestimmte Zelle oder ein bestimmter Zellcluster wird hervorgehoben, während andere transgene Zellen in ihrer ursprünglichen Farbe verbleiben. Eine wesentliche Einschränkung ist der Mangel an bekannten Promotoren für eine große Anzahl von Geweben im Zebrafisch. Umgekehrt haben Gen- und Enhancer-Fallen-Screens enorme transgene Ressourcen generiert, die buchstäblich alle embryonalen Strukturen diskret markieren, meist mit GFP oder in geringerem Maße mit roten oder gelben FPs. Ein Ansatz, um definierten Strukturen in solchen transgenen Hintergründen zu folgen, wäre die zusätzliche Einführung eines ubiquitären photokonvertierbaren Proteins, das in der/den interessierenden Zelle(n) umgewandelt werden könnte. Die verfügbaren photokonvertierbaren Proteine weisen jedoch einen grünen und/oder seltener einen roten Emissionszustand1 auf und können daher oft nicht zur Verfolgung von Zellen im FP-Hintergrund bestehender transgener Linien verwendet werden. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir für den Zebrafisch2,3 das PSmOrange-System etabliert. Eine einfache Mikroinjektion von synthetischer mRNA, die für eine nukleäre Form dieses Proteins kodiert, markiert alle Zellkerne mit orange/roter Fluoreszenz. Bei gezielter Photokonversion des Proteins schaltet es sein Emissionsspektrum auf fernrot um. Die Quanteneffizienz und Stabilität des Proteins machen PSmOrange zu einem hervorragenden Zellverfolgungswerkzeug für Zebrafische und möglicherweise andere Teleostarten.

1 veranschaulicht ein Beispiel des PSmOrange Photosystem. Die Zirbeldrüse Komplex ist eine konservierte Struktur im Wirbeltier dorsalen Zwischenhirn. Wie in vielen anderen Wirbeltieren besteht dieser Komplex der Pinealorgan in der Mitte des Zwischenhirns und den linksseitigen parapineal Zellen. Elegant, aber zeitaufwendig Uncaging Experimente zeigten, dass parapineal Zellen 13 in den vorderen Teil des Pinealorgan stammen. In tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) tran...

Wir haben das photokonvertierbare PSmOrange-System als leistungsstarkes, unkompliziertes und kostengünstiges Werkzeug für die in vivo Zellverfolgung in GFP-transgenen Hintergründen etabliert. Dieses Protokoll beschreibt seine Anwendung im Zebrafisch-Modellsystem.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Das übergeordnete Ziel der PSmOrange-Foto-Umwandlungstechnologie besteht darin, Zellen im lebenden Organismus während der embryonalen Entwicklung und bei Krankheiten zu verfolgen. Diese Methode kann zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie beantworten, beispielsweise die Aufklärung des Ursprungs von Zellen, die sich zu Geweben und Organen entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie in GFP-transgenen Hintergründen angewendet werden kann.Diese Methode kann auch in verschiedenen Forschungsbereichen angewendet werden, wie beispielsweise Regeneration, Tumorprogression und Invasion. Nachdem PSmOrange- und GFP-exprimierende Embryonen gemäß dem Textprotokoll erzeugt und eingebettet wurden, platzieren Sie den Embryo unter dem konfokalen Mikroskop und verwenden Sie das 20x-Luftobjektiv sowie 488- und 561-Nanometer-Laser, um die Probe zu scannen und einen Bereich für die Photokonversion zu identifizieren. Um das PSmOrange-Protein vor der Photokonversion nachzuweisen, verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser mit einer Leistung von 0,74 Milliwatt, gemessen in der Fokusebene oberhalb des Objektivs, und passen Sie die Laserleistung bei Bedarf an.Passen Sie die Zoomfaktoren an, um den Bereich von Interesse hervorzuheben und die Bildaufnahmedauer sowie die Phototoxizität zu reduzieren. Erstellen Sie mittels der 488- und 561-Nanometer-Laser im sequenziellen Modus und mit einem Z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 Mikrometern einen Z-Stack, der die Strukturen von Interesse abdeckt. Passen Sie den Linienmittelwert und die Abtastfrequenz an, um die Bildqualität zu optimieren.Scannen Sie dann die Probe und wählen Sie den interessierenden Bereich oder das ROI-Werkzeug aus, um den Bereich hervorzuheben, der vor dem Festlegen des ROI als Stimulationsbereich photoaktiviert werden soll. Wählen Sie das Photokonvertierungs-Bleaching-Modul aus, aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den 488-Nanometer-Laser und stellen Sie den 488-Nanometer-Laser auf 80 % sowie die Scan-Geschwindigkeit auf 0,5 Sekunden pro Bild. Öffnen Sie anschließend das Photokonvertierungs-Tool und klicken Sie auf „Hinzufügen“, um das Photokonvertierungsprotokoll festzulegen.Stellen Sie im Erfassungsstimulationsmenü Phase Eins auf Erfassung ein und geben Sie im Schleifenmenü die Anzahl der Bilder an, die vor der Photoumwandlung erfasst werden sollen. Stellen Sie Phase Zwei auf Stimulation und geben Sie die Anzahl der durchzuführenden Stimulationsvorgänge ein. Passen Sie Phase Drei wie für Phase Eins beschrieben an.Optional können Sie nach Phase zwei eine Wartezeit einfügen, indem Sie die Wartezeit vor der letzten Runde der Bildaufnahme eingeben. Sobald die Parameter festgelegt sind, wenden Sie die Stimulationsbedingungen an und führen die Photoconversion durch. Mikroskopische Einstellungen sind entscheidend für die PSmOrange-Photoconversion. Um eine erfolgreiche Photoumwandlung sicherzustellen, wird das Embryo direkt nach dem Experiment abgebildet, um das photoumgewandelte PSmOrange-Protein nachzuweisen. Falls die Umwandlung nicht erfolgreich war, wird das Verfahren wiederholt. Unter Verwendung der 488-, 561- und 640-Nanometer-Laser und Einstellung des 640-Nanometer-Lasers auf hohe Leistung, bis zu 4,5 Milliwatt, wird ein abschließender Z-Stack mit den gerade beschriebenen Einstellungen aufgenommen.Um das Embryo zu entnehmen, entfernen Sie die Kammer vom Mikroskop und verwenden Sie Pinzette, um das Embryo aus dem Agarose zu lösen. Überführen Sie das Embryo in eine neue sterilisierte Plastik-Petri-Schale oder eine sterilisierte 6-Well-Platte, die 0,2 Millimolar PTU in E3 enthält. Inkubieren Sie das Embryo bei 28 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Um das Schicksal der photokonvertierten, PSmOrange-Protein exprimierenden Zellen zu analysieren, betten Sie das Embryo erneut gemäß dem Textprotokoll ein.Unter dem konfokalen Mikroskop die Probe scannen, um photoconvertierte Zellen in der GFP-transgenen Struktur von Interesse zu identifizieren. Die 488-, 561- und 640-Nanometer-Laser verwenden, um einen Z-Stack mit einer festen Schrittweite von 1 bis 2 Mikrometern im sequenziellen Modus aufzunehmen, der die Strukturen abdeckt. Mithilfe der Image-J-Fiji-Software Zellen identifizieren, die GFP und das photoconvertierte Protein koexprimieren.Den ursprünglichen Stack duplizieren, das Gaussian Blur-Plugin und den Bildrechner verwenden, um die geglätteten Stacks vom Original abzuziehen. Spezifische Schwellenwerte auf die grünen und fernroten Kanäle anwenden, um die photokonvertierten Zellen hervorzuheben. Anschließend das Werkzeug „Analyze Particles“ verwenden, um die schwellenwertbasierten Bereiche im grünen Kanal mit geeigneten Einstellungen zu detektieren.Wiederholen Sie diesen Schritt für den Fernrot-Kanal. Öffnen Sie das Bildrechner-Plugin, um die koinzidierenden Zellen zu detektieren. Zeigen Sie die überlappenden ROIs im grünen oder im Fernrot-Kanal mit dem Analyze Particles-Tool gelb an.Unter Verwendung der NIS-Elements-Software die 3D-Datenauswertung durchführen und den Stapel mit der Option „Show Volume View“ in 3D darstellen. Anschließend über die grafische Benutzeroberfläche die grünen, roten und fernroten Kanäle auswählen, Helligkeit und Kontrast anpassen und den 3D-Stapel zuschneiden, um den photoconvertierten Bereich hervorzuheben. Gezeigt ist hier ein Beispiel des PSmOrange-Photoconversion-Systems in transgenen Zebrafisch-FOXD3-floating-head-GFP-Embryonen.26 Stunden nach der Befruchtung wurden zwei Zellverbände im vorderen Teil der Zirbeldrüse photokonvertiert und unmittelbar abgebildet. Das Protein wurde mit einem 640 Nanometer fernen roten Laser nachgewiesen, jedoch nicht mit einem 561 Nanometer Laser. In diesen Zellen war die GFP-Expression aufgrund von Photobleichen zunächst verringert.Zu 52 HPF wurden GFP und H2B PSmOrange in den photokonvertierten Zellen nachgewiesen, die das H2B PSmOrange-Protein exprimierten. Einige dieser Zellen bildeten den Parapinealkörper auf der linken Seite des Gehirns. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten über die Herkunft der Parapinealzellen aus dem vorderen Epiphysengebiet überein und zeigt die Anwendbarkeit der PSmOrange-Technik in lebenden GFP-transgenen Wirbeltierembryonen.Mit dieser Methode kann die Zellverfolgungsanalyse in genetisch veränderten Embryonen durchgeführt werden, um weitere Fragen zu den molekularen Hierarchien, die der Zellentwicklung zugrunde liegen, zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt einen allgemeinen Ansatz zur Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. Wir beschreiben Verfahren für die Photokonversion puried Protein-Proben, sowie für Dual-Sonde optische Hervorhebung in lebende Zellen mit mOrange2 und Dronpa.

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

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Hier stellen wir eine Methode zur lichtaktivierten Umschaltung von photoveränderbaren fluoreszierenden Proteinen (PCFPs) im lebenden Zebrafischembryo sowie die anschließende Verfolgung des photoveränderten Proteins zu bestimmten Zeitpunkten während der Entwicklung vor. Diese Methodik ermöglicht die Beobachtung zellbiologischer Vorgänge, die verschiedenen Entwicklungsprozessen in einem lebenden Wirbeltierorganismus zugrunde liegen.

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Dieses Video zeigt die Verfolgung der Leukozytenrekrutierung mit transgenen Zebrafischlarven, die photokonvertierbares grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Vorinjektion von rot fluoreszierenden Farbstoff-markierten Bakterien in das otische Vesikel und die Induktion der Photokonversion ermöglicht die Beobachtung der Migration, Phagozytose und Ausbreitung von Leukozyten im Körper und liefert wertvolle Einblicke in die Dynamik der Immunantwort.

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Somitogenese ist eine rhythmische Entwicklungsprozess, die räumlich Muster die Körperachse von Wirbeltierembryonen. Bisher haben wir transgenen Zebrafischlinien, die fluoreszierenden Reporter nutzen, um die zyklischen Gene, die dieser Prozess vorangetrieben beobachten. Hier wir Kultur verteilt Zellen aus diesen Linien und Bild ihre Schwingungen über die Zeit in vitro.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den Ladungszustand Kaede fluoreszierenden Proteins in endokardialen Zellen der lebenden Zebrafischembryo, die es die Verfolgung von endokardialen Zellen während der ventrikulären Kanal und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung ermöglicht .

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

Wir präsentieren Ihnen eine effiziente und einfach zu bedienende Protokoll für die Zubereitung von primären Zellkulturen von Zebrafisch-Embryonen zu Transfektion und live Cell Imaging sowie ein Protokoll Primärzellen von Erwachsenen Zebrafisch Gehirn vorzubereiten.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Erfahren Sie die Zellverfolgung in vivo mit dem photokonvertierbaren PSmOrange-System in GFP-transgenen Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht Entwicklungsbiologen die Untersuchung von Zellursprüngen während der Embryogenese.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

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