Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System
5. Februar 2016
Wir haben das photokonvertierbare PSmOrange-System als leistungsstarkes, unkompliziertes und kostengünstiges Werkzeug für die in vivo Zellverfolgung in GFP-transgenen Hintergründen etabliert. Dieses Protokoll beschreibt seine Anwendung im Zebrafisch-Modellsystem.
Das übergeordnete Ziel der PSmOrange Photo Conversion Technology ist es, Zellen im lebenden Tier während der Embryonalentwicklung und der Krankheit zu verfolgen. Diese Methode kann zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie beantworten, wie z.B. die Aufdeckung der Herkunft von Zellen, die sich zu Geweben und Organen entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in GFP-transgenen Hintergründen angewendet werden kann.
Diese Methode kann auch in verschiedenen Forschungsbereichen wie Regeneration, Tumorprogression und Invasion eingesetzt werden. Nach der Erzeugung und Einbettung von PSmOrange- und GFP-exprimierenden Embryonen gemäß dem Textprotokoll legen Sie den Embryo unter das konfokale Mikroskop und verwenden Sie das 20-fache Luftobjektiv und 488- und 561-Nanometer-Laser, um die Probe zu scannen und einen Bereich zu identifizieren, der photokonvertiert werden soll. Um das PSmOrange-Protein vor der Photokonversion zu detektieren, verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser mit einer Leistung von 0,74 Milliwatt, gemessen in der Fokusebene über dem Objektiv, und passen Sie die Laserleistung nach Bedarf an.
Passen Sie die Zoomfaktoren an, um den interessierenden Bereich hervorzuheben und die Bildaufnahmezeit und die Fototoxizität zu reduzieren. Mit den 488- und 561-Nanometer-Lasern im sequentiellen Modus und einem Z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 Mikrometern erhalten Sie einen Z-Stapel, der die interessierenden Strukturen abdeckt. Passen Sie den Zeilendurchschnitt und die Scanfrequenz an, um die Bildqualität zu optimieren.
Scannen Sie dann die Probe und wählen Sie den Interessenbereich oder das ROI-Werkzeug aus, um den Bereich für die Fotokonvertierung hervorzuheben, bevor Sie den ROI als Stimulationsbereich festlegen. Wählen Sie das Photoaktivierungs-Bleaching-Modul aus, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um den 488-Nanometer-Laser zu aktivieren, und stellen Sie dann den 488-Nanometer-Laser auf 80 % und die Scangeschwindigkeit auf 0,5 Sekunden pro Bild ein. Öffnen Sie anschließend das Fotokonvertierungsprogramm und klicken Sie auf Hinzufügen'um das Fotokonvertierungsprotokoll anzugeben.
Stellen Sie im Menü für die Aufnahmestimulation Phase Eins auf Aufnahme ein und geben Sie im Menü "Schleifen" die Anzahl der Bilder an, die vor der Fotokonvertierung aufgenommen werden sollen. Stellen Sie Phase Zwei auf Stimulation ein und geben Sie die Anzahl der durchzuführenden Stimulationsereignisse ein. Passen Sie Phase drei an, wie für Phase Eins beschrieben.
Optional können Sie nach Phase zwei eine Wartephase einfügen, indem Sie die Wartezeit bis zur letzten Runde der Bildaufnahme eingeben. Sobald die Parameter eingestellt sind, wenden Sie die Stimulationseinstellung an und führen Sie die Fotokonvertierung durch. Miskroskopische Einstellungen sind für die PSmOrange-Fotokonvertierung von entscheidender Bedeutung.
Um eine erfolgreiche Photokonversion zu gewährleisten, wird der Embryo direkt nach dem Experiment abgebildet, um das photokonvertierte PSmOrange-Protein nachzuweisen. Wenn die Konvertierung nicht erfolgreich war, wird der Vorgang wiederholt. Wenn Sie die Laser mit 488, 561 und 640 Nanometern verwenden und den 640-Nanometer-Laser auf eine hohe Leistung von bis zu 4,5 Milliwatt einstellen, erhalten Sie einen endgültigen Z-Stapel mit den gerade beschriebenen Einstellungen.
Um den Embryo zu demontieren, nehmen Sie die Kammer aus dem Mikroskop und verwenden Sie eine Pinzette, um den Embryo aus der Agarose zu entfernen. Übertragen Sie den Embryo in eine neue sterilisierte Petrischale aus Kunststoff oder eine sterilisierte 6-Well-Platte, die 0,2 Millimolare PTU in E3 enthält. Inkubieren Sie den Embryo bei 28 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Um das Schicksal der photokonvertierten PSmOrange-Protein-exprimierenden Zellen zu analysieren, betten Sie den Embryo gemäß dem Textprotokoll wieder ein.
Scannen Sie die Probe unter dem konfokalen Miscroskop, um photokonvertierte Zellen in der interessierenden GFP-transgenen Struktur zu identifizieren. Verwenden Sie die Laser mit 488, 561 und 640 Nanometern, um einen Z-Stapel mit einem festen Stapel von 1 bis 2 Mikrometern im sequentiellen Modus zu erfassen, der die Strukturen abdeckt. Identifizieren Sie mit der Image J Fiji-Software Zellen, die GFP und das photokonvertierte Protein koexprimieren.
Duplizieren Sie den Originalstapel, verwenden Sie das Gaußsche Weichzeichnungs-Plugin und den Bildrechner, um die glatten Stapel vom Original zu subtrahieren. Wenden Sie bestimmte Schwellenwerte auf die Kanäle Grün und Fernrot an, um die fotokonvertierten Zellen hervorzuheben. Verwenden Sie dann das Werkzeug Partikel analysieren, um die Schwellenwertbereiche im grünen Kanal mit einer geeigneten Einstellung zu erkennen.
Wiederholen Sie diesen Schritt für den Kanal "Far Red". Öffnen Sie das Bildrechner-Plugin, um die co-lokalisierenden Zellen zu erkennen. Zeigen Sie die überlappenden ROIs im grünen oder fernen roten Kanal mit dem Werkzeug "Partikel analysieren" in Gelb an.
Führen Sie mit der Software NIS-Elements eine 3D-Datumsauswertung durch und stellen Sie den Stapel mit der Option Volumenansicht anzeigen in 3D dar. Verwenden Sie dann die grafische Oberfläche, um die Kanäle Grün, Rot und Fernrot auszuwählen, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an und schneiden Sie den 3D-Stapel zu, um den fotokonvertierten Bereich hervorzuheben. Hier sehen Sie ein Beispiel für das PSmOrange-Photokoversionssystem in Zebrafisch-transgenen FOXD3-Schwimmkopf-GFP-Embryonen.
26 Stunden nach der Befruchtung wurden zwei Zellcluster im vorderen Teil der Zirbeldrüse photokonvertiert und sofort abgebildet. Das Protein wurde mit einem 640 Nanometer großen fernroten Laser nachgewiesen, nicht jedoch mit einem 561 Nanometer Laser. In diesen Zellen war die GFP-Expression aufgrund des Photobleachings zunächst reduziert.
Bei 52 HPF wurden GFP und H2B PSmOrange in den photokonvertierten H2B PSmOrange Protein exprimierenden Zellen nachgewiesen. Einige dieser Zellen bildeten das Parapineal auf der linken Seite des Gehirns. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten über den Ursprung der parapinealen Zellen in der vorderen Zirbeldrüse überein und zeigt die Anwendbarkeit der PSmOrange-Technik im lebenden GFP-transgenen Wirbeltierembryo.
Im Anschluss an dieses Verfahren kann die Zellverfolgungsanalyse an genetisch manipulierten Embryonen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den molekularen Hierarchien zu beantworten, die der Zellentwicklung zugrunde liegen.
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Übersicht
Das PSmOrange-System ist ein kostengünstiges Werkzeug für das In-vivo-Zelltracking in GFP-transgenen Hintergründen, insbesondere in Zebrafischmodellen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Zellherkunft während der embryonalen Entwicklung und bei Krankheiten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Entwicklungsbiologie
- Zellverfolgung
- Embryonale Entwicklung
Hintergrund
- Die PSmOrange-Photo-Umwandlungstechnologie ermöglicht die Verfolgung von Zellen in lebenden Organismen.
- Diese Methode ist in verschiedenen Forschungsbereichen anwendbar, einschließlich Regeneration und Tumorprogression.
- Sie kann in GFP-transgenen Hintergründen verwendet werden, was ihre Vielseitigkeit erhöht.
- Die konfokale Mikroskopie wird zur Visualisierung und Photoumwandlung von Zellen eingesetzt.
Zweck der Studie
- Um Zellen während der embryonalen Entwicklung und bei Krankheitsprozessen zu verfolgen.
- Um die Herkunft von Zellen aufzuklären, die sich zu Geweben und Organen entwickeln.
- Um Einblicke in das zelluläre Verhalten in verschiedenen biologischen Kontexten zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Erzeugung von PSmOrange- und GFP-exprimierenden Embryonen.
- Einbetten der Embryonen zur Analyse mittels konfokaler Mikroskopie.
- Nutzung von 488- und 561-nm-Lasern zur Bildgebung.
- Photoumwandlung des PSmOrange-Proteins zu Verfolgungszwecken.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiches Verfolgen von Zellen in Zebrafisch-Modellen mithilfe des PSmOrange-Systems.
- Nachgewiesene Fähigkeit, zelluläre Ursprünge und Verhaltensweisen sichtbar zu machen.
- Hervorhebung der Anwendbarkeit der Methode in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung.
- Vorlage eines einfachen Protokolls, dem Forscher folgen können.
Schlussfolgerungen
- Das PSmOrange-System ist ein effektives Werkzeug für das In-vivo-Zelltracking.
- Es bietet erhebliche Vorteile bei der Erforschung der Entwicklungsbiologie.
- Diese Methode kann das Verständnis komplexer biologischer Prozesse verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das photokonvertierbare Proteinsystem PSmOrange ermöglicht eine präzise in-vivo-Zellverfolgung in GFP-transgenen Zebrafischembryonen und behebt damit eine zentrale Einschränkung in der Entwicklungsbiologieforschung, bei der bestehende transgene Linien über keine kompatiblen Reporter für die Herkunftsverfolgung verfügen. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung, indem sie eine direkte Visualisierung zellulärer Herkunft und Zellschicksalentscheidungen in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht, insbesondere für Anwendungen in der Onkologie und regenerativen Medizin, die Tumorprogression, Invasion und Geweberegeneration betreffen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem sie quantitative, räumlich aufgelöste Daten zur Zellmigration und -differenzierung in intakten, lebenden Organismen bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verfolgung definierter Zellpopulationen in transgenen Hintergründen, um die zellulären Ursprünge von Geweben und Organen zu klären.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit bestehenden GFP-transgenen Linien, wodurch die Erzeugung neuer Promotoren entfällt und die Entwicklungszeit für Modelle verkürzt wird.
- Predictiver Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung von Zellschicksalentscheidungen und verbessert die Zuversicht bezüglich der Assoziationen zwischen Zielmolekül und Krankheitsmechanismus.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare räumliche und zeitliche Daten zur Migration photokonvertierter Zellen und ermöglicht einen objektiven Vergleich genetischer oder pharmakologischer Störungen.
- Operativer Wert: Nutzt eine Standard-Konfokalmikroskopie mit sequenzieller Laseranregung (488, 561, 640 nm) und erfordert keine spezielle Ausrüstung über die hinaus, die typische Bildgebungszentren bereits besitzen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit hochauflösender 3D-Bildgebung und Nachbearbeitungswerkzeugen (ImageJ Fiji, NIS-Elements) für reproduzierbare Kolokalisierungsanalysen mit GFP.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Direkt anwendbar zur Untersuchung von Tumorzellinvasion und Metastasenmodellen in Zebrafisch-Xenotransplantat- oder transgenen Krebsmodellen.
- Translationskontinuität: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung (Verfolgung der Zellherkunft) zur präklinischen Validierung durch die Überwachung von Engraftment, Migration und Integration von photokonvertierten Zellen in vivo.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Bietet visuelle, quantitative Endpunkte für Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen präklinischen Entwicklung basierend auf dem zellulären Verhalten in krankheitsrelevanten Kontexten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das PSmOrange-System ist in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Phase einzuordnen und dient als Werkzeug für die phänotypische Bildschirmanalyse und die mechanistische Validierung, indem es genetische Manipulationen mit funktionellen zellulären Messungen in lebenden Wirbeltiermodellen verknüpft.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie das Schicksals-Mapping spezifischer Zellpopulationen nach genetischen oder umweltbedingten Störungen in GFP-transgenen Embryonen ermöglicht.
- Screening: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare quantitative Ergebnisse (Ko-Lokalisationsprozente, Migrationsentfernungen), die sich für Substanz- oder genetische Suppressor/Enhancer-Screenings eignen.
- Analytik: Liefert Multikanal-Fluoreszenzdaten (GFP, orange/rot PSmOrange, fotokonvertiertes weit-rot PSmOrange), die eine exakte Ko-Lokalisationsund Partikelanalyse für eine objektive Phänotypisierung ermöglichen.
- Translationale Forschung: Vernetzt mit präklinischen Arbeiten durch die Verfolgung des Zellverhaltens in Modellen der Regeneration und Tumorprogression und trägt so zur Beurteilung der mechanistischen Validität von Zielstrukturen bei.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Plattformfunktion dar; die mRNA-Injektion ermöglicht einen schnellen Einsatz über mehrere transgene Linien hinweg, ohne neue stabile Stämme erzeugen zu müssen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung, indem direkte visuelle Belege für zelluläre Dynamiken in intakten Organismen bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren durch definierte Photokonversionsprotokolle und Laser-Einstellungen (488 nm bei 80 % Leistung, 0,5 Sekunden pro Bild; 640 nm bis zu 4,5 mW zur Detektion).
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem bereits vorhandene GFP-transgene Ressourcen genutzt werden, wodurch aufwendige neue Identifizierungen von Promotoren und die Generierung neuer Linien vermieden werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem frühzeitige funktionelle In-vivo-Daten zum Zellverhalten bereitgestellt werden, wodurch späte Fehlschläge aufgrund unvorhergesehener biologischer Komplexität reduziert werden.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in konfokaler Mikroskopie, Photokonversionstechniken und fluoreszenzspektraler Entmischung.
- Setzt den Zugang zu Laserscanning-Konfokalsystemen mit 488-, 561- und 640-nm-Lasern sowie geeigneten Filterkombinationen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Auswahl der interessierenden Bereiche (ROI), der Laserleistung, der Abtastgeschwindigkeit und der Z-Stack-Parameter zwischen verschiedenen Anwendern, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Die Anpassung an nicht-zebrafisch Teleostarten kann eine Optimierung der mRNA-Dosis und der Photokonversionseffizienz erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Effizienz der Photokonversion hängt von der Proteinausprägung und der Zugänglichkeit der Zielzellen für die Laserdurchdringung in dickeren Geweben ab.
