HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren
July 9th, 2016
Dieser Artikel beschreibt, wie virale Vektoren in die Maus frontalen Kortex zu injizieren Verhaltenstests zu testen, die GPCR heteromeren Bildung erfordern.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zu beobachten, wie sich der virusvermittelte Gentransfer auf Verhaltensphänotypen auswirkt, die eine Heterodimerisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mausmodellen erfordern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuro- und Psychopharmakologie zu beantworten. Genauer gesagt, wie g-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf molekularer Ebene miteinander interagieren.
Mit dieser Methode können wir verstehen, wie sich diese Interaktion auf das Verhalten in Modellen psychiatrischer Störungen wie Schizophrenie und Depression auswirkt. Mit dieser Methode werden wir uns speziell mit Seratonin 2a und metabotropem Glutamatrezeptor 2 befassen, von denen gezeigt wurde, dass sie am Wirkmechanismus von Medikamenten zur Behandlung von Patienten mit Schizophrenie beteiligt sind. Beginnen Sie damit, die Maus nach zugelassenen Methoden richtig zu betäuben.
Stellen Sie sicher, dass eine chirurgische Anästhesieebene erhalten wurde, indem Sie eine Zehenklemme durchführen und das Fehlen einer Reaktion feststellen. Tragen Sie dann Augengel auf, um die Augen zu schützen. Befestigen Sie die Maus am stereotaktischen Rahmen und achten Sie darauf, die Neigung des Kopfes so einzustellen, dass der Schädel gerade und flach ist.
Tragen Sie Povidon-Jod auf die freiliegende Kopfhaut auf. Machen Sie mit einem Skalpell einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels innerhalb des freiliegenden rasierten Bereichs. Befestigen Sie dann pureit-Klemmen an der Haut an der Inzisionsstelle, um sicherzustellen, dass der Schädel freiliegt.
Tragen Sie Wasserstoffperoxid auf, um das Periost aufzulösen, und legen Sie die Nähte des Schädels frei. Jetzt, da das Bregma und die Nähte sichtbar sind, stellen Sie sicher, dass Sie den stereotaktischen Rahmen anpassen, um sicherzustellen, dass der Schädel waagerecht ist. Richten Sie die Nadelspitzen der Spritzen am Bregma aus und notieren Sie die Koordinaten des Bregmas.
Um den frontalen Kortex bilateral zu injizieren, addieren Sie 1,6 mm zur aufgezeichneten rostralen kaudalen Bregmakoordinate und 2,6 mm zur aufgezeichneten medialen lateralen Bregmakoordinate. Markieren Sie die Injektionsstellen am Schädel und bohren Sie dann kleine Löcher an den Injektionsstellen. Wischen Sie mit einem Wattestäbchen-Applikator überschüssiges Blut oder Knochenfragmente ab.
Führe die Nadel an die Oberfläche des Gehirns und senke sie bis zur Tiefe der dorsalen Bauchkoordinate. Injizieren Sie dann langsam den Inhalt der Spritze, indem Sie den Kolben der Nadel drehen, um fünf Minuten lang 0,1 Mikroliter pro Minute zu verabreichen, für eine Injektion von 0,5 Mikrolitern. Lassen Sie die Spritze fünf Minuten lang an Ort und Stelle.
Nehmen Sie das Tier nach der vorgegebenen Zeit aus den Stereotaxis, schließen Sie den Schnitt und legen Sie es auf ein Wärmekissen. Verabreichen Sie die postoperative Analgesie gemäß Ihrem genehmigten Tierprotokoll. Führen Sie zwei bis drei Tage nach der stereotaktischen Injektion von Viruspartikeln Verhaltenstests durch.
Gewöhnen Sie die Mäuse mindestens vier Stunden vor Beginn des Experiments an den Raum. Beginnen Sie damit, DOI in einer 0,9-prozentigen Kochsalzlösung auf zwei Milligramm pro Kilogramm aufzulösen. Bereiten Sie einen Heimkäfig ohne Einstreu vor und stellen Sie eine Kamera mit einem Stativ so ein, dass sie sich direkt über dem Heimkäfig befindet.
Kalibrieren Sie die Kamera so, dass sich der gesamte Heimkäfig im Sichtfeld befindet. Wiegen Sie die Maus und injizieren Sie intraperitoneal die entsprechende Dosis von entweder 0,9 Prozent Kochsalzlösung oder DOI. Setzen Sie die Maus für zehn Minuten wieder in den Heimkäfig ein.
Platzieren Sie die Maus nach zehn Minuten in der Mitte des leeren Heimkäfigs und stellen Sie sicher, dass sich keine toten Winkel im Sichtfeld der Kamera befinden. Drücken Sie die Aufnahmetaste auf dem Camcorder und verlassen Sie den Raum. Stoppen Sie nach 30 Minuten die Aufnahme und setzen Sie die Maus wieder in den ursprünglichen Heimkäfig ein.
Wiederholen Sie den Verhaltenstest mit der nächsten Maus. Lassen Sie den Schiedsrichter die Videos blind für die experimentellen Bedingungen überprüfen. Nehmen Sie jedes Kopfzucken während des gesamten Videos manuell auf.
Ein Kopfzucken ist definiert als eine schnelle Kopfbewegung, die von einer Maus ausgeführt wird. Verarbeiten Sie die Daten wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Hier ist ein repräsentatives Bild der HSV-vermittelten Transgenexpression im frontalen Kortex zu sehen.
HSV mGlu2 GFP wurde in den frontalen Kortex injiziert und die GFP-Expression wurde durch Immunzytochemie nachgewiesen. Dieser Maßstabsbalken stellt 200 Mikrometer dar. Dieses Bild zeigt einen Western Blot der HSV-vermittelten Transgenexpression und Anti-mGlu2-Reaktivität im frontalen Kortex von mGlu2-Knockout-Mäusen.
Hier haben wir die Immunreaktivität von mGlu2 als Monomer gemessen. Dieses Histogramm zeigt, dass die virale vermittelte Expression von mGlu2, nicht aber von chimärem mGlu2 im frontalen Kortex von mGlu2-Knockout-Mäusen, die durch den halluzinogene Seratonin-2a-Rezeptor-Agonist DOI induzierte Kopfzuckenreaktion signifikant rettet. Die wichtigsten Schritte bei diesem Experiment sind das Timing zwischen den Virusinjektionen, die Reaktion auf das Zucken des Kopfes und der Zeitpunkt, an dem die Mäuse getötet werden.
Jede Verzögerung kann die Ergebnisse des Experiments verändern oder zu Mehrdeutigkeiten in die Daten führen. Sobald die Mausoperation gemeistert ist, dauert es etwa 30 Minuten, bis das Virus injiziert wird. Das Kopfzucken-Experiment sollte ebenfalls etwa 35 Minuten pro Maus dauern.
Es wird empfohlen, gestaffelte Operationen durchzuführen oder an mehr als einer Maus gleichzeitig zu operieren. Auf diese Weise kann man einen Zeitplan beibehalten, der es ermöglicht, die Kopfzucken-Experimente in den drei bis vier Tagen nach der Operation durchzuführen, was der Spitzenexpressionszeit des viralen Konstrukts entspricht. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Injektion von viralen Vektoren in den frontalen Cortex der Maus, um Verhaltenstests im Zusammenhang mit der heteromeren Bildung von GPCRs zu untersuchen. Der Ansatz zielt darauf ab, die molekularen Wechselwirkungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und deren Auswirkungen auf das Verhalten in psychiatrischen Modellen zu klären.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Pharmakologie
- Verhaltenswissenschaft
Hintergrund
- G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Neurotransmission.
- Das Verständnis von GPCR-Wechselwirkungen kann Einblicke in psychiatrische Störungen geben.
- Die Heterodimerisierung von GPCRs kann Verhaltensergebnisse beeinflussen.
- Diese Methode verwendet virale Vektoren für den Gentransfer in Mausmodellen.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen des virusvermittelten Gentransfers auf Verhaltensphänotypen.
- Erforschung der Interaktion zwischen Serotonin 2A und metabotropischem Glutamatrezeptor 2.
- Beantwortung von Fragen in der Neuro- und Psychopharmakologie.
Verwendete Methoden
- Ordentliche Anästhesierung von Mäusen nach zugelassenen Methoden.
- Injektion von viralen Vektoren in den frontalen Cortex.
- Verhaltenstests zur Bewertung der Auswirkungen von GPCR-Wechselwirkungen.
- Analyse von Verhaltensphänotypen im Zusammenhang mit psychiatrischen Störungen.
Hauptergebnisse
- Einblicke in die heteromere Bildung von GPCRs und deren Verhaltensauswirkungen.
- Verständnis der Rolle von Serotonin 2A und metabotropischem Glutamatrezeptor 2.
- Mögliche Verbindungen zwischen GPCR-Wechselwirkungen und psychiatrischen Erkrankungen.
- Beitrag zum Bereich der Neuropharmakologie durch experimentelle Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung von GPCR-Wechselwirkungen in vivo.
- Die Ergebnisse können therapeutische Strategien für psychiatrische Störungen beeinflussen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die Auswirkungen dieser Wechselwirkungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Dissecting the behavioral function of GPCR heteromers using HSV-mediated transgene expression in mice addresses a critical challenge in neuropsychiatric drug discovery: establishing mechanistic links between receptor complexes and disease-relevant phenotypes. This approach enables predictive confidence in target validation for psychiatric disorders by isolating the functional necessity of specific receptor interactions. The method supports risk-adjusted portfolio decisions at the interface of early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of GPCR heteromer function in vivo for mechanistic de-risking.
- Clarifies the necessity of specific receptor complexes for disease-relevant behavioral phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection for neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Establishes validated behavioral assays linked to molecular interventions for downstream screening.
- Provides quantitative behavioral outputs (head-twitch response) for assay standardization.
- Facilitates reproducible evaluation of genetic and pharmacological manipulations in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical behavioral models with human disease mechanisms via receptor complex interrogation.
- Enables continuity from molecular discovery to behavioral validation in animal models.
- Supports translational biomarker development by linking molecular interventions to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by enabling hypothesis-driven testing of receptor complex function in disease-relevant behavioral systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for GPCR heteromer involvement in psychiatric phenotypes.
- Screening: Provides a platform for quantitative behavioral readouts following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Delivers measurable endpoints (head-twitch counts) for statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to behavioral outcomes relevant to psychiatric disorders.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for interrogating other receptor complexes in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for neuropsychiatric drug programs.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping linked to molecular interventions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying the necessity of receptor complexes for disease-relevant behaviors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms for advancement in CNS pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and behavioral phenotyping in rodents.
- Demands access to viral vector production and molecular validation infrastructure (immunocytochemistry, western blotting).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of injection timing, behavioral testing, and data analysis.
- Adaptation to other receptor complexes or behavioral assays may require protocol optimization.
- Precise timing between viral delivery, behavioral assessment, and tissue collection is critical for data integrity.
