HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, zu untersuchen, wie eine virusvermittelte Genübertragung verhaltensbezogene Phänotypen beeinflusst, die eine Heterodimerisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mausmodellen erfordern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neuro- und Psychopharmakologie zu beantworten, insbesondere wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf molekularer Ebene miteinander interagieren.

Mithilfe dieser Methode können wir verstehen, wie diese Interaktion das Verhalten in Modellen psychiatrischer Erkrankungen wie Schizophrenie und Depression beeinflusst. Mit Hilfe dieser Methode werden wir gezielt den Serotonin-2a- und den metabotropen Glutamatrezeptor 2 untersuchen, von denen beide an der Wirkungsweise von Arzneimitteln beteiligt sind, die zur Behandlung von Patienten mit Schizophrenie eingesetzt werden. Beginnen Sie damit, die Maus gemäß genehmigter Methoden ordnungsgemäß zu anästhesieren.

Stellen Sie sicher, dass eine operative Anästhesietiefe erreicht wurde, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen und das Fehlen einer Reaktion feststellen. Tragen Sie dann ein ophthalmologisches Gel auf, um die Augen zu schützen. Befestigen Sie die Maus am stereotaktischen Rahmen und stellen Sie sicher, dass die Neigung des Kopfes so eingestellt ist, dass der Schädel waagerecht und eben liegt.

Tragen Sie Povidon-Iod auf die exponierte Kopfhaut auf. Führen Sie mit einem Skalpell einen sagittalen Schnitt entlang der Schädellinie im exponierten rasierten Bereich durch. Befestigen Sie anschließend Pureit-Klammern an der Haut an der Schnittstelle, um sicherzustellen, dass der Schädel weiterhin freigelegt bleibt.

Wenden Sie Wasserstoffperoxid an, um das Periost aufzulösen, und legen Sie die Schädelnähte frei. Da Bregma und die Nähte nun sichtbar sind, stellen Sie sicher, dass der stereotaktische Halter so justiert ist, dass der Schädel waagerecht liegt. Richten Sie die Nadelspitzen der Spritzen am Bregma aus und notieren Sie die Koordinaten des Bregma.

Um den frontalen Cortex beidseitig zu injizieren, addieren Sie 1,6 mm zu der aufgezeichneten rostrokaudalen Bregma-Koordinate und 2,6 mm zu der aufgezeichneten mediolateralen Bregma-Koordinate. Markieren Sie die Injektionsstellen am Schädel und bohren Sie anschließend kleine Löcher an den Injektionsstellen. Mit einem Wattestäbchen entfernen Sie überschüssiges Blut oder Knochenfragmente.

Führen Sie die Nadel an die Oberfläche des Gehirns und senken Sie sie auf die Tiefe der dorsoventralen Koordinate ab. Injizieren Sie dann langsam den Inhalt der Spritze, indem Sie den Kolben der Nadel drehen, um 0,1 Mikroliter pro Minute über einen Zeitraum von fünf Minuten zu verabreichen, was einer Gesamtinjektionsmenge von 0,5 Mikroliter entspricht. Lassen Sie die Spritze anschließend weitere fünf Minuten lang an Ort und Stelle.

Nach Ablauf der vorgesehenen Zeit das Tier von der Stereotaxie entfernen, die Inzision verschließen und auf eine Wärmematte legen. Verabreichen Sie postoperative Analgetika gemäß Ihrem genehmigten Tierversuchsprotokoll. Führen Sie Verhaltensuntersuchungen zwei bis drei Tage nach der stereotaktischen Injektion viraler Partikel durch.

Gewöhnen Sie die Mäuse mindestens vier Stunden vor Versuchsbeginn an den Raum. Lösen Sie zunächst DOI in einer 0,9-prozentigen Kochsalzlösung auf eine Konzentration von zwei Milligramm pro Kilogramm. Bereiten Sie einen Heimkäfig ohne Einstreu vor und stellen Sie mithilfe eines Stativs eine Kamera so ein, dass sie sich direkt über dem Heimkäfig befindet.

Kalibrieren Sie die Kamera, sodass der gesamte Heimkäfig im Sichtfeld liegt. Wiegen Sie die Maus und injizieren Sie intraperitoneal die entsprechende Dosis entweder 0,9-prozentiger Kochsalzlösung oder DOI. Stellen Sie die Maus für zehn Minuten zurück in den Heimkäfig.

Nach zehn Minuten das Tier in die Mitte des leeren Heimkäfigs setzen und sicherstellen, dass im Sichtfeld der Kamera keine toten Winkel vorhanden sind. Die Aufnahme am Camcorder starten und den Raum verlassen. Nach 30 Minuten die Aufnahme beenden und die Maus in den ursprünglichen Heimkäfig zurückbringen.

Wiederholen Sie den Verhaltensversuch am nächsten Maus. Lassen Sie die Videos von einem Beobachter überprüfen, der über die experimentellen Bedingungen nicht informiert ist. Notieren Sie manuell jeden Kopfnick während des gesamten Videos.

Ein Kopfschütteln ist definiert als eine schnelle Schüttelbewegung des Kopfes, die von einer Maus ausgeführt wird. Verarbeiten Sie die Daten wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Hier ist ein repräsentatives Bild der HSV-vermittelten Transgenexpression im frontalen Kortex gezeigt.

HSV mGlu2 GFP wurde in den frontalen Cortex injiziert und die GFP-Expression wurde mittels Immunzytochemie sichtbar gemacht. Dieser Maßstabsbalken entspricht 200 Mikrometern. Dieses Bild zeigt eine Westernblot-Analyse der durch HSV vermittelten Transgenexpression und der Anti-mGlu2-Reaktivität im frontalen Cortex von mGlu2-Knockout-Mäusen.

Hier wurde die Immunreaktivität von mGlu2 als Monomer gemessen. Dieses Histogramm zeigt, dass die virusvermittelte Expression von mGlu2, jedoch nicht die von chimärem mGlu2 im frontalen Kortex von mGlu2-Knockout-Mäusen, die durch den hallucinogenen Serotonin-2a-Rezeptoragonisten DOI ausgelöste Kopfbewegungsreaktion signifikant wiederherstellt. Die kritischsten Schritte bei diesem Experiment sind der Zeitpunkt der viralen Injektionen, der Zeitpunkt der Kopfbewegungsreaktion und der Zeitpunkt, zu dem die Mäuse getötet werden.

Jede Verzögerung kann die Ergebnisse des Experiments verändern oder Unsicherheiten in die Daten einführen. Nach Beherrschung der Maus-Operation dauert die Virusinjektion etwa 30 Minuten. Das Kopfschüttel-Experiment sollte ebenfalls etwa 35 Minuten pro Maus in Anspruch nehmen.

Es wird empfohlen, die Operationen versetzt durchzuführen oder mehrere Mäuse gleichzeitig zu operieren. Auf diese Weise kann ein Zeitplan eingehalten werden, der es ermöglicht, die Kopfnickversuche drei bis vier Tage nach der Operation durchzuführen, was die Zeit des maximalen Expressionsniveaus des viralen Konstrukts darstellt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.