Name: HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie virale Gentransfer-Methoden das Verhalten von Mäusen beeinflussen, die GPCR-Heterodimerisierung erfordern. Diese Technik untersucht Rezeptorinteraktionen bei psychiatrischen Erkrankungen.

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NIH R01MH084894 beteiligte sich an der Finanzierung dieser Studie. Wir möchten Drs danken. Yasmin Hurd und Scott Russo am Mount Sinai School of Medicine für die Spende von Mäusen und die Verwendung ihrer Operation und Verhalten Einrichtungen während der Dreharbeiten zu dieser Arbeit.

HINWEIS: Alle Verfahren für die Tierzucht und Sorgen wurden nach dem Committee (IACUC) Regulierung der Icahn School of Medicine am Berg Sinai Institutional Animal Care und Verwenden durchgeführt. Achten Sie darauf, sterile Handschuhe während des gesamten Verfahrens zu verwenden. 1. Drogen und Virus Vorbereitung <ol><li> Wirkstoffherstellungs <ol><li> Bereiten 15,0 ml Ketamin / Xylazin-Narkose von 1,35 ml von 100 mg / ml Ketamin gelöst und 0,75 ml 20 mg / ml Xylazin in 12,9 ml 0,9% Kochsalzlösung. Gründlich mischen Lösung. </li></ol></li><li> Viruspräparation <ol><li> Klonen Sie die mGlu2 und mGlu2ΔTM4N - Konstrukte in einem bicistronischen Herpes - simplex - Virus (HSV) Vektor nach Standardprotokollen zuvor 6 beschrieben. Paket , um die viralen Partikel wie zuvor beschrieben 6,13,14. Substitution von Resten Ala-677 4,40, Ala-681 4,44 und Ala685 4,48 in mGlu2 für Ser686 4.40, PhE690 4,44 und Gly-694 4,48 in mGlu3 (HA-mGlu2ΔTM4N) wurden bisher 6 beschrieben worden ist . HINWEIS: Es wurde zuvor gezeigt , dass das chimäre Konstrukt HA-mGlu2ΔTM4N an der Plasmamembran mit intaktem G - Protein-abhängige Signalgebung 6 exprimiert wird. </li><li> Speichern von viralen Vektoren in -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch ist. Thaw viralen Vektor auf Eis, und dann aliquotiert in 10 ul Aliquots. Für den chirurgischen Eingriff, halten auf dem Eis. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Chirurgie Vorbereitung <ol><li> Wiegen Sie die Maus und injizieren Maus mit geeigneten Dosis von Ketamin / Xylazin-Cocktail (Details siehe 1.1.1). </li><li> Überprüfen Sie die Maus, um zu sehen, wenn sie richtig betäubt, quetschen Fuß und Schwanz für Schmerzreaktion, wenn nicht in der Lage, eine Antwort zu entlocken, wird die Maus richtig betäubt. </li><li> Shave Mauskopf von der Basis des Schädels an der Spitze der Nase mit Klipper. Bewerben ophthalmische Gel auf die Maus afterward Blindheit der Maus zu verhindern. </li><li> Legen Sie jede Spritze auf den Stereotaxierahmen. kippen dann senkrecht Abschnitt jedes Arms des stereotaktischen Rahmen, so dass sie 10 Grad weg von der normal sind. Sicherzustellen, dass die Arme geneigt ist, so daß die Nadeln einander zugewandt sind. </li><li> Reinigen jede Spritze durch die Nadel mit 70% Ethanol gefüllt wird. Füllen die Nadel mindestens drei Mal, um sicherzustellen, dass die Spritze sauber ist. </li><li> Sobald die Nadel gereinigt wurde, spülen Sie die Nadel durch die Nadel mit doppelt destilliertem H 2 O Füllung Sobald gespült, füllen jede Nadel mit 1,3 &amp; mgr; l doppelt destilliertem H 2 O. Drehen Sie den Kolben der Spritze zu lösen 0,3 ul doppelt destilliertem H 2 O. Wenn Wasser Perlen an der Spitze der Nadel vorsichtig abwischen, Wasser entfernt. Wenn nichts aus der Spritze kommt, drücken Sie den Kolben vollständig nach unten und dann Reinigung der Spritze wiederholen. </li><li> Nach dem Befüllen mit Wasser, dann die Spritze nach oben ziehen Befüllen der Spritze mit0,5 l Luft. </li><li> Sobald die Luft und das Wasser in der Spritze sind, sorgfältig die Spritze mit 1,3 &amp; mgr; l der Viruslösung füllen. An dieser Stelle dafür sorgen, dass das gesamte Volumen in der Spritze 2,8 &amp; mgr; l ist. Wieder drehen Sie die Spitze der Spritze 0,3 ul Virus freizusetzen. Wenn Flüssigkeit Perlen an der Spitze der Nadel vorsichtig abwischen, Flüssigkeit entfernt. Wenn nichts aus der Spritze kommt, drücken Sie den Kolben vollständig nach unten und dann Reinigung der Spritze wiederholen. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Bringen Sie die Maus an den Stereotaxierahmen, um sicherzustellen, das Stereotaxierahmen so einzustellen, dass der Schädel Ebene und flach ist. Bewerben povodine-Jod auf die exponierte Kopfhaut. Mit einem Skalpell, machen Sie einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels innerhalb des belichteten rasierten Bereich. Dann fügen Sie die Bürette Klemmen an die Haut an der Einschnittstelle, um sicherzustellen, dass der Schädel ausgesetzt bleibt. </li><li> Verwenden Sie H 2 O 2 , um die Knochenhaut herauslösen , um die Nähte des ExposesSchädel. Nun, da die Bregma und Nähte sichtbar sind, sollten Sie die Stereotaxierahmen anzupassen, um sicherzustellen, dass der Schädel Ebene ist. </li><li> Richten Sie die Nadelspitzen der Spritzen mit dem Bregma und notieren Sie die Koordinaten des Bregma. Berechnen Sie die Koordinaten des in denen die Nadeln werden eingefügt. <ol><li> Für die Rostra-Cauldal (RC) Ebene, fügen Sie 1,6 mm auf die aufgezeichneten RC Bregmas Koordinaten (+1,6 von Bregma). Für die Dorsal-Ventral (DV) -Ebene, subtrahieren 2,4 mm von den DV Bregmas Koordinaten aufgezeichnet (-2,4 von Bregma). </li><li> Schließlich wird für die Medial Lateral (ML) Ebene, fügen Sie 2,6 mm auf die aufgezeichneten ML Bregmas Koordinaten (+2,6 von Bregma). Für alle Koordinaten, müssen Sie beide linken und rechten Koordinaten aufzeichnen, da dies eine bilaterale Injektion ist. </li></ol></li><li> Bringen Sie die Nadeln auf die gewünschten Koordinaten. Markieren Sie die Orte, wo die Nadeln werden eingefügt werden und mit einem Bohrer, bohren Sie die markierten Bereiche. </li><li> Mit einem Wattestäbchen wipe überschüssiges Blut oder Knochenfragment entfernt. </li><li> Bringen die Nadeln an den Schädel, wo die Spitzen der Nadeln die Oberfläche des Gehirns berühren. Dann senken Sie die Nadeln auf die gewünschten Koordinaten sie langsam zu senken. </li><li> Sobald die Nadeln an den gewünschten Koordinaten sind, langsam um den Inhalt der Spritze zu injizieren, indem der Kolben der Nadel 0,1 &amp; mgr; l pro Minute über einen Zeitraum von 5 min (insgesamt 0,5 &amp; mgr; l) zu drehen. </li><li> Sobald die Injektion vorgenommen wurde verlassen die Spritze in der Rinde für weitere 5 min. </li></ol></li><li> Closing Up / Pflege <ol><li> Entfernen Sie die Nadeln von der Maus Cortex stetig und langsam. Dann entfernen Sie die Maus vom Stereotaxierahmen. </li><li> Bewerben Cyanacrylat (dermale Kleber) an die Basishautlappen aus dem Einschnitt und dann mit einer Pinzette die Hautlappen greifen und legen Sie sie zusammen. </li><li> Lassen Sie den Cyanacrylat zu trocknen. Platzieren Sie die Maus im Käfig über ein Heizkissen (Heizkissen, wenn der surg optionalische Suite ist unter RT von 37 ° C gehalten - ansonsten nicht notwendig). Achten Sie darauf, mit der Maus auf einem Papiertuch zu setzen, um sicherzustellen, dass Bettwäsche nicht auf Operationsstelle haftet. </li><li> In Abhängigkeit von der Länge des chirurgischen Verfahrens, sicherzustellen, dass die Mäuse innerhalb von 30 aus der Narkose ist - 60 min nach dem Verfahren. Nach der Operation wird das Tier in seinem eigenen Käfig gesetzt und überwacht, bis er bewusst wird, bevor sie ihre Zimmer zurückkehren zu erholen. Keine Analgetika sind postoperativ eingesetzt, weil sie die Ergebnisse unserer Experimente verändern können, die von einigen der Gehirn biochemische Wege zu modifizieren. Allerdings Tiere überwacht werden, bis sie aus der Narkose am Tag der Operation erholen und täglich nach der Operation auf Anzeichen einer Infektion und Bewertung von Schmerz / Not. </li></ol></li></ol> 3. Leiter Zuckungsreaktion Experiment <ol><li> Konfiguration <ol><li> Führen Sie alle Verhaltenstests von 10.00 Uhr bis 14.00 Uhr, 2 - 3 Tage nach stereotaCTIC Injektion viraler Partikel. </li><li> Auflösen von (±) -1- (2,5-Dimethoxy-4-iodphenyl) -2-aminopropan-hydrochlorid (DOI) in eine 0,9% ige Kochsalzlösung auf 2,0 mg / kg. Auch bereiten eine 0,9% ige Kochsalzlösung. </li><li> Bereiten Sie einen Käfig (28 x 18 x 15 cm) ohne Betten und ein Tri-Pod verwenden, stellen Sie eine Kamera, so dass der Blick auf die Videokamera direkt über dem Käfig ist. </li><li> Habituate die Mäuse in den Raum für mindestens 4 Stunden vor dem Beginn des Experiments. </li><li> Stellen Sie einen Camcorder, um den Kopf zucken aufzunehmen. </li></ol></li><li> Experiment <ol><li> Positionieren Sie die Kamera so, dass sie direkt über einen eigenen Käfig ist. Kalibrieren Sie die Kamera so, dass das gesamte Heimkäfig im Blickfeld ist. </li><li> Wiegen Maus und Maus intraperitoneal injizieren mit geeigneten Dosis von entweder 0,9% Kochsalzlösung oder DOI (0,01 ml / g). HINWEIS: Wenn eine Maus 25 Gramm wiegt, zu verwalten Dosis bis zu einem Gesamtvolumen von 0,25 ml. </li><li> Platzieren Sie jede Maus zurück in ihre Heimat Käfig for 10 min. Nach 10 min Platz Maus in die Mitte des leeren Käfig nach Hause, und bestätigen Sie, dass es in dem Sichtfeld der Kamera keine blinden Flecken sind. Drücken Sie Aufzeichnung am Camcorder. Verlasse den Raum. HINWEIS: Mausbewegungen und verschiedene darin Verhaltensreaktionen (... Kopf zucken, Ohr kratzen, etc. verweisen auf zusätzliche Datentabelle 1 von Gonzalez-Maeso et al 2007 für die vollständige Liste der Verhaltensreaktionen induziert durch DOI) 3, wird aufgezeichnet 30 Minuten. Daher ist es wichtig, keine toten Winkel in dem Sichtfeld aufgezeichnet sind. </li><li> Nach 30 Minuten stoppen Sie den Camcorder und Platz Maus wieder in Original-Käfig Aufnahme. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Maus. </li></ol></li><li> Überprüfung <ol><li> Lassen Sie jeden Schiedsrichter Überprüfung die Bänder an die experimentellen Bedingungen der Maus blind machen (dh., Drogen während der Kopf verwendet zucken Experiment oder Virus während der intrakranielle Injektion verwendet wird )). Aufzeichnung manuell jeder Kopf zucken throughout das Video. HINWEIS: Kopfzucken als schnelle Schütteln Kopfbewegung durch eine Maus (ergänzende Video) durchgeführt definiert. </li><li> Für jede Maus, im Durchschnitt die endgültige HTR Antwort von den drei Summen der blinden Schiedsrichter. Dann Gruppe diese Werte durch experimentellen Bedingungen und Durchführung von statistischen Analyse (dh., T-Test oder ANOVA). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Zusammen mit früheren Ergebnissen in mGlu2-KO - Mäusen 5 sind die Ergebnisse mit und mGlu2 mGlu2 / mGlu3 chimären Konstrukten , die nicht bilden schlagen die 5-HT 2A Rezeptor - Komplex -mGlu2 in kultivierten Zellen, die die 5-HT 2A -mGlu2 heteromeren Rezeptor - Komplex in Maus frontalen Kortex ist erforderlich Kopfzucken Verhalten von LSD-ähnlichen halluzinogene 5-HT 2A -Rezeptor - Agonisten zu induzieren. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es nicht zu einem subzel...

Halluzinogene wie LSD, Psilocybin und Meskalin zu erheblichen Veränderungen im menschlichen Bewusstsein, Kognition und Emotion 7-9. Die Inaktivierung von Serotonin 5-HT 2A - Rezeptor - Signal entweder durch genetische oder pharmakologische Ansätze verursacht deutlich Verhaltensreaktionen auf Halluzinogene in beiden Tiermodellen 3,10 und Menschen 11 gedämpft. Obwohl Halluzinogene anderen Rezeptor - Subtypen binden , 8, die 5-HT 2A -Rezeptor ist als die für die einzigartige Verhaltensaktivität dieser Chemikalien betrachtet. Gruppe II metabotropen Glutamatrezeptoren (dh., MGlu2 und mGlu3) haben das Ziel beträchtlicher Aufmerksamkeit in Bezug auf den molekularen Mechanismus von Halluzinogenen und deren integrale Rolle Psychose zugrunde liegenden 12. Zuvor wurde gezeigt, dass Mäuse ohne Expression mGlu2 Protein (mGlu2-KO-Mäuse) unempfindlich sind, auf die zelluläre und Verhaltenswirkungen von hallucinogens 5. Es wurde auch vorgeschlagen, dass der 5-HT 2A -Rezeptoren und die mGlu2 einen bestimmten heteromeren Komplex bilden , durch den Serotonin und Glutamat - Liganden um das Muster der G - Protein - Kopplung in lebenden Zellen 1,2 modulieren. Strukturell Trans (TM) Domänen 4 und 5 der mGlu2 eine fundamentale Rolle in heteromeren Bildung spielen mit dem 5-HT 2A -Rezeptor - 5. Zusätzlich zeigten weitere Untersuchungen , daß drei Reste am intrazellulären Ende TM4 von mGlu2 angeordnet sind notwendig , um die 5-HT 2A -Rezeptor -mGlu2 Hetero in lebenden Zellen 6 zu bilden. Auf Basis dieser Erkenntnisse in heterologen Expressionssystemen beobachtet, beschreiben wir die Verwendung von HSV-vermittelte Expression von Wildtyp mGlu2 und mGlu2 / mGlu3 chimären Konstrukten im frontalen Kortex von mGlu2-KO - Mäuse , ob heteromeren Bildung zu testen , zwischen 5-HT 2A und mGlu2 ist notwendig, dass dieKopf-Twitch - Verhalten von halluzinogenen 5-HT 2A -Rezeptor - Agonisten induziert.

<table><tbody><tr><td>mGlu2 bicitronic Herpes-simplex-Virus (HSV) Vektor&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 und mGlu2DTM4N wurden unter der Kontrolle des CMV-Promotors in den bicistronischen HSV-GFP-Virusvektor p1005+ HSV, der GFP exprimiert, subkloniert. Die Viruspartikel wurden von der Viral Core Facility am McGovern Institute (MIT) produziert. Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an die Direktorin, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>mGlu2&Delta; TM4N bicitronisches Herpes-simplex-Virus (HSV) Vektor&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 und mGlu2DTM4N wurden unter der Kontrolle des CMV-Promotors in den bicistronischen HSV-GFP-Virusvektor p1005+ HSV, der GFP exprimiert, subkloniert. Die Viruspartikel wurden von der Viral Core Facility am McGovern Institute (MIT) produziert. Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an die Direktorin, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector&nbsp;</td><td>MIT Core</td><td></td><td>mGlu2 und mGlu2DTM4N wurden unter der Kontrolle des CMV-Promotors in den bicistronischen HSV-GFP-Virusvektor p1005+ HSV, der GFP exprimiert, subkloniert. Die Viruspartikel wurden von der Viral Core Facility am McGovern Institute (MIT) produziert. Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an die Direktorin, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)</td></tr><tr><td>Xylazin&nbsp;</td><td>Lloyd List</td><td>Nr. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC-Code(s): 61311-481-10</td><td>1,35 ml Ketamin (100 mg/ml) + 0,75 ml Xylazin (20 mg/ml) werden in 12,0 ml 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt</td></tr><tr><td>Ketamin&nbsp;</td><td>Vedco</td><td>KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC-Code(s): 50989-161-06</td><td>1,35 ml Ketamin (100 mg/ml) + 0,75 ml Xylazin (20 mg/ml) werden in 12,0 ml 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt</td></tr><tr><td>Ophthalmisches Gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0550805</td><td></td></tr><tr><td>Burret-Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9268369</td><td></td></tr><tr><td>Feder chirurgische Klinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9032736</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoff Peroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815203</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton&trade; Abnehmbare Nadeln mit kleiner Nabe (33 Ga)</td><td>Fisher</td><td>Scientific 14816206</td><td></td></tr><tr><td>Akku-Mikrobohrschrauber</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9089241</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond Dermal Adhesive</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0690470</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropanhydrochlorid (DOI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42203-78-1</td> gelöst <td>in 0,9%iger Kochsalzlösung bis zu einer Konzentration von 2,0 mg/kg</td></tr></tbody></table>

hsv-mediated transgene expression von chimären konstrukten behavioral funktion von gpcr heteromeren bei mäusen zu studieren

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

Der heteromere Rezeptorkomplex zwischen 5-HT2A und mGlu2 wurde mit einigen der Verhaltensphänotypen in Mausmodellen der Psychose1,2 in Verbindung gebracht. Folglich stellt die Untersuchung struktureller Details der Interaktion zwischen 5-HT2A und mGlu2, die schizophreniebedingte Verhaltensweisen beeinflussen, ein leistungsfähiges translationales Werkzeug dar. Wie bereits gezeigt, wird die Kopf-Zuckungs-Reaktion (HTR) bei Mäusen durch halluzinogene Drogen hervorgerufen und diese Verhaltensreaktion fehlt bei 5-HT2A Knockout (KO)-Mäusen3,4. Darüber hinaus konnte durch die bedingte Expression des 5-HT2A-Rezeptors nur im Kortex gezeigt werden, dass 5-HT 2A-Rezeptor-abhängige Signalwege auf kortikalen Pyramidenneuronen ausreichen, um als Reaktion auf halluzinogene Drogen ein Kopfzucken hervorzucken 3. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die durch die Halluzinogene DOI und Lysergsäurediethylamid (LSD) induzierte Kopfzucken-Verhaltensreaktion bei mGlu2-KO-Mäusen signifikant verringert ist5. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mGlu2 zumindest teilweise notwendig für die 5-HT 2A-Rezeptor-abhängigen psychoseähnlichen Verhaltenseffekte ist, die durch LSD-ähnliche Drogen induziert werden. Dies liefert jedoch keinen Beweis dafür, ob der 5-HT 2A-mGlu2-Rezeptorkomplex für diesen Verhaltensphänotyp notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurden Herpes-simplex-Virus (HSV)-Konstrukte zur Expression von mGlu2 oder mGlu2ΔTM4N (mGlu2/mGlu3-chimäres Konstrukt, das den 5-HT 2A-mGlu2-Rezeptorkomplex nicht bildet) im frontalen Kortex von mGlu2-KO-Mäusen verwendet, um zu untersuchen, ob dieser GPCR-heteromere Komplex für die Verhaltenseffekte benötigt wird, die durch LSD-ähnliche Drogen induziert werden 6.

Vorherige Ergebnisse zeigen , dass die Kopf zucken murine Verhaltensreaktion zuverlässig und robust durch Halluzinogene hervorgerufen, und es fehlt die in 5-HT 2A -KO Mäuse 3. Darüber hinaus hat es sich gezeigt , dass der Kopf-Zuckungsreaktion durch die halluzinogene 5-HT 2A -Agonisten DOI und LSD ausgelöst deutlich in mGlu2-KO - Mäusen 5 verringert wurde. Obwohl jedoch frühere Ergebnisse überzeugend zeigen , dass 5-HT 2A und mGlu2 w...

Dieser Artikel beschreibt, wie virale Vektoren in die Maus frontalen Kortex zu injizieren Verhaltenstests zu testen, die GPCR heteromeren Bildung erfordern.

HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, zu untersuchen, wie eine virusvermittelte Genübertragung verhaltensbezogene Phänotypen beeinflusst, die eine Heterodimerisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mausmodellen erfordern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neuro- und Psychopharmakologie zu beantworten, insbesondere wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf molekularer Ebene miteinander interagieren.Mithilfe dieser Methode können wir verstehen, wie diese Interaktion das Verhalten in Modellen psychiatrischer Erkrankungen wie Schizophrenie und Depression beeinflusst. Mit Hilfe dieser Methode werden wir gezielt den Serotonin-2a- und den metabotropen Glutamatrezeptor 2 untersuchen, von denen beide an der Wirkungsweise von Arzneimitteln beteiligt sind, die zur Behandlung von Patienten mit Schizophrenie eingesetzt werden. Beginnen Sie damit, die Maus gemäß genehmigter Methoden ordnungsgemäß zu anästhesieren.Stellen Sie sicher, dass eine operative Anästhesietiefe erreicht wurde, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen und das Fehlen einer Reaktion feststellen. Tragen Sie dann ein ophthalmologisches Gel auf, um die Augen zu schützen. Befestigen Sie die Maus am stereotaktischen Rahmen und stellen Sie sicher, dass die Neigung des Kopfes so eingestellt ist, dass der Schädel waagerecht und eben liegt. Tragen Sie Povidon-Iod auf die exponierte Kopfhaut auf. Führen Sie mit einem Skalpell einen sagittalen Schnitt entlang der Schädellinie im exponierten rasierten Bereich durch. Befestigen Sie anschließend Pureit-Klammern an der Haut an der Schnittstelle, um sicherzustellen, dass der Schädel weiterhin freigelegt bleibt.Wenden Sie Wasserstoffperoxid an, um das Periost aufzulösen, und legen Sie die Schädelnähte frei. Da Bregma und die Nähte nun sichtbar sind, stellen Sie sicher, dass der stereotaktische Halter so justiert ist, dass der Schädel waagerecht liegt. Richten Sie die Nadelspitzen der Spritzen am Bregma aus und notieren Sie die Koordinaten des Bregma.Um den frontalen Cortex beidseitig zu injizieren, addieren Sie 1,6 mm zu der aufgezeichneten rostrokaudalen Bregma-Koordinate und 2,6 mm zu der aufgezeichneten mediolateralen Bregma-Koordinate. Markieren Sie die Injektionsstellen am Schädel und bohren Sie anschließend kleine Löcher an den Injektionsstellen. Mit einem Wattestäbchen entfernen Sie überschüssiges Blut oder Knochenfragmente.Führen Sie die Nadel an die Oberfläche des Gehirns und senken Sie sie auf die Tiefe der dorsoventralen Koordinate ab. Injizieren Sie dann langsam den Inhalt der Spritze, indem Sie den Kolben der Nadel drehen, um 0,1 Mikroliter pro Minute über einen Zeitraum von fünf Minuten zu verabreichen, was einer Gesamtinjektionsmenge von 0,5 Mikroliter entspricht. Lassen Sie die Spritze anschließend weitere fünf Minuten lang an Ort und Stelle.Nach Ablauf der vorgesehenen Zeit das Tier von der Stereotaxie entfernen, die Inzision verschließen und auf eine Wärmematte legen. Verabreichen Sie postoperative Analgetika gemäß Ihrem genehmigten Tierversuchsprotokoll. Führen Sie Verhaltensuntersuchungen zwei bis drei Tage nach der stereotaktischen Injektion viraler Partikel durch.Gewöhnen Sie die Mäuse mindestens vier Stunden vor Versuchsbeginn an den Raum. Lösen Sie zunächst DOI in einer 0,9-prozentigen Kochsalzlösung auf eine Konzentration von zwei Milligramm pro Kilogramm. Bereiten Sie einen Heimkäfig ohne Einstreu vor und stellen Sie mithilfe eines Stativs eine Kamera so ein, dass sie sich direkt über dem Heimkäfig befindet.Kalibrieren Sie die Kamera, sodass der gesamte Heimkäfig im Sichtfeld liegt. Wiegen Sie die Maus und injizieren Sie intraperitoneal die entsprechende Dosis entweder 0,9-prozentiger Kochsalzlösung oder DOI. Stellen Sie die Maus für zehn Minuten zurück in den Heimkäfig.Nach zehn Minuten das Tier in die Mitte des leeren Heimkäfigs setzen und sicherstellen, dass im Sichtfeld der Kamera keine toten Winkel vorhanden sind. Die Aufnahme am Camcorder starten und den Raum verlassen. Nach 30 Minuten die Aufnahme beenden und die Maus in den ursprünglichen Heimkäfig zurückbringen.Wiederholen Sie den Verhaltensversuch am nächsten Maus. Lassen Sie die Videos von einem Beobachter überprüfen, der über die experimentellen Bedingungen nicht informiert ist. Notieren Sie manuell jeden Kopfnick während des gesamten Videos.Ein Kopfschütteln ist definiert als eine schnelle Schüttelbewegung des Kopfes, die von einer Maus ausgeführt wird. Verarbeiten Sie die Daten wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Hier ist ein repräsentatives Bild der HSV-vermittelten Transgenexpression im frontalen Kortex gezeigt.HSV mGlu2 GFP wurde in den frontalen Cortex injiziert und die GFP-Expression wurde mittels Immunzytochemie sichtbar gemacht. Dieser Maßstabsbalken entspricht 200 Mikrometern. Dieses Bild zeigt eine Westernblot-Analyse der durch HSV vermittelten Transgenexpression und der Anti-mGlu2-Reaktivität im frontalen Cortex von mGlu2-Knockout-Mäusen.Hier wurde die Immunreaktivität von mGlu2 als Monomer gemessen. Dieses Histogramm zeigt, dass die virusvermittelte Expression von mGlu2, jedoch nicht die von chimärem mGlu2 im frontalen Kortex von mGlu2-Knockout-Mäusen, die durch den hallucinogenen Serotonin-2a-Rezeptoragonisten DOI ausgelöste Kopfbewegungsreaktion signifikant wiederherstellt. Die kritischsten Schritte bei diesem Experiment sind der Zeitpunkt der viralen Injektionen, der Zeitpunkt der Kopfbewegungsreaktion und der Zeitpunkt, zu dem die Mäuse getötet werden.Jede Verzögerung kann die Ergebnisse des Experiments verändern oder Unsicherheiten in die Daten einführen. Nach Beherrschung der Maus-Operation dauert die Virusinjektion etwa 30 Minuten. Das Kopfschüttel-Experiment sollte ebenfalls etwa 35 Minuten pro Maus in Anspruch nehmen.Es wird empfohlen, die Operationen versetzt durchzuführen oder mehrere Mäuse gleichzeitig zu operieren. Auf diese Weise kann ein Zeitplan eingehalten werden, der es ermöglicht, die Kopfnickversuche drei bis vier Tage nach der Operation durchzuführen, was die Zeit des maximalen Expressionsniveaus des viralen Konstrukts darstellt. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung...

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Das enterische Nervensystem wird von Neuralleistenzellen gebildet, die sich vermehren, wandern und den Darm besiedeln. Neuralleistenzellen differenzieren sich in Neuronen mit Markern, die spezifisch für ihren Neurotransmitter-Phänotyp sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zum Präparieren, Fixieren und Immunfärben des embryonalen Magen-Darm-Trakts der Maus, um die Expression von Neurotransmittern des enterischen Nervensystems sichtbar zu machen.

Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Das aktuelle Protokoll kombiniert, die einzelne Zelle menschlichen TCR Alpha- und Beta-Kette Sequenzierung mit gepaart gestrafft Generation kompatibel mit in Vitro und in Vivo TCR Ausdruck retroviralen Vektoren.

Optimierte Einzelzelle TCR Isolation und Generierung von retroviralen Vektoren für In-Vitro und In Vivo Ausdruck menschlichen TCRs

Intraspinal Injektion von Rekombinase abhängigen recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) kann verwendet werden, um jeden genetisch gekennzeichneten Zelltyp im Rückenmark zu manipulieren. Hier beschreiben wir, wie Neuronen im Hinterhorn des Rückenmarks lumbale transduzieren. Diese Technik ermöglicht funktionale Verhör des Subtyps manipulierten Neuron.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Erfahren Sie, wie virale Gentransfer-Methoden das Verhalten von Mäusen beeinflussen, die GPCR-Heterodimerisierung erfordern. Diese Technik untersucht Rezeptorinteraktionen bei psychiatrischen Erkrankungen.

HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren

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