Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gesunde Langzeitkulturen von primären Hippocampus-Neuronen der Maus mit extrem niedriger Dichte zu etablieren, um die immunzytochemische Markierung und die Untersuchung der autonomen Mechanismen neuronaler Zellen zu erleichtern. Diese Studie kann dazu beitragen, einige Schlüsselfragen im Bereich der neurowissenschaftlichen Forschung zu verstehen, wie z. B. die Studien über die Spezifität von Proteinen in der Neuromorphologie der Entwicklungsfunktion. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Neuronen ermöglicht, mit extrem geringer Dichte auf einem Deckglas zu wachsen, ohne die Unterstützung einer glialen Feeder-Schicht.

Das Verfahren wird von Mariel Piechowicz, einer Studentin aus meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zwei 24-Well-Platten mit hoher und zwei 24-Well-Platten mit niedriger Dichte vor. Ätzen Sie mit einer 28-Gauge-Nadel den Boden von 24-Well-Platten, so dass die verschobenen Kunststoffe als Stütze für die Deckgläser dienen, auf denen Neuronen mit geringer Dichte wachsen.

Übertragen Sie die sterilen Glasabdeckungsfolien in die beiden 24-Well-Platten, die für Kulturen mit niedriger Dichte vorgesehen sind. Alle vier Platten werden mit 300 Mikrolitern Poly-D-Lysin pro Milliliter, verdünnt in Boratpuffer, bestreicht und in den Inkubator zurückgestellt, um sie über Nacht zu beschichten. Bereiten Sie vor der Gewebeentnahme zwei 10 Zentimeter große Petrischalen vor, die mit eiskaltem, sterilem HBSS gefüllt sind.

Halten Sie den Embryo unter dem Mikroskop mit der Pinzette am Hals und machen Sie den ersten Schnitt direkt an der Mittellinie, unterhalb des Kleinhirns. Machen Sie anschließend einen Schnitt auf der linken Seite der Schädelbasis. Machen Sie als Nächstes einen weiteren Schnitt auf der rechten Seite der Schädelbasis.

Lassen Sie einen kleinen Teil des Schädelknochens und des Hautgewebes am rostralen Ende ungeschnitten, damit das gesamte Gehirn für die Entnahme leicht zur Seite geklappt werden kann. Übertragen Sie nun das Gehirn in die HBSS-Lösung. Untersuchen Sie das Gehirn, um sicherzustellen, dass es intakt ist und keine grob abgeschnittenen Regionen aufweist.

Wiederholen Sie dann die Prozeduren, um den Rest des Embryonengehirns in einer neuen Petrischale zu sammeln, die 20 Milliliter kalten HBSS-Puffer enthält. Positionieren Sie jedes Gehirn mit der Bauchseite nach oben. Während Sie das Gehirn mit einer Pinzette am kaudalen Ende festhalten, machen Sie mit einer scharfen Pinzette einen diagonalen Schnitt zwischen dem mittleren rostralen Punkt und der kaudalen Schläfenregion.

Wiederholen Sie dies für die andere Hemisphäre. Trennen Sie anschließend die beiden Hemisphären mit intaktem Hippocampus vom Rest des Stammgewebes des Gehirns. Wiederholen Sie die Verfahren für alle Gehirne und legen Sie alle präparierten Hemisphären zusammen.

Entfernen Sie dann die Hirnhäute mit zwei Pinzetten. Identifizieren Sie den sich entwickelnden Hippocampus als eine gekrümmte Struktur, die im Temporallappen gefaltet ist, und trennen Sie ihn von den angrenzenden kortikalen Geweben. Sammeln und bündeln Sie alle Hippocampus-Gewebe.

Bei diesem Verfahren werden alle präparierten Hippocampus in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen in die enzymatische Aufschlusslösung überführt. Legen Sie dann das Röhrchen in ein Wasserbad und inkubieren Sie es 25 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach 25 Minuten vorsichtig die Enzymlösung.

Füge dann fünf Milliliter warmes Waschmittel hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter zu bringen. Waschen Sie das Tuch vorsichtig, indem Sie die Tube fünfmal langsam umdrehen. Entfernen Sie das Waschmedium und fügen Sie erneut 10 Milliliter Waschmittel hinzu, für eine weitere Wäsche.

Danach entfernst du das Waschmedium und gibst wieder drei Milliliter frisches, warmes Waschmedium hinzu. Schütteln Sie das Röhrchen 15 Mal rigoros mit der Hand, um die verdauten Neuronen aus dem Gewebe zu entfernen. Das Medium sollte trüb werden, sobald die Zellen vom Gewebe in das Waschmedium getrennt werden.

Sammeln Sie dann die Zellsuspension in einem neuen konischen 15-Milliliter-Röhrchen, während Sie das restliche Gewebe im Röhrchen belassen. Geben Sie danach weitere zwei Milliliter Waschmittel in das Gewebe und trennen Sie das restliche Gewebe vorsichtig, indem Sie es 15 Mal mit einer Plastikpipette verreiben. Lassen Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang ruhen, bevor Sie sie in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen geben, das die gesammelten Shake-off-Zellen enthält.

Zählen Sie dann die Dichte der Neuronen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie das Zellsuspensionsvolumen, das erforderlich ist, um eine Dichte von 250.000 Neuronen pro Milliliter zu erhalten, und fügen Sie es zu einem der beiden konischen Röhrchen hinzu, die 30 Milliliter vollständiges Kulturmedium enthalten, um ein Neuronenplattierungsmedium mit hoher Dichte zu erhalten. Übertragen Sie 1,2 Milliliter dieser Neuronenlösung mit hoher Dichte auf weitere 30 Milliliter vollständiges Kulturmedium, um eine Konzentration von 10.000 Neuronen pro Milliliter zu erhalten, und verwenden Sie diese Lösung, um die Deckgläser mit niedriger Dichte zu säen.

Platzieren Sie bei diesem Verfahren 24-Well-Platten mit geätztem Boden für Neuronen mit hoher Dichte in der Kulturhaube. Entfernen Sie 300 Mikroliter des vorkonditionierten Mediums durch Vakuum und plattieren Sie dann 0,6 Milliliter Zellsuspension mit hoher Dichte bei 250.000 Neuronen pro Milliliter. Legen Sie die beiden anderen 24-Well-Platten mit Deckgläsern in die Kulturhaube.

Entfernen Sie 300 Mikroliter des vorkonditionierten Mediums durch Vakuum, bevor Sie 0,6 Milliliter Zellsuspension niedriger Dichte mit 10.000 Neuronen pro Milliliter auf die Deckgläser aufbringen. Stellen Sie anschließend alle vier 24-Well-Platten wieder in den Inkubator ein und inkubieren Sie zwei Stunden lang. Drehen Sie danach die Deckgläser mit niedriger Dichte mit den anhaftenden Neuronen in die Kultur mit hoher Dichte um und stellen Sie sicher, dass die Neuronen einander zugewandt sind.

stellen Sie die beiden Platten mit Co-Kultur wieder in den Inkubator ein. Füttern Sie die Co-Kulturen mit 300 Mikrolitern frischem Futtermedium bei DIV fünf. Nach dieser Erstfütterung geben Sie jede Woche 300 Mikroliter frisches Futtermedium ohne Cytosin-Arabinosid in jede Vertiefung.

Sollte die Kultur länger als einen Monat aufbewahrt werden, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums nach einem Monat jede Woche durch frisches Futtermedium. Morphologisch sollten sowohl Neuronen mit hoher als auch mit niedriger Dichte bis zu drei Monate gesund aussehen. Hier wird die immunzytochemische Markierung verwendet, um die funktionellen glutamatergen Synapsen aufzudecken, in denen die NMDA-Rezeptor-Untereinheit NR1 und die ApoE-Rezeptor-Untereinheit GluR1 mit Doppelfärbung markiert sind.

Und die funktionellen Synapsen können mit Hilfe von Bild J leicht identifiziert und quantifiziert werden.Neuronen niedriger Dichte werden auch mit Antikörpern gegen den dendritischen Proteinmarker MAP2 in Kombination mit dem axonalen Proteinmarker p-Tau markiert. Diese doppelte Markierung ermöglicht eine eindeutige Unterscheidung von Dendriten und Axonen. Kulturen mit niedriger Dichte können auch erfolgreich mit DNA-Plasmiden transfiziert werden, wobei Calciumphosphat-Methoden verwendet werden, obwohl die Transfektionsrate in späteren Stadien in der Regel sehr niedrig ist.

Diese Abbildung zeigt, dass die EGFP-Transfektion die neuronale Morphologie aufdecken und feine dendritische Dornenstrukturen sichtbar machen kann. Als Proof of Concept können Neuronen mit extrem niedriger Dichte unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Bildung von Autapsen fördern. Diese autaptischen Neuronen mit extrem niedriger Dichte, die auf Poly-D-Lysin-beschichteten Mikroinseln gezüchtet wurden, können von den Feeder-Neuronen mit hoher Dichte mit diesem Co-Kulturprotokoll bis über zwei Monate aufrechterhalten werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden am Tag der Zellkultur durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Glasdeckgläser und 24-Well-Plattenböden mit Poly-D-Lysin zu beschichten. Ein einfaches Ätzen der Plattenböden ist ausreichend, um die Hippocampus-Neuronen mit geringer Dichte mechanisch und ernährungsphysiologisch zu unterstützen, damit sie auf den Deckgläsern wachsen können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre embryonale Hippocampus-Neuronen der Maus mit extrem geringer Dichte züchtet, wenn keine gliale Feeder-Schicht vorhanden ist. Hoffentlich können Sie diese Methode für Ihre eigenen experimentellen Zwecke nutzen.