Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von Coxiella burnetii

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine einfache LAMP-Methode mit lyophilisierten Reagenzien zum Nachweis von C.burnetii in Patientenproben zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass für die Lagerung der Reagenzien kein Coaching erforderlich ist. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen, in denen Q-Fieber endemisch ist.

Verfahren wird von Tatiana, einer Technikerin aus unserem Labor, vorgeführt. Ausgehend von der DNA für das Zielgen IS1111a aus C.burnetii RSA493 bestimmen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektralphotometer bei 260 Nanometern. Rechnen Sie die Plasmid-DNA-Konzentration mit den folgenden Berechnungen in die Kopienzahl um, wobei 6330 der Länge und den Basenpaaren des Plasmids entspricht und 34,2 Nanogramm pro Mikroliter die Konzentration des Plasmids ist, wie gerade mit dem Spektralphotometer bestimmt.

Bereiten Sie dann 8- bis 10-fache Serienverdünnungen des Plasmids vor, um die folgende Anzahl von Kopien pro Mikroliter zu erhalten. Um die DNA-Vorlage für die LAMP-Reaktion vorzubereiten, beginnen Sie mit 200 Mikrolitern menschlicher Plasmaproben und extrahieren Sie mit dem DNA-Miniprep-Kit die DNA gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verdünnen Sie die endgültige Probe auf ein Volumen von 20 Mikrolitern.

Bereiten Sie 1 Milliliter 2x LAMP-Reaktionspuffer vor, indem Sie die folgenden Reagenzien kombinieren. Mischen Sie durch Pulswirbeln für 10 Sekunden. Um die Standard-LAMP-Reaktion durchzuführen, mischen Sie in einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen 12,5 Mikroliter 2x LAMP-Puffer, 1,2 Mikroliter Primer-Mix, 1 Mikroliter Bst-DNA-Polymerase und 5,3 Mikroliter Wasser.

Als nächstes fügen Sie 5 Mikroliter DNA zu der 20-Mikroliter-Reaktion hinzu und mischen Sie sie gut, dann inkubieren Sie sie bei 60 Grad Celsius in einem Wasserbad oder Heizblock für 60 Minuten. Beenden Sie nach der Inkubation die Reaktion, indem Sie 5 Mikroliter 10x Gelladepuffer in das Röhrchen geben. Laden Sie dann 5 Mikroliter der Reaktionsprodukte auf ein 2%iges Agarosegel, das mit interkalierender Nukleinsäurefärbung gefärbt ist.

Lassen Sie das Gel in 1x TBE bei 100 Volt für 35 Minuten laufen, dann verwenden Sie UV-Licht, um die Ergebnisse zu visualisieren. Um die LAMP-Reaktion mit rekonstituierten Reagenzien durchzuführen, bereiten Sie 1 Milliliter Rekonstitutionspuffer vor, indem Sie die folgenden Reagenzien kombinieren. Mischen Sie durch Pulswirbeln für 10 Sekunden.

Entfernen Sie anschließend die Röhrchen, die die lyophilisierten Reagenzien enthielten, aus dem versiegelten Aluminiumfolienbeutel. Für Schritt 4.2 ist es sehr wichtig, vor dem Öffnen sicherzustellen, dass der Alufolienbeutel richtig verschlossen ist. Verwenden Sie die Schläuche nicht, wenn der Aluminiumbeutel nicht versiegelt oder beschädigt ist.

Geben Sie 20 Mikroliter Rekonstitutionspuffer in jedes Röhrchen mit den Reagenzien und mischen Sie, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die lyophilisierten Reagenzien vollständig resuspendiert sind. Geben Sie dann 5 Mikroliter DNA-Template zu den rekonstituierten Reagenzien und mischen Sie es gut.

Inkubieren Sie bei 60 Grad Celsius in einem Wasserbad oder Heizblock für 60 Minuten. Um die Reaktion nach der Inkubation zu beenden, fügen Sie 5 Mikroliter 10x Gelladepuffer hinzu und geben Sie dann 5 Mikroliter der Reaktionsprodukte auf ein 2%iges Agarosegel, das mit interkalierender Nukleinsäurefärbung gefärbt ist. Lassen Sie das Gel in 1x TBE-Puffer bei 100 Volt 35 Minuten lang laufen, dann visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht.

Um die LAMP-Reaktion mit Hydroxynaphtholblau oder HNB oder interkalierendem Farbstoff durchzuführen, bereiten Sie 1 Milliliter Rekonstitutionspuffer vor, indem Sie die folgenden Reagenzien kombinieren, die HNB oder einen fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff enthalten. Mischen Sie durch Pulswirbeln für 10 Sekunden. Führen Sie die LAMP-Reaktion wie eben beschrieben durch und verwenden Sie UV-Licht oder das bloße Auge, um die Ergebnisse zu visualisieren.

Um die LAMP-Reaktion mit einem Röhrchenscanner durchzuführen, fügen Sie den rekonstituierten Reagenzien, die den fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff enthalten, 5 Mikroliter DNA hinzu und setzen Sie dann das geschlossene Röhrchen in den Röhrchenscanner ein. Stellen Sie die Inkubationstemperatur auf 60 Grad Celsius ein und messen Sie die Fluoreszenz bei 520 Nanometern für 60 Minuten. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der LAMP-Reaktion an Agarose-Gelen mit frisch hergestellten Reagenzien und lyophilisierten Reagenzien.

Beobachten Sie, wie das lyophilisierte Reagenz seine Aktivität beibehält. LAMP-Reaktionen, die mit beiden Reagenzien vorbereitet wurden, wiesen 25 Kopien des DNA-Templates nach. In dieser Abbildung ist der Nachweis der Reaktionsprodukte mit HNB oder fluoreszierendem interkalierendem Farbstoff in der Reaktion dargestellt.

Die Zugabe von HNB zur Reaktion erzeugt einen visuellen Farbwechsel von violett zu blau, wobei 25, 50 und 100 Kopien der DNA-Vorlage in den Reaktionen vorhanden sind. Darüber hinaus zeigt der Einschluss von fluoreszierendem interkalierendem Farbstoff in die Reaktion ein starkes Fluoreszenzsignal mit UV-Licht, wenn ähnliche DNA-Kopienzahlen vorhanden sind. Hier sind die Ergebnisse der Verwendung des Röhrenscanners zur Überwachung der Fluoreszenzsignale in Echtzeit mit fluoreszierendem Interkalationsfarbstoff dargestellt.

Die Fluoreszenzsignale liegen nach 14, 18, 21 und 23 Minuten über dem Ausgangswert, mit 10^6, 10^4, 10^3 und 100 Kopien des DNA-Templates in den Reaktionen. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in 90 Minuten durchgeführt werden. Nach seiner Entwicklung ebnete dieser Assay den Weg für eine schnelle Diagnose einer Coxiella burnetii-Infektion in Gebieten mit begrenzten Ressourcen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lyophilisierte LAMP-Reagenzien rekonstituiert werden. Vergessen Sie nicht, dass Patientenproben infektiös sein können und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten.