Name: Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von Coxiella burnetii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie eine LAMP-Methode mit lyophilisierten Reagenzien zum Nachweis von Coxiella burnetii in Patientenproben. Diese Technik ermöglicht eine einfache Diagnose von Q-Fieber in ressourcenarmen Regionen.

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Diese Forschung wurde von Naval Medical Research Center, Forschung Arbeitseinheit 6000.RAD1.J.A0310 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und geben nicht unbedingt die offizielle Politik oder Position des Department of the Navy, Department of Defense, oder der US-Regierung widerspiegeln. Wei-Mei Ching ist ein Mitarbeiter der US-Regierung. Diese Arbeit wurde im Rahmen ihrer offiziellen Aufgaben vorbereitet. Titel 17 USC § 105 heißt es: &quot;Der Urheberrechtsschutz unter diesem Titel für jede Arbeit der Regierung der Vereinigten Staaten nicht zur Verfügung steht.&quot; Titel 17 USC §101 definiert eine US-Regierung Arbeit als Arbeit, die durch Militärdienst Mitglied oder Mitarbeiter der US-Regierung als Teil der Person durch Amtspflichten.

1. Bereiten Sie Plasmid-DNA Verdünnungen als Standard für den LAMP-Reaktion <ol><li> Verwenden eines Spektrophotometers die optische Dichte (OD) bei 260 nm zu messen , um das Plasmid (enthaltend Zielgen IS1111a von C. burnetii RSA 493) DNA - Konzentration zu bestimmen. Eine OD 260 von 1 entspricht 50 ug / ul DNA. </li><li> Konvertieren Sie die Menge von Plasmid-DNA in die Kopienzahl. Da die Größe des Plasmids 6330 bp ist, ist das Molekulargewicht dieses Plasmids 4,1 x 10 6 g (6.330 bp x 649 g / bp). Die DNA-Konzentration des Plasmids ist 34,2 ng / &amp; mgr; l (wie in Schritt bestimmt 1.1). 1 &amp; mgr; l dieser DNA - Probe enthält 34,2 ng Plasmid - DNA, zu gleich 5 x 10 9 Kopien (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 6,02 x 10 gx 23) von DNA. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Plasmid - DNA (5 x 10 9 Kopien / ul) und 90 ul Wasser für eine 10-fache Verdünnung einer DNA - Probe von 5 x 10 8 Kopien zu erstellen / ul. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.3 zur Herstellung von DNA - Proben von 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 × 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1 und 5 x 10 0 Kopien / ul. </li></ol> 2. Bereiten Sie DNA-Vorlage von Proben für die LAMP-Reaktion <ol><li> Führen DNA Extraktion aus Humanplasmaproben Kommerzielle DNA Mini Kit nach Herstellerprotokoll. Verwenden Sie eine Gesamtmenge von 200 ul Probe für die Extraktion und Elution extrahierten DNA in einem 20 &amp; mgr; l Volumen. </li></ol> 3. Bereiten Sie 2x LAMP-Reaktionspuffer <ol><li> Mischen Sie 200 ul 10x Pol Buffer, 320 ul 5 M Trimethylglycin, 12 ul 1 M MgSO 4, 280 &amp; mgr; l dNTP - Gemisch (jeweils 10 mM) und 188 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml 2x LAMP - Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden. </li></ol> 4. Führen Sie Standard-LAMP-Reaktion <ol><li> Mix 12,5 ul 2x LAMP - Puffer (wie in Schritt 3 hergestellt; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM KCl, 16 mM MgSO 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% Triton X-100, 1,6 M Trimethylglycin, 1.4 mM dNTP - Gemisch), 1,2 &amp; mgr; l Primer - Mix, 1 &amp; mgr; l Bst DNA - Polymerase (8 U / ul) und 5,3 ul Wasser Reaktionsmischung (20 ul) in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen zu bilden. </li><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l DNA (aus Schritt 1 oder 2) in die 20 &amp; mgr; l Reaktionsgemisch und gut mischen. </li><li> Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert. Dies ist die optimale Reaktionstemperatur zuvor bestimmt. </li><li> In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden. </li><li> Last 5 &amp; mgr; l Reaktionsprodukte zu einem 2% Agarosegel, gefärbt mit stain Nukleinsäure interkalierende. </li><li> Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer. </li><li> Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht. </li></ol> 5. Führen Sie LAMP Reaktion mit RekonstituiertesReagenzien <ol><li> Mischen Sie 125 ul von 10x Pol Puffer, 200 &amp; mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO 4, 667,5 ul Wasser zur Herstellung von 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie Rohre, die die lyophilisierten Reagenzien aus dem versiegelten Aluminiumfolienbeutel enthalten. Sie nicht die Rohre verwenden, wenn die Aluminiumfolienbeutel nicht abgedichtet ist, oder wenn es beschädigt ist. </li><li> In 20 ul Rekonstitution Puffer in jedes Röhrchen lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. </li><li> Mischen durch Pipettieren Puffer nach oben und unten 5-mal. Werfen Sie einen Blick um sicherzustellen, dass die lyophilisierten Reagenzien komplett neu aufgehängt sind. Das weiße Pulver sollte in der Röhre verschwinden. </li><li> In 5 ul DNA-Template (aus Schritt 1 oder 2) zu den rekonstituierten Reagenzien und gut mischen. </li><li> Schließen Rohr und für 60 min in einem Wasserbad oder Heizblock bei 60 ° C inkubiert. </li><li> In 5 ul 10x Gelladepuffer, um die Reaktion zu beenden. </li><li> Last 5 ul ReaktionsProdukte einem 2% Agarosegel, gefärbt mit Nukleinsäure interkalierende stain. </li><li> Führen Gel bei 100 V für 35 min in 1x TBE-Puffer. </li><li> Visualisieren Sie die Ergebnisse durch UV-Licht. </li></ol> 6. Führen Sie LAMP Reaktion mit Rekonstitution Puffer, der HNB oder Fluorescent interkalierende Farbstoff <ol><li> Mischungs 125 ul 10fach Pol Puffer, 200 &amp; mgr; l von 5 M Trimethylglycin, 7,5 ul 1 M MgSO 4, 7,5 ul 20 mM HNB (oder 12,5 &amp; mgr; l 100x fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff) und 660 ul (oder 655 &amp; mgr; l) Wasser machen 1 ml Rekonstitution Puffer. Mix von Puls-Verwirbelung für 10 Sekunden. </li><li> Verwenden Sie das aufgelöste Puffer in Abschnitt 6 hergestellt, die Schritte 5.2 zu wiederholen - 5.6. </li><li> Visualisieren Sie die Ergebnisse mit dem bloßen Auge (Reaktion, die HNB) oder einem UV-Licht (Reaktion fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff enthält). </li></ol> Führen 7. Echtzeit-LAMP-Reaktion mit Rohr Scanner <ol><li> In 5 ul DNA an die reconstituted Reagenzien fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff, in der Nähe Rohr und legen Sie es auf das Rohr Scanner enthält. </li><li> Eingestellt Inkubationstemperatur auf 60 ° C. Messen der Fluoreszenz bei 520 nm für 60 min. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bisher haben wir eine empfindliche und spezifische LAMP - Targeting - Assay das Einsatzelement IS1111a 14. Das IS1111 Element wurde ausgewählt , weil es stark unter den verschiedenen Stämmen von C. konserviert burnetii und die hohe Anzahl der Kopien (7-110) in den Bakterien (Klee 2006). Unsere Ergebnisse zeigten , dass LAMP können etwa 25 Kopien des IS1111 Element erkennen, die so wenig wie eine chromosomale Kopie von Coxiella DNA korrelieren. In dieser St...

Die kleine Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q - Fiebers, das ein weltweit Zoonose ist. Durch den weltweiten Vertrieb von Q - Fieber und die hohe Infektiosität von C. burnetii, US - Militär- und Zivilpersonal im Ausland im Einsatz sind in Gefahr, in den Endemiegebieten infiziert. Q-Fieber manifestiert sich in zwei Formen: akute und chronische Infektionen. Akute Q-Fieber präsentiert sich mit grippeähnlichen Symptomen, Hepatitis oder Pneumonie, und ist in der Regel eine selbstlimitierend Krankheit mit einer niedrigen Sterblichkeit. Chronische Q-Fieber, während weniger verbreitet, führt oft zu Endokarditis, die eine viel höhere Mortalitätsrate hat , wenn 1,2 unbehandelt. Daher ist eine frühzeitige Diagnose führen eine geeignete Behandlung für die Patientenversorgung kritisch ist. Polymerase - Kettenreaktion (PCR) und quantitative Echtzeit - PCR (qPCR) Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinische Proben 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Beide PCR und qPCR sind teuer und oft nicht ohne weiteres verfügbar in ressourcenbeschränkte Bereiche für die Routinearbeit. Ursprünglich von Notomi 6 beschrieben, Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) bietet eine alternative DNA - Verstärkungsverfahren. LAMP verwendet Bst DNA - Polymerase zusammen mit speziell entwickelten Primer - Sets Verschiebung DNA Synthese Strang, der mindestens sechs unabhängigen Regionen des Zielgens zu erkennen. Der signifikanteste Vorteil ist, dass LAMP-Amplifikation unter isothermischen Bedingungen auftritt. Daher ist nur ein Wasserbad, Heizblock oder ein Inkubator ist nicht erforderlich. Dieses Verfahren wurde verwendet 7-9 verschiedene rickettsial Pathogene zu erkennen. Visualisierung von amplifizierte DNA-Produkte durch Gelelektrophorese ist die genaueste Methode, die wahren Positiven von Fehlalarme aufgrund unspezifischer Amplifikation unterscheiden kann. Jedoch sind die in der Gelelektrophorese angewandten Verfahren nicht praktikabel für begrenzten Ressource-areas. Es wurden verschiedene alternative Verfahren entwickelt, um die Reaktionsprodukte zu detektieren. Diese alternativen, wie Trübung , abgeleitet von Magnesiumpyrophosphat Formation 10 oder unter Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff unter UV - Licht visualisiert werden 11,12 sind günstiger als ein Gel läuft. Die LAMP - Reagenzien waren einen Monat lang stabil , wenn sie bei 25 ° C und 37 ° C gelagert, die sind Umgebungstemperaturen in tropischen und subtropischen Ländern , in denen Q - Fieber endemisch 13 ist. Ein LAMP - Assay wurde in unserem Labor entwickelt , um das Vorhandensein von C. zu erkennen burnetii in Plasmaproben 14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Herstellung der LAMP Reaktionsmischung aus dem lyophilisierten Reagenzien. Die lyophilisierten Reagenzien sind stabil für einen Monat, wenn bei RT gelagert. Wenn sie mit einem einfachen Visualisierungsverfahren kombiniert werden , ist dies eine ideale Methode zum Nachweis C. verwenden burnetii in einer begrenzten Ressource-Einstellung.

<table><tbody><tr><td>LAMP-Primer</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>10 nmol, salzfrei</td><td>Sequenz designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>10x Thermopol-Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mischung</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>je 10 mM</td></tr><tr><td>Betain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycin</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>Gel-Ladepuffer</td></tr><tr><td>SYBR grün</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10.000x, visualisieren Sie Produkte in Röhrchen</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10.000x, visualisieren Sie Produkte in Gelen</td></tr><tr><td>Lyophilisierte Reagenzien</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blau</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant Röhrchenscanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Echtzeit-Detektion</td></tr></tbody></table>

die entwicklung der lyophilisierte loop-mediated isothermal amplification reagenzien zum nachweis von<em&gt; coxiella burnetii</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, der Agent Q - Fieber verursacht, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium. PCR - basierten diagnostischen Assays wurden zum Nachweis von C. entwickelt burnetii DNA in Zellkulturen und klinischen Proben. PCR erfordert spezielle Ausrüstung und umfassende Schulung von Endanwendern, und daher ist es für Routinearbeiten vor allem in einem ressourcenbeschränkte Bereich nicht geeignet. Wir haben eine loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) Assay entwickelt , um die Anwesenheit von C. nachzuweisen burnetii in Patientenproben. Dieses Verfahren wird bei einer einzigen Temperatur etwa 60 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses LAMP-Test ist sehr ähnlich wie PCR mit einer Nachweisgrenze von etwa 25 Kopien pro Reaktion. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung der Reaktion lyophilisierten Reagenzien und Visualisierung der Ergebnisse mit hydroxynaphthol blau (HNB) oder einer UV-Lampe mit fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion verwendet wird. Die LAMP-Reagenzien waren lyophilized und bei Raumtemperatur (RT) einen Monat lang ohne Verlust der Detektionsempfindlichkeit gespeichert. Diese LAMP-Test ist besonders robust, da die Reaktionsgemischaufbereitung nicht komplexe Schritte beinhaltet. Diese Methode ist ideal für den Einsatz in begrenzten Ressource-Einstellungen, wo Q-Fieber endemisch ist.

Die lyophilisierten LAMP Reagenzien innerhalb der 0,2 - ml - Röhrchen enthält Bst DNA - Polymerase, Primer und dNTPs. 20 ul Rekonstitution Puffer wird verwendet , die lyophilisierten Reagenzien erneut zu suspendieren. Abbildung 1 zeigt die LAMP Reaktion führt auf Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und gefriergetrocknet Reagenzien. Das gefriergetrocknete Reagenz verringert nicht seine Aktivität. LAMP Reaktionen von beiden Reagenzien hergestellt werde...

Wir haben hier eine einfache schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) Methode mit lyophilisierten Reagenzien zum Nachweis von C. burnetii in Patientenproben beschrieben.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine einfache LAMP-Methode unter Verwendung lyophilisierter Reagenzien zur Detektion von C.burnetii in Patientenproben zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass keine besonderen Lagerungsbedingungen für die Reagenzien erforderlich sind. Diese Methode eignet sich ideal für den Einsatz in ressourcenbegrenzten Gebieten, in denen Q-Fieber endemisch vorkommt.Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Tatiana, eine Technikerin aus unserem Labor. Beginnen Sie mit der DNA für das Zielgen IS1111a aus C.burnetii RSA493 und bestimmen Sie die Plasmidkonzentration mithilfe eines Spektrophotometers bei 260 Nanometern. Wandeln Sie die Plasmid-DNA-Konzentration unter Verwendung der folgenden Berechnungen in die Kopienzahl um, wobei 6330 der Länge und Anzahl der Basenpaare des Plasmids entspricht und 34,2 Nanogramm pro Mikroliter die Konzentration des Plasmids ist, wie gerade mithilfe des Spektrophotometers ermittelt.Bereiten Sie anschließend 8- bis 10-fache serielle Verdünnungen des Plasmids vor, um die folgende Anzahl an Kopien pro Mikroliter zu erhalten. Um die DNA-Vorlage für die LAMP-Reaktion vorzubereiten, begin

the-development-lyophilized-loop-mediated-isothermal-amplification

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Forschung

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Domesle, K. J. et al. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation zur Screening von Salmonellen in tierischen Lebensmitteln und zur Bestätigung von Salmonellen durch Kulturisolation.  J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert die loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-Technik zur Erkennung eines Zielbakteriengens, indem DNA bei konstanter Temperatur amplifiziert wird. Die Reaktionsmischung wird durch Zugabe eines isothermen Master-Mixes, spezifischer Primer für das Zielgen...

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zur Nachweisung bakterieller Genen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Beurteilung des intrazellulären Wachstums von GFP-markierten Coxiella-Mutanten in kultivierten Epithelzellen. Der mutierte Phänotyp wird mittels Immunfärbung und Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, was die Untersuchung der Wirkung der Mutation auf das intrazelluläre Wachstum ermöglicht.

Bewertung des intrazellulären Wachstums von Coxiella-Mutanten in eukaryotischen Zellen

Die Diagnose einer Eimeria-Infektion bei Hühnern ist nach wie vor anspruchsvoll. Parasitenmorphologie- und wirtspathologische Ansätze sind in der Regel nicht schlüssig, während molekulare Ansätze, die auf PCR basieren, sich in Bezug auf Kosten und Fachwissen als anspruchsvoll erwiesen haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) als einfache molekulare Diagnostik für Eimer-Infektionen zu etablieren.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Bereitgestellt wird ein Protokoll zur Entwicklung eines Echtzeit-Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsassays zur Quantifizierung der Anfangskonzentration von DNA-Proben unter Verwendung eines Thermocyclers oder eines Mikroskops und einer Tischheizung. Ebenfalls beschrieben wird die Entwicklung einer internen Positivkontrolle. Skripte werden für die Verarbeitung von Echtzeit-Fluoreszenzrohdaten bereitgestellt.

Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer kleinen, Ready-to-Use Kassette, die für die visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Einzeltest können, die einfach angewendet werden zu bedienen ist. Bei diesem Ansatz wurde ein Kapillar Array für multiplex und hocheffiziente Nachweis von GVO Ziele verwendet.

Visuelle Erkennung von mehreren Nukleinsäuren in einem Kapillar Array

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein isothermer Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der ein breites Interesse am Nachweisvon Erreger geweckt hat. Hier präsentieren wir ein multilaboriertes Salmonella LAMP-Protokoll als schnelle, zuverlässige und robuste Methode zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und zur Bestätigung mutmaßlicher Salmonellen aus der Kulturisolierung.

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Schritte zur Herstellung einer gebrauchsfertigen qPCR für den T. cruzi-DNA-Nachweis, die auf das Reaktionsgefäß vorgeladen und mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden kann.

Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen

Verschiedene bakterielle Krankheitserreger können Atemwegsinfektionen verursachen und zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen, wenn sie nicht genau erkannt und sofort behandelt werden. Der schnelle und genaue Nachweis dieser Erreger durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation ermöglicht ein effektives Management und eine effektive Kontrolle von Atemwegsinfektionen im klinischen Umfeld.

Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation

Lernen Sie eine LAMP-Methode mit lyophilisierten Reagenzien zum Nachweis von Coxiella burnetii in Patientenproben. Diese Technik ermöglicht eine einfache Diagnose von Q-Fieber in ressourcenarmen Regionen.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von

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