Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine einfache LAMP-Methode unter Verwendung lyophilisierter Reagenzien zur Detektion von C.burnetii in Patientenproben zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass keine besonderen Lagerungsbedingungen für die Reagenzien erforderlich sind. Diese Methode eignet sich ideal für den Einsatz in ressourcenbegrenzten Gebieten, in denen Q-Fieber endemisch vorkommt.

Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Tatiana, eine Technikerin aus unserem Labor. Beginnen Sie mit der DNA für das Zielgen IS1111a aus C.burnetii RSA493 und bestimmen Sie die Plasmidkonzentration mithilfe eines Spektrophotometers bei 260 Nanometern. Wandeln Sie die Plasmid-DNA-Konzentration unter Verwendung der folgenden Berechnungen in die Kopienzahl um, wobei 6330 der Länge und Anzahl der Basenpaare des Plasmids entspricht und 34,2 Nanogramm pro Mikroliter die Konzentration des Plasmids ist, wie gerade mithilfe des Spektrophotometers ermittelt.

Bereiten Sie anschließend 8- bis 10-fache serielle Verdünnungen des Plasmids vor, um die folgende Anzahl an Kopien pro Mikroliter zu erhalten. Um die DNA-Vorlage für die LAMP-Reaktion vorzubereiten, beginnen Sie mit 200 Mikrolitern menschlicher Plasma-Proben und extrahieren mithilfe des DNA-Minipräp-Kit die DNA gemäß der Herstellerprotokolle. Verdünnen Sie die endgültige Probe auf ein Volumen von 20 Mikrolitern.

1 Milliliter 2x LAMP-Reaktionspuffer durch Kombination der folgenden Reagenzien herstellen. Durch kurzes Vortexen für 10 Sekunden mischen. Für die Standard-LAMP-Reaktion in einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen 12,5 Mikroliter 2x LAMP-Puffer, 1,2 Mikroliter Primer-Mix, 1 Mikroliter Bst-DNA-Polymerase und 5,3 Mikroliter Wasser mischen.

Fügen Sie als Nächstes 5 µL DNA der 20 µL-Reaktion hinzu und mischen Sie gründlich, anschließend inkubieren Sie die Probe 60 Minuten lang bei 60 °C in einem Wasserbad oder Heizblock. Beenden Sie die Reaktion nach der Inkubation, indem Sie 5 µL 10x-Gel-Puffer zu dem Reaktionsansatz hinzufügen. Laden Sie dann 5 µL der Reaktionsprodukte auf ein mit interkalierendem Nukleinsäurefarbstoff gefärbtes 2 %ige Agarosegel auf.

Laufen Sie das Gel bei 100 Volt in 1x TBE für 35 Minuten, anschließend visualisieren Sie die Ergebnisse mittels UV-Licht. Um die LAMP-Reaktion mit rekonstituierten Reagenzien durchzuführen, bereiten Sie 1 Milliliter Rekonstitutionspuffer zu, indem Sie die folgenden Reagenzien kombinieren. Mischen Sie durch kurzes Vortexen für 10 Sekunden.

Entfernen Sie anschließend die Röhrchen, die die lyophilisierten Reagenzien enthielten, aus der versiegelten Aluminiumfolientüte. Für Schritt 4.2 ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass die Aluminiumfolientüte vor dem Öffnen ordnungsgemäß verschlossen ist. Verwenden Sie die Röhrchen nicht, wenn die Aluminiumtüte nicht verschlossen oder beschädigt ist.

20 µL Rekonstitutionspuffer zu jedem Reagenzienröhrchen hinzufügen und durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Sicherstellen, dass die lyophilisierten Reagenzien vollständig resuspendiert sind. Anschließend 5 µL DNA-Template zu den rekonstituierten Reagenzien geben und gut mischen.

Ansatz 60 Minuten bei 60 Grad Celsius in einem Wasserbad oder Heizblock inkubieren. Um die Reaktion nach der Inkubation zu beenden, 5 µL 10x Gel-Puffer hinzufügen und anschließend 5 µL der Reaktionsprodukte auf ein 2 %ige Agarosegel, das mit einem interkalierenden Nukleinsäurefarbstoff angefärbt wurde, auftragen. Das Gel 35 Minuten lang bei 100 Volt in 1x TBE-Puffer laufen lassen und die Ergebnisse anschließend unter UV-Licht sichtbar machen.

Um die LAMP-Reaktion mit Hydroxynaphtholblau oder HNB oder interkalierendem Farbstoff durchzuführen, bereiten Sie 1 Milliliter Rekonstitutionspuffer zu, indem Sie die folgenden Reagenzien, die HNB oder einen fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff enthalten, kombinieren. Mischen Sie durch kurzes Wirbeln für 10 Sekunden. Führen Sie die LAMP-Reaktion wie gerade beschrieben durch und visualisieren Sie die Ergebnisse mittels UV-Licht oder mit bloßem Auge.

Um die LAMP-Reaktion mit einem Röhrenscanner durchzuführen, geben Sie 5 Mikroliter DNA zu den rekonstituierten Reagenzien, die den fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff enthalten, und setzen anschließend die verschlossene Röhre in den Röhrenscanner ein. Stellen Sie die Inkubationstemperatur auf 60 Grad Celsius ein und messen Sie die Fluoreszenz bei 520 Nanometern über einen Zeitraum von 60 Minuten. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der LAMP-Reaktion in Agarosegelen mit frisch zubereiteten Reagenzien und lyophilisierten Reagenzien.

Beobachten Sie, dass das lyophilisierte Reagenz seine Aktivität beibehält. Mit beiden Reagenzien vorbereitete LAMP-Reaktionen detektierten 25 Kopien der DNA-Vorlage. In dieser Abbildung ist der Nachweis der Reaktionsprodukte mit HNB oder einem fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff in der Reaktion dargestellt.

Die Zugabe von HNB zur Reaktion führt zu einer sichtbaren Farbänderung von lila nach blau bei Vorhandensein von 25, 50 und 100 Kopien der DNA-Vorlage in den Reaktionen. Zusätzlich zeigt die Zugabe eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs ein starkes Fluoreszenzsignal unter UV-Licht bei ähnlichen DNA-Kopienzahlen. Dargestellt sind hier die Ergebnisse der Verwendung des Röhrenscanners zur Echtzeitüberwachung der Fluoreszenzsignale mit fluoreszierendem interkalierendem Farbstoff.

Die fluoreszierenden Signale liegen nach 14, 18, 21 und 23 Minuten über der Grundlinie, mit 10^6, 10^4, 10^3 bzw. 100 Kopien der DNA-Vorlage in den Reaktionen. Wenn der Ablauf einmal beherrscht ist, kann er innerhalb von 90 Minuten durchgeführt werden. Nach seiner Entwicklung ebnete dieser Test den Weg für eine schnelle Diagnose der Coxiella-burnetii-Infektion in ressourcenarmen Gebieten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lyophilisierte LAMP-Reagenzien rekonstituiert werden. Vergessen Sie nicht, dass Patientenproben infektiös sein können und bei der Durchführung dieses Verfahrens stets Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten.