Zirkulierende miRNA-Extraktion: Eine Methode zur Isolierung von miRNA aus Plasmaproben durch organische Extraktion und Anreicherung kleiner RNA

- MicroRNAs oder miRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression regulieren, indem sie mRNA abbauen oder ihre Translation in funktionelle Proteine blockieren. Zirkulierende miRNAs sind potenzielle Krebs-Biomarker und können aus Körperflüssigkeiten wie Plasma extrahiert werden. Mischen Sie zunächst das Plasma mit einer denaturierenden Lösung, die gleichzeitig die Probe homogenisiert und RNA-abbauende Ribonukleasen hemmt.

Mit saurem Phenol-Chloroform behandeln und zentrifugieren, um die Probe in zwei Phasen zu unterteilen, eine untere organische Phase, die DNA und Proteine enthält, und eine obere wässrige Phase, die RNA enthält. Die wässrige Phase wird wiederhergestellt. Fügen Sie absolutes Ethanol hinzu, um RNA aus der Lösung auszufällen.

Bringen Sie die Ethanolkonzentration der Probe auf 25 %, um eine Anfangsbedingung zu schaffen, die für eine große RNA-Trennung förderlich ist. Das Gemisch in eine vormontierte Filterpatrone und Zentrifuge umfüllen. Große RNAs immobilisieren selektiv auf dem Filter, während sich kleinere miRNAs im Filtrat sammeln.

Erhöhen Sie anschließend die Ethanolkonzentration auf 55 %, um die miRNA-Isolierung zu begünstigen. Übertragen Sie das Filtrat in eine neue Filterpatrone und zentrifugieren Sie, um die miRNAs einzufangen. Legen Sie die Kartusche auf ein Auffangröhrchen und fügen Sie einen geeigneten Elutionspuffer hinzu. Zentrifuge, um die miRNAs in das Röhrchen zu eluieren. Im folgenden Protokoll zeigen wir die zirkulierende miRNA-Isolierung aus dem Plasma von Darmkrebspatienten.

Zu Beginn werden 400 Mikroliter der Plasmaprobe in ein RNase-freies 2-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie dann 400 Mikroliter Denaturierungslösung in das Röhrchen. Fügen Sie 4 Mikroliter 1 nanomolaren Spike-in hinzu.

Fügen Sie nach dem Mischen der Lösung 800 Mikroliter saures Phenol-Chloroform hinzu. Die Lösung 60 Sekunden lang vortexen und 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Anschließend wird das in der oberen wässrigen Phase enthaltene Lysat in ein sauberes Röhrchen überführt, wobei darauf zu achten ist, dass die Zwischenphase nicht gestört wird.

Messen Sie das Volumen der zurückgewonnenen wässrigen Phase und fügen Sie dem Lysat 1/3 des Volumens Ethanol hinzu. Setzen Sie dann eine Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen ein. Füllen Sie bis zu 700 Mikroliter des Ethanollysat-Gemischs in die Filterpatrone um. Zentrifugieren Sie die Filterpatrone 30 Sekunden lang bei 10.000 x g.

Messen Sie als Nächstes das Gesamtvolumen des Durchflusses. Geben Sie dann 2/3 des Volumens Ethanol zum Filtrat und mischen Sie es gut. Setzen Sie eine zweite Filterpatrone in ein frisches Auffangröhrchen ein. Übertragen Sie dann bis zu 700 Mikroliter der Probe in die Kartusche und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang bei 10.000 x g, bevor Sie den Durchfluss verwerfen.

Geben Sie 700 Mikroliter microRNA-Waschlösung in die Filterpatrone und zentrifugieren Sie sie mit einem Sammelröhrchen bei 10.000 x g für 15 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Filterpatrone wieder in dasselbe Rohr ein.

Setzen Sie danach die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr ein. Geben Sie dann 100 Mikroliter vorgewärmte Elutionslösung in die Kartusche. Zentrifugieren Sie die Filterpatrone 30 Sekunden lang bei 10.000 x g, um die microRNAs zurückzugewinnen.

• MicroRNAs - Small non-coding RNAs that regulate gene expression.
• Circulating miRNAs - miRNAs in body fluids used as possible cancer biomarkers.
• Denaturing Solution - Homogenizes the sample and inhibits RNA-degrading ribonucleases.
• Acid phenol-chloroform - Used to separate the sample into distinct phases.
• Elution Buffer - A solution added to elute miRNAs into a collection tube.

• Introduce MicroRNAs - Small molecules regulating gene expression (e.g., mirna).
• Key Concepts – Summarize the roles and potential of miRNAs in cancer research (e.g., mirna plasma kit).
• Underlying Mechanisms – miRNAs are isolated using specific procedures (e.g., mirvana isolation kit).
• Connect to Experiment – The study utilizes miRNA isolation from plasma samples.

• What are MicroRNAs and how to extract them (using mirna extraction kits)?
• How does the process of miRNA isolation work (using mirvana paris kit)?
• What is the role of circulating miRNAs in cancer research?

• Practical Applications – miRNAs in diagnostics, research, and treatment (e.g., micro rna isolation).
• Industry Impact – Impacting biotech, healthcare sectors (e.g., s1122-1830).
• Societal Importance – Potential benefits in early disease detection (e.g., miRNA isolation protocol).
• Link to Scientific Advancements – Emergence of advanced extraction kits (e.g., mirna plasma extraction kit).