Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Das übergeordnete Ziel dieser Dissektion langer Knochen und der Isolierung von Knochenmark besteht darin, die langen Knochen schnell und systematisch zu entfernen und das Knochenmark für weitere nachgeschaltete Analysen zu gewinnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Knochenmarkbiologie, Krebsmetastasierung und Immunologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der Dissektionsprozess schnell und standardisiert ist und die Knochenmarkisolierung relativ steril erfolgt. Beginnen Sie damit, die Maus in Rückenlage zu positionieren.

Dann fixieren Sie alle vier Ballen unterhalb des Sprunggelenks und besprühen die Maus mit 70 % Ethanol, wobei die Beine gründlich benetzt werden. Als Nächstes führen Sie einen kleinen Schnitt rechts der Mittellinie im unteren Bauchbereich knapp oberhalb der Hüfte durch und verlängern den Schnitt entlang des Beins über das Sprunggelenk hinaus. Ziehen Sie die Haut zurück.

Danach den am proximalen Ende des Femurs befestigten Quadrizepsmuskel durchtrennen, um die vordere Seite des Oberschenkelknochens freizulegen, und den Muskel mit einer Nadel im 45-Grad-Winkel zur Unterlage vom Bein weg fixieren. Mit der Schere an der Rückseite des Femurs die Hamstringmuskeln vom Kniegelenk abschneiden. Anschließend die Haut und die am proximalen Ende des Femurs befestigten Hamstringmuskeln zurückziehen, um die hintere Seite des Knochens freizulegen, und die Hamstringmuskeln mit einer Nadel im 45-Grad-Winkel vom Bein weg fixieren.

Mit der Pinzette wird das distale Ende des Femurs knapp oberhalb des Kniegelenks erfasst. Anschließend werden die Scherenklingen beidseits des Femurschafts in Richtung Hüftgelenk geführt. Nach Erreichen des Femurkopfs werden die Schere verdreht, wobei die obere Klinge direkt über den Femurkopf bewegt wird, um den Femur zu luxieren.

Fassen Sie nun die Spitze des Femurschafts mit der Pinzette und schneiden Sie das Weichgewebe vom Femurkopf ab, um den Femur aus dem Acetabulum zu lösen. Ziehen Sie dann den gesamten Beinknochen, einschließlich Femur, Knie und Tibia, nach oben und vom Körper weg und schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe und die Muskulatur ab, die das Bein mit der Haut verbinden. Wenn das gesamte Bindegewebe entfernt ist, überstrecken Sie das Sprunggelenk und drehen Sie die Schere wie zuvor gezeigt, um die Tibia zu luxieren.

Greifen Sie das distale Ende der Tibia und achten Sie darauf, die Sehnen nicht zu durchtrennen. Ziehen Sie die Tibia dann nach oben und weg vom Körper und vom Pin-Board. Entfernen Sie anschließend das restliche Bindegewebe, das am langen Knochen am Knie haftet, sowie jegliche zusätzliche Muskulatur oder Bindegewebsanteile, die am Femur und an der Tibia anhängen. Um den langen Knochen für die Isolierung des Knochenmarks vorzubereiten, halten Sie den Femur mit der Patella nach außen gerichtet und dem Femurkopf nach unten zeigend.

Überstrecken Sie das Kniegelenk und drehen Sie die Schere, um die Tibia vom Femur zu lösen. Entfernen Sie anschließend das Bindegewebe, das Femur und Tibia verbindet. Fassen Sie danach den Femur mit der ventralen Seite nach außen und dem Femurkopf nach unten gerichtet und führen Sie die Schere entlang des Femurschafts bis zu den Condylus.

Drehen Sie die Schere vorsichtig hin und her, um die Condyle, die Kniescheibe und die Epiphyse zu entfernen und so die Metaphyse freizulegen. Verwenden Sie dann Pinzette, Schere und Kimwipes, um zusätzliches Muskel- oder Bindegewebe, das am Femur anhaftet, zu entfernen. Fassen Sie anschließend die Tibia mit der vorderen Seite nach außen und dem Knöchelende nach unten gerichtet.

Falls die tibiale Epiphyse intakt ist, führen Sie die Schere entlang des Tibiadiaphysen bis zu den Condylus und drehen die Schere vorsichtig hin und her, um die Condyle und Epiphyse zu entfernen, wodurch die tibiale Metaphyse freigelegt wird. Entfernen Sie anschließend jegliches zusätzliche Muskel- oder Bindegewebe, das an der Tibia anhängt, wie zuvor gezeigt. Um das Knochenmark zu gewinnen, schieben Sie zunächst eine 18-Gauge-Nadel durch den Boden eines 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens.

Bringen Sie dann die langen Knochen mit dem Knieende nach unten in das Röhrchen ein und schließen Sie den Deckel. Stellen Sie das 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15 Sekunden mit mindestens 10.000 × g in einer Mikrozentrifuge. Überprüfen Sie visuell, ob das Knochenmark aus den Knochen herauszentrifugiert wurde.

Die Knochen sollten weiß erscheinen, und ein großes Pellet sollte im größeren Röhrchen sichtbar sein. Entsorgen Sie anschließend die Knochen im 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie das Knochenmark in der geeigneten Lösung für die gewünschte nachgeschaltete Analyse. Diese schnelle Dissektionstechnik eignet sich für eine Reihe nachgeschalteter Analysen, einschließlich der Histomorphometrie und der Histologie.

Tatsächlich, wie durch diese repräsentative histomorphometrische Mikro-CT-3D-Rekonstruktion gezeigt wird, bleiben sowohl der trabekuläre Knochen als auch die kortikale Schale erhalten, wodurch eine genaue Quantifizierung der standardisierten strukturellen Parameter für die Knochenhistomorphometrie ermöglicht wird. In diesem repräsentativen histologischen Schnitt eines H-und-E-gefärbten, formalinfixierten und entkalkten Tibias kann die Erhaltung der Integrität sowohl des verkalkten Knochens als auch des zellulären Knochenmarks für die histologische Analyse beobachtet werden. Darüber hinaus ist das mittels dieses Verfahrens isolierte Knochenmark für zahlreiche nachgeschaltete Anwendungen geeignet, einschließlich der Primärzellkultur von Osteoklasten oder Osteoblasten.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa sieben Minuten von der Dissektion des langen Knochens bis zur Isolierung des Knochenmarks abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Maus so zu positionieren, dass die Dissektion erleichtert wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie FACS oder andere Einzelzellverfahren angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich Veränderungen in den Zellpopulationen des Knochenmarks zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die langen Knochen von Mäusen schnell dissezieren und das Knochenmark durch Zentrifugation isolieren kann.